懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A基因克隆和功能分析

尹明華， 曾淑琴， 曾 熒， 張彩霞， 張慧博， 張麗佳

(1.上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院， 江西 上饒 334001；2.上饒農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新研究院， 江西 上饒 334001；3.上饒市藥食同源植物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江西 上饒 334001；4.上饒市三葉青保育與利用技術(shù)創(chuàng)新中心， 江西 上饒 334001)

三葉青(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)，屬葡萄科崖爬藤屬植物，為我國特有珍稀藥用植物[1]。三葉青具有抗炎、抗病毒、促凋抑瘤、保肝消腫、調(diào)節(jié)人體雙重免疫等作用[2-3]。三葉青一般采用扦插無性繁殖，極易感染煙草花葉病毒[4]。煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)是煙草花葉病毒屬病毒的正鏈RNA病毒類α病毒超群成員，是危害最重的病毒之一，寄主范圍廣泛[5]。病毒增殖涉及多種宿主因子與病毒基因組編碼因子協(xié)同作用[6-8]。為了鑒定煙草病毒高效增殖所必需的寄主因子，Ishikawa等[9-10]和Ohshima等[11]已經(jīng)分離了擬南芥的兩個(gè)獨(dú)立突變體煙草病毒增殖蛋白1(tobamovirus multiplication 1，TOM 1)和煙草病毒增殖蛋白2(tobamovirus multiplication 2，TOM 2)。Tsujimoto等[12]證明擬南芥tom 2-1突變體和ttm 1突變體涉及核基因組的重排，影響兩個(gè)獨(dú)立的基因TOM 2 A和TOM 2 B，這兩個(gè)基因都控制煙草病毒增殖表型。TOM 2 A被證明編碼一種四通道跨膜蛋白，它與自身和TOM 1整合膜蛋白相互作用。Hagiwara等[13]證明擬南芥TOM 1(AtTOM 1)和TOM 2 A(AtTOM 2 A)是煙草病毒細(xì)胞內(nèi)高效增殖所必需的完整膜蛋白?？寺∪~青煙草病毒增殖蛋白2 A基因并對其進(jìn)行功能分析，對研究煙草病毒增殖蛋白2 A基因在三葉青中的表達(dá)和三葉青煙草花葉病毒的增殖具有重要意義。關(guān)于煙草病毒增殖蛋白2 A研究的報(bào)道較少。利用RT-PCR 技術(shù)克隆懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A基因，并采用生物信息學(xué)方法、煙草轉(zhuǎn)基因技術(shù)和實(shí)時(shí)定量 PCR進(jìn)行序列、亞細(xì)胞定位和組織表達(dá)分析，為揭示懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)，為從分子水平調(diào)控懷玉山三葉青煙草花葉病毒增殖提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材 料

懷玉山三葉青2個(gè)栽培種懷玉1號和懷玉2號試管苗。

1.2 方 法

1.2.1總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

用Trizol試劑提取懷玉山三葉青懷玉2號試管苗的總RNA，提取步驟按說明書進(jìn)行，使用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度和完整性。以提取獲得的RNA為模版，按照M-MLV cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。逆轉(zhuǎn)錄引物用Oligo(dT)18 Primer ：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′，具體步驟按說明書進(jìn)行。

1.2.2煙草病毒增殖蛋白2 A基因的克隆

利用轉(zhuǎn)錄組組裝的Unigene序列信息(TRINITY_DN 22922_c0_g 1)，運(yùn)用 Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(F：ATGGCGGCGTGCCGGGGA；R：TCACATTACGATGCAACGGCTCCTT)。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 2 min；(95 ℃ 30 s；60.5 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s)(35個(gè)循環(huán))；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后， 將含有目的基因的條帶與pMD 19-T 載體連接并用熱激法轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH 5 α，經(jīng)鑒定正確的陽性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3煙草病毒增殖蛋白2 A基因的生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)分析采用尹明華等[14]的方法。

1.2.4基因克隆和載體構(gòu)建

以提供的目的基因序列設(shè)計(jì)引物(去掉終止密碼子TAG/TAA/TGA)[CZ-TP 2 A-KpnI -F：GCGGGTCGACGGTACC(此部分為載體同源重組序列)ATGGCGGCGTGCCGGGGWT；CZ-TP 2 A-KpnI -gfpR：TAGACATATGGGTACC(此部分為載體同源重組序列)CATTACGRTGCAACGGCTCC]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(總體積50 μL)包括17 μL ddH2O、25 μL 2×Phanta Max Buffer、1 μL dNTP Mix(10 mmol/L each)、2 μL模板DNA、2 μL引物1(10 μmol/L)、2 μL引物2(10 μmol/L)和1 μL Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymease(1 U/μL)；PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；(95 ℃ 15 s，退火溫度56 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 1 min)×39個(gè)循環(huán)；最后延伸72 ℃，5 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳。將條帶切膠回收，即為目的基因片段。載體構(gòu)建采用尹明華等[14]的方法。

