茶樹RAV基因家族鑒定與分析

田時雨， 張蓓林， 鄭 吟， 呂立堂

(1.貴州農(nóng)業(yè)職業(yè)學院， 貴陽 551400； 2.貴州大學茶學院， 貴陽 550025；3.貴州建設職業(yè)技術學院， 貴陽 551400)

作為植物中重要的抗逆性基因的一種，RAV基因家族對調(diào)控植物基因表達應對環(huán)境逆境脅迫起到了十分重要的作用[1]，具有GmRAV3的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株提高了對高鹽和干旱的抗性[2]，擬南芥過表達AtRAV1的植株也增強了對高鹽和干旱的耐受性[3]，但同時也對植物生長有負調(diào)控作用，導致側根生長受到抑制[4]和開花時間提前的情況[5]。在高鹽和干旱的情況之下AtRAV1和AtRAV2的表達則受到了抑制[4]，而將其轉(zhuǎn)到棉花中則可提高棉花的耐干旱能力[6]。同時RAV基因家族在植物生長發(fā)育過程中也起到了至關重要的作用，可調(diào)控其對于植物激素的應答，如生長素[7]、ABA[8]、乙烯[9]和油菜素內(nèi)酯[10]等。

RAV基因家族是具有B 3和AP 2兩個結構域或只具有B 3結構域的基因家族[2]，其中AP 2位于N-末端[11]，B 3位于C-末端[12]。擬南芥中有13個RAV基因，其中有6個具有AP 2結構域，其他則只具有B 3結構域[13]；大豆中同樣有13個RAV基因，其中僅有5個具有AP 2結構域[14]；番茄中則只有10個RAV基因，其中也只有3個有AP 2結構域[15]?？梢姴煌锓N之間RAV基因家族數(shù)量和具有AP 2結構域的基因數(shù)量有一定的變化。

茶樹(CamelliasinensisL.)原產(chǎn)于我國西南地區(qū)，現(xiàn)廣泛種植于南方各省，是一種極為重要的經(jīng)濟作物。研究茶樹在逆境脅迫下的基因表達，提高其在逆境脅迫下的產(chǎn)量，對我國未來茶葉發(fā)展具有極為重要的意義。而RAV基因家族在植物抗逆和植物生長中起到了非常關鍵的作用。本研究通過茶樹基因組數(shù)據(jù)[16-17]，比對尋找茶樹RAV基因，對其進行鑒定和分析，以期為進一步研究茶樹RAV基因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 茶樹RAV基因家族的鑒定及篩選

茶樹RAV基因組相關數(shù)據(jù)從茶樹(http://tpia.teaplant.org/)數(shù)據(jù)庫中進行下載，從而構建本地數(shù)據(jù)庫，以擬南芥已經(jīng)鑒定出的13個RAV蛋白序列為目標序列，在茶樹蛋白庫中進行BLAST對比，設定閾值為E<1e-5，進而得到假設的茶樹RAV基因，繼而使用鑒定得到的茶樹RAV基因，再在NCBI在線軟件(http://blast.Ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi)上進行BLAST比對。將第二次所得的茶樹RAV基因蛋白序列在NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structre/cdd/wrpsb.cgi)進行保守結構域的鑒定，刪除部分冗雜序列，最終得到茶樹RAV基因。在Expasy(https://web.expasy.org/compute_pi/)上鑒定茶樹RAV蛋白序列的等電點(PI)、分子質(zhì)量和平均親水系數(shù)。

1.2 茶樹RAV基因的亞細胞定位預測

利用(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)對茶樹RAV蛋白進行亞細胞定位預測[18]。

1.3 系統(tǒng)進化樹、基因結構和蛋白質(zhì)保守基序分析

利用進化樹分析軟件MEGA 7使用muscle對擬南芥和茶樹的RAV蛋白進行比對，繼而采用臨近法(neighborjoining,NJ)(Boostrap=1 000)進行系統(tǒng)進化樹的構建。再將茶樹RAV蛋白序列提交至MEME(http://meme-suite.org/)進行保守序列分析，設置為10個motif數(shù)量，motif寬度范圍設置為6～50氨基酸。將茶樹RAV基因的DNA序列在GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)進行基因結構分析[19]。