1.2.5煙草葉片亞細(xì)胞定位

煙草葉片亞細(xì)胞定位采用尹明華等[14]的方法。

1.2.6煙草病毒增殖蛋白2 A基因的組織表達(dá)分析

分別取懷玉山三葉青2個(gè)栽培種懷玉1號和懷玉2號試管苗的根、莖、葉RNA 500 ng，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。熒光定量 PCR(qRT-PCR，SYBR Green I)檢測內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。設(shè)計(jì)引物(R：TTCTCCAAGGGCCACGACC；F：CTGCTCAGGCTGCTCAACTTTT)。qRT-PCR 檢測采用20 μL反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 10 s，退火延伸60 ℃ 34 s，95 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)。使用 2-△△Ct法計(jì)算基因表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，并使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗(yàn)煙草病毒增殖蛋白2 A基因組織表達(dá)的差異顯著性(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A基因cDNA序列

通過PCR擴(kuò)增技術(shù)(圖1)，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A基因cDNA總長度為858 bp(圖2)，G+C含量為49.53%，A+T含量為50.47%。

2.2 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A氨基酸序列

Protparam預(yù)測顯示懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A氨基酸序列見圖3。懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A由285個(gè)氨基酸組成，分子量為31 437.53 Da，等電點(diǎn)5.77。帶負(fù)電殘基總數(shù)(Asp+Glu)為25，正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為23。序列的N端和C端均為M(Met)。失穩(wěn)指數(shù)(Ⅱ)為39.51，該蛋白質(zhì)為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

圖1 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A基因PCR擴(kuò)增 Fig.1 PCR amplification of tobamovirus multiplication protein 2 A gene of T. hemsleyanum

2.3 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A親疏水性分析

從圖4可知，高峰值(正值)的區(qū)域表示疏水的區(qū)域，而負(fù)值的“低谷”區(qū)域是親水區(qū)域。疏水性結(jié)果表明，最大疏水值為3.5左右，在該多肽中說明該處的疏水性最強(qiáng)；親水峰最大值為-2.5左右，整個(gè)蛋白質(zhì)表現(xiàn)出高度的親水性，說明該蛋白為親水性蛋白質(zhì)。

2.4 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A二級結(jié)構(gòu)分析

懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測如下：GOR 預(yù)測顯示其二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋 (Alphahelix Hh，28.77)、β - 片層(Extendedstrand Ee，16.14)、無規(guī)則卷曲(Randomcoil Cc，55.09)構(gòu)成(圖5)。從分布位點(diǎn)上來看，C端和N端含無規(guī)則卷曲、β-片層和α-螺旋，且無規(guī)則卷曲、β-片層和α-螺旋散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。

2.5 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A三級結(jié)構(gòu)分析

SWISS-MODEL預(yù)測顯示，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A的三級結(jié)構(gòu)為單體(圖6)。

圖2 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A基因堿基組成Fig.2 Base composition of tobamovirus multiplication protein 2 A gene of T. hemsleyanum

圖3 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A氨基酸序列 Fig.3 Amino acid sequence of tobamovirus multiplication protein 2 A of T. hemsleyanum Diels et Gilg in Huaiyushan

圖4 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A親疏水值分布Fig.4 Distribution of hydrophilic and hydrophobic water values of tobamovirus multiplication protein 2 A of T. hemsleyanum Diels et Gilg in Huaiyushan

注：藍(lán)色代表 α-螺旋；紅色代表β -片層；紫色代表不規(guī)則卷曲。 圖5 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A二級結(jié)構(gòu)各部分的比例 Fig.5 Proportion of the secondary structure of tobamovirus multiplication protein 2 A of T. hemsleyanum Diels et Gilg in Huaiyushan

圖6 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A三級結(jié)構(gòu)Fig.6 The tertiary structure of tobamovirus multiplication protein 2 A of T. hemsleyanum Diels et Gilg in Huaiyushan

2.6 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A亞細(xì)胞定位預(yù)測

采用WoLFPsort在線軟件對懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A基因的表達(dá)部位進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果為：定位于細(xì)胞核中的數(shù)量為6，線粒體中的數(shù)量為6，葉綠體中的數(shù)量為1，細(xì)胞質(zhì)中的數(shù)量為1。表明懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A基因主要存在細(xì)胞核、線粒體、葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中。

2.7 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A系統(tǒng)進(jìn)化分析

從構(gòu)建的進(jìn)化樹(圖7)中可見，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A在進(jìn)化上與硬粒小麥、節(jié)節(jié)麥、烏拉爾圖小麥、大麥、二穗短柄草的親緣關(guān)系較近，尤其是與硬粒小麥未命名蛋白產(chǎn)物在進(jìn)化上具有最高的親緣關(guān)系。

圖7 懷玉山葉青煙草病毒培殖蛋白2 A系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.7 Phylogenetic analysis of tobamovirus multiplication protein 2 A of T. hemsleyanum Diels et Gilg in Huaiyushan

2.8 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A同源蛋白的序列比對信息

懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A同源蛋白的序列比對信息見圖8。

圖8 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A基因氨基酸序列的同源性比較Fig.8 Homology comparison of amino acid sequences of tobamovirus multiplication protein 2 A of T. hemsleyanum Diels et Gilg in Huaiyushan

圖9 煙草病毒增殖蛋白2 A基因菌落PCR電泳圖 Fig.9 Colony PCR electrophoresis of tobacco virus proliferating protein 2 A gene

2.9 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A基因瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建

挑取PCR陽性的轉(zhuǎn)化子搖菌培養(yǎng)提取質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物測序比對結(jié)果顯示，目的基因已插入載體，表達(dá)載體構(gòu)建準(zhǔn)確(圖9)。

2.10 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A亞細(xì)胞定位分析

利用激光共聚焦顯微鏡觀察，融合GFP的煙草病毒增殖蛋白2 A轉(zhuǎn)化煙草葉片只在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核觀察到綠色熒光(圖10)，表明煙草病毒增殖蛋白2 A定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，與WoLFPsort在線軟件預(yù)測結(jié)果基本一致。

圖10 TP 2 A-GFP基因亞細(xì)胞定位Fig.10 Subcellular localization of TP 2 A-GFP gene

2.11 懷玉山三葉青2個(gè)栽培種不同器官中煙草病毒增殖蛋白2 A基因的表達(dá)分析

從圖11可知，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A基因在根、莖、葉中均有表達(dá)，但在不同組織器官的表達(dá)情況差異顯著(圖11)，懷玉2號和懷玉1號均在葉中表達(dá)量最高。

3 討 論

Hagiwara等[13]證明擬南芥TOM 1(AtTOM 1)和TOM 2 A(AtTOM 2 A)是煙草病毒細(xì)胞內(nèi)高效增殖所必需的完整膜蛋白。AtTOM 1與煙草病毒編碼復(fù)制蛋白的螺旋酶結(jié)構(gòu)域多肽和AtTOM 2 A相互作用，AtTOM 1和AtTOM 2 A都是煙草病毒復(fù)制復(fù)合物的組成部分。tobamoviral RNA復(fù)制復(fù)合物的形成發(fā)生在含TOM 1的膜上，并由TOM 2 A促進(jìn)。Tsujimoto等[12]證明擬南芥TOM 2 A(AtTOM 2 A)的ORF編碼一個(gè)280氨基酸的多肽序列，并推導(dǎo)TOM 2 A的氨基酸序列包含幾個(gè)疏水區(qū)域，SOSUI軟件預(yù)測為四通道跨膜蛋白。NCBI BLAST比對的結(jié)果表明，擬南芥TOM 2 A和TOM 2 B與任何已知功能的基因都沒有顯著的同源性。在本試驗(yàn)中，從堿基組成和G+C含量基本平衡來看，G+C的含量越高，基因穩(wěn)定性越高，三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A基因基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，這可能為三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A基因穩(wěn)定遺傳與進(jìn)化提供了保證。從同源性來看，三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A基因TOM 1與硬粒小麥、節(jié)節(jié)麥、烏拉爾圖小麥、大麥、二穗短柄草的同源性較高，說明三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A基因具有保守性。這些保守區(qū)段的發(fā)現(xiàn)將為其他物種新的三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A基因的克隆提供序列依據(jù)。本試驗(yàn)通過軟件預(yù)測懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A主要存在細(xì)胞核、線粒體、葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中；而通過煙草葉片亞細(xì)胞定位分析表明，煙草病毒增殖蛋白2 A定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。兩者結(jié)果基本一致。本試驗(yàn)中，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A基因在根、莖、葉中均有表達(dá)，但在不同組織器官的表達(dá)情況差異顯著，其中懷玉2號和懷玉1號在葉中表達(dá)量最高。表明懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2 A基因主要的表達(dá)位置在葉片。本研究首次從懷玉山三葉青基因組中克隆出煙草病毒增殖蛋白2 A基因，并對克隆的基因序列和其氨基酸序列進(jìn)行了生物信息學(xué)、亞細(xì)胞定位和組織表達(dá)分析，為三葉青煙草花葉病毒增殖的研究補(bǔ)充了基礎(chǔ)資料。

注：每個(gè)品種內(nèi)小寫字母表示0.05水平上的差異性。圖11 懷玉山三葉青2個(gè)栽培種不同器官中煙草病毒增殖蛋白2 A基因相對表達(dá)量分析Fig.11 Relative expression analysis of tobamovirus multiplication protein 2 A in different organs of two cultivars of T. hemsleyanum Diels et Gilg in Huaiyushan