1.4 茶樹RAV順勢作用元件分析

利用茶樹基因組數(shù)據(jù)庫，截取茶樹RAV基因上游2 000 bp的基因序列，在PlantCare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)中進行順勢作用元件的分析，最后利用GSDS 2.0軟件進行可視化分析。

1.5 茶樹不同組織及脅迫條件下RAV的表達分析

根據(jù)已鑒定的茶樹RAV基因編號，在TPIA(http://tpia.teaplant.org)數(shù)據(jù)庫上下載它們在茶樹不同組織(包括頂芽，嫩葉，成熟葉，老葉，花，莖，根)、鹽脅迫、寒冷脅迫、干旱脅迫和茉莉酸甲酯脅迫的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(TPM值)，對數(shù)據(jù)進行標準化處理，最后再利用TBtools軟件構建熱圖對其進行可視化處理。

2 結果與分析

2.1 CsRAV基因的鑒定及其理化性質(zhì)

根據(jù)擬南芥13個RAV蛋白序列，在茶樹基因組蛋白序列中通過兩次BLAST比對，得到備選基因后，利用SMART、NCBI-CDD等在線網(wǎng)站對備選基因進行保守域結構的驗證，刪除部分冗雜序列，共得到10個CsRAV基因。為便于后續(xù)研究，將其命名為CsRAV1-CsRAV10。CsRAV基因編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)見表1。結果顯示，CsRAV編碼蛋白最短，為287個氨基酸(CsRAV 7)，最長為500個氨基酸殘基(CsRAV 5);CsRAV 1、CsRAV 6、CsRAV 8和CsRAV 10的等電點小于7，屬于酸性蛋白質(zhì)，CsRAV 2、CsRAV 3、CsRAV 4、CsRAV 6、CsRAV 7和CsRAV 9等電點大于7屬于堿性蛋白質(zhì)；分子量最大的是CsRAV 5(54 544.23)，分子量最小的是CsRAV 7(31 732.14)；所有的CsRAV蛋白的平均親水系數(shù)都小于0，說明其均為親水性蛋白；CsRAV蛋白的亞細胞定位除CsRAV 3位于細胞質(zhì)外，其余均位于細胞核。

表1 CsRAV基因家族特性Tlabe 1 Characteristics of CsRAV gene family

2.2 CsRAV系統(tǒng)進化分析

將擬南芥的13個RAV(AtRAV)蛋白與茶樹的10個RAV(CsRAV)蛋白進行多序列比對，并利用臨近法(NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，如圖1，其中CsRAV 5、CsRAV 8和CsRAV 10劃分入Ⅰ亞族；CsRAV 4、CsRAV 6和CsRAV 9劃分入Ⅱ亞族；CsRAV 1、CsRAV 2、CsRAV 3和CsRAV 7劃分入Ⅲ亞族。從系統(tǒng)進化樹中不難發(fā)現(xiàn)AtRAV和CsRAV基因同源性相對較低，暗示了RAV基因的分化可能早于茶樹與擬南芥之間的物種分化。

圖1 RAV基因家族系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of RAV gene family

2.3 CsRAV基因家族染色體定位

根據(jù)茶樹基因組信息，可將CsRAV基因定位于茶樹染色體上(如圖2)。從圖2可以看出，2號染色體上有2個CsRAV基因，4、6、8、10號染色體上各有1個CsRAV基因，其他染色體上沒有發(fā)現(xiàn)CsRAV基因。而CsRAV1、CsRAV3、CsRAV8和CsRAV9無法定位在茶樹染色體上?？赡苁荂sRAV基因在茶樹進化過程中發(fā)生了進化或丟失，從而導致這種基因分布的發(fā)生。

圖2 CsRAV的染色體定位Fig.2 Chromosomal localization of CsRAV

2.4 CsRAV基因保守結構域的分析

CsRAV蛋白保守結構域及motif，其結果如圖3所示，可以看出各亞族之中motif和保守結構域基本一致，其中motif 3和motif 4構成AP 2結構域，CsRAV3、CsRAV4、CsRAV6和CsRAV9具有AP 2保守結構域，其他CsRAV僅具有B 3結構域。

圖3 CsRAV系統(tǒng)進化樹(A)、保守基序(B)和保守結構域(C)Fig.3 Phylogenetic tree, conserved motifs and domains of CsRAV

2.5 CsRAV基因啟動子順勢作用元件分析

提取CsRAV基因上游2 000 bp的啟動子區(qū)域序列，在PlantCARE對其進行分析預測，其結果詳見圖4。結果(圖4)顯示，CsRAV基因啟動子上主要元件有逆境脅迫相應相關元件，如干旱、高鹽逆境脅迫相應元件：MYB、MBS、DRE和LTR；低溫脅迫相應元件：MYC和TCA；抗傷害相應元件：TC-rich除逆境脅迫相應元件外，還有相當?shù)闹参锛に叵鄳畿岳蛩峒柞ハ鄳篊GTCA-motif；赤霉素相應元件：GARE-motif；脫落酸相應元件：ABRE；生長素相應元件：AuxRR和TATC。進一步分析可知，逆境脅迫相應元件如MYB、CGTAC-motif、MYC和LTR等在CsRAV家族中大量富集，說明其在茶樹逆境脅迫響應和調(diào)節(jié)茶樹生長上發(fā)揮重要作用。

圖4 CsRAV基因啟動子順勢作用元件Fig.4 Homeopathic element of CsRAV gene promoter

2.6 CsRAV基因在茶樹不同組織中表達情況

為進一步了解CsRAV在茶樹不同組織的表達情況，從TPIA上下載了茶樹不同組織轉(zhuǎn)錄組的TPM表達數(shù)據(jù)，對數(shù)據(jù)進行標準化處理，并對其結果構建熱圖進行分析研究，其結果詳見圖5。CsRAV在茶樹不同組織的表達情況有很大差別，CsRAV2和CsRAV3(均來自Ⅰ亞族)在茶樹各組織中均不表達；CsRAV6和CsRAV9(均來自Ⅱ亞族)表達量最高，但其在不同組織中表達情況不同，在老葉和果實中表達量最高，而在花中則表達量最低。表明不同的CsRAV基因可能參與調(diào)控茶樹不同階段的生長發(fā)育。

圖5 CsRAV在茶樹不同組織的表達模式Fig.5 Expression patterns of CsRAV in different tissues of tea plant

2.7 CsRAV基因在不同脅迫處理下的表達模式

利用TPIA下載的在不同脅迫條件下轉(zhuǎn)錄組的TMP值，對數(shù)據(jù)進行0-1標準化處理，構建熱圖，其結果如圖6所示，在鹽脅迫條件下(A)，CsRAV8和CsRAV9其表達量持續(xù)上升，在處理72 h后達到最高；而CsRAV1、CsRAV5、CsRAV6、CsRAV7和CsRAV9的表達量則呈先上升后下降的整體趨勢，在48 h后達到最高，而后呈下降趨勢。

在干旱脅迫條件下(B)，CsRAV1、CsRAV6和CsRAV9呈持續(xù)下降趨勢，在處理72 h后達到最低；CsRAV8和CsRAV10表達量呈持續(xù)上升趨勢；而CsRAV5表達量先上升后下降；CsRAV7的表達量則正相反先下降后上升。

在茉莉酸甲酯處理條件下(C)，CsRAV7、CsRAV8和CsRAV10表達量呈持續(xù)下降，在處理48 h后達到最低，而CsRAV5、CsRAV6和CsRAV9的表達量呈先降后升的趨勢，在處理48 h后達到最高；CsRAV1表達量則呈先降后升的整體趨勢。

在寒冷處理條件下(D)，在CA 1條件下CsRAV5、CsRAV7、CsRAV8和CsRAV10被誘導上調(diào)，CsRAV6和CsRAV9則被誘導下調(diào)，而CsRAV1則不受誘導影響；在CA 2條件下，CsRAV1、CsRAV5和CsRAV7被誘導上調(diào)，而CsRAV5、CsRAV9、CsRAV8和CsRAV10則被誘導下調(diào)。其余CsRAV2、CsRAV3和CsRAV4則完全不表達。

3 討 論

本研究通過對茶樹基因族的比對，共找到10個RAV基因，發(fā)現(xiàn)其數(shù)量與其他物種的RAV基因數(shù)量變化不大，如擬南芥13個[13]，大豆13個[14]，番茄10個[15]，煙草6個[20]，棉花10個[21]，雖然各物種之間的RAV基因數(shù)量存在一定的差異，但變化不大，說明RAV基因家族在植物進化過程中相對保守。通過分析CsRAV基因的保守結構域和基序可知，共有4個CsRAV基因具有AP 2結構域，其余6個CsRAV基因僅具有B 3結構域。這有利于幫助確定多基因家族的進化關系[22]，10個CsRAV基因可劃分入3個亞族，其中Ⅰ亞族的3個基因均具有AP 2結構域，通過對基序的進一步部分析，可確定時motif 3和motif 4共同組成AP 2結構域。

注：A為鹽脅迫處理(0，24，48，72 h)；B為干旱脅迫處理(0，24，48，72 h)；C為茉莉酸甲酯處理(0，24，48 h)；D為非馴化ck；最低點，完全馴化CA 1；平均溫度達到10°以上，去馴化CA 2)。 圖6 CsRAV基因在鹽(A)，干旱(B)，茉莉酸甲酯(C)和寒冷冷(D)脅迫下的表達分析 Fig.6 Expression analysis of CsRAV gene under salt, drought, methyl jasmonate and cold stress

RAV基因?qū)τ谥参锟鼓鎇23]和調(diào)控植物生長發(fā)育有著非常重要的作用，通過對CsRAV基因的啟動子分析可知，其順勢作用元件多與抗逆和調(diào)控植物生長相關[24]。其基因表達的分析也側面印證這一結論，CsRAV基因在茶樹不同組織表達情況存在很大差異可知，不同的CsRAV基因在茶樹不同生長發(fā)育階段所起到的作用有所不同，通過抗逆表達可知，在不同脅迫的條件下，各個CsRAV基因的表達變化趨勢也有所區(qū)別，如CsRAV5具有相應寒冷逆境的順勢作用元件MYB[25]，在寒冷脅迫下其表達量呈上升趨勢，說明其可能具有調(diào)節(jié)茶樹寒冷脅迫的能力。

4 結 論

茶樹RAV家族作為一種重要的基因家族，對茶樹生長發(fā)育和抗逆性起到重要作用，本研究通過鑒定分析茶樹RAV基因家族共找到10個茶樹RAV基因家族成員，通過保守結構域和基序確定其基因家族分支劃分，并進一步研究其啟動子上順勢作用元件以及在不同組織和逆境脅迫下的表達情況，發(fā)現(xiàn)不同RAV基因家族成員所起到的作用可能也有所不同，如CsRAV5基因就可在茶樹抗寒中起到一定的作用，進而影響茶樹抗逆性，本研究為下一步繼續(xù)研究CsRAV基因提供理論依據(jù)，以進一步研究茶樹的抗逆調(diào)控和生長發(fā)育。