不同貯藏條件對蒙古黃芪種子生理生化及活力的影響

魯海坤， 姜業(yè)成， 隋 昕， 于蕓澤， 于 營， 郭 靖

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所， 吉林 長春 130000；2.吉林省農(nóng)科院資源與環(huán)境研究所， 長春 130000)

蒙古黃芪(AstragalusmongholicusBunge)為豆科多年生草本植物，是中藥黃芪源植物之一。黃芪性微溫味甘，歸肺、脾、腎三經(jīng)，有補氣固表、托毒生肌、利水退腫之功效[1]，是著名的滋補中藥材和傳統(tǒng)大宗出口商品。黃芪藥用歷史悠久，以其為原料生產(chǎn)的中成藥達200多種，還廣泛應(yīng)用于食品、化妝品中?，F(xiàn)代藥理學研究表明，黃芪具有增強免疫功能、強心降壓、抗氧化、抗病毒等作用[2-3]。在預(yù)防新冠肺炎(COVID-19)的中藥處方中，黃芪出現(xiàn)的頻次最高，因而受到關(guān)注[4]。由于野生資源的過度采挖，目前商品黃芪主要來源于人工栽培的蒙古黃芪。種子是蒙古黃芪的繁殖材料和種質(zhì)資源遺傳載體，因在貯藏過程中其活力喪失較快，生產(chǎn)上一般不使用隔年種子。為保證黃芪產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，研究其種子活力喪失機理和適宜貯藏條件尤為重要。

本研究以不同含水量的蒙古黃芪種子為研究對象，通過對不同貯藏條件的種子發(fā)芽率及生理生化指標的測定分析，旨在分析種子活力下降與其生理生化特性的變化關(guān)系，為蒙古黃芪種子常規(guī)貯藏及低溫種質(zhì)庫貯藏提供理論、技術(shù)參考，對于蒙古黃芪種植栽培和種質(zhì)資源保存具有重要意義。

1 材 料

本研究的種子購于河北安國，經(jīng)中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)所郭靖研究員鑒定為蒙古黃芪種子。種子初始含水量為9.8%，發(fā)芽率為89%。

2 方 法

2.1 不同含水量種子的制備

以種子初始含水量(9.8%)為最高含水量，將種子放進變色硅膠干燥器一段時間后，進行含水量的測定，直至得到含水量為6.6%、3.7%的種子，密封于鋁箔袋中備用。

2.2 種子貯藏條件

將不同含水量的種子置于室內(nèi)(20～27 ℃)、短期庫(4±1 ℃，濕度≤45%)、中期庫(-4±1)℃，濕度≤45%、長期庫(-18±1)℃，濕度≤50%內(nèi)貯藏。貯藏時間為2020年4月至2021年3月，共貯藏12個月，每3個月取樣一次，測定種子發(fā)芽指標和生理生化指標。

2.3 種子發(fā)芽測定

種子發(fā)芽測定參照ISTA(1996)方法進行[5]，挑選籽粒飽滿、大小均一的黃芪種子，沿子葉頂端部位切一個小口，采用濾紙發(fā)芽床，將兩層濾紙置于直徑9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿100粒，3次重復。置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)芽，溫度和光照控制為15 ℃/25 ℃，高溫8 h/低溫16 h，高溫時光照[36 mol/(m2·s)]，低溫時黑暗。逐日檢查發(fā)芽種子數(shù)，第7天統(tǒng)計發(fā)芽率。

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。

2.4 抗氧化酶活性測定

2.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)計算和作圖，使用SPSS 17.0軟件進行方差分析和多重比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同貯藏條件對蒙古黃芪種子發(fā)芽率的影響

如圖1所示，隨著貯藏時間延長，不同貯藏條件下的蒙古黃芪種子發(fā)芽率均呈下降趨勢，其中室內(nèi)溫度最高，發(fā)芽率下降最快，而長期庫溫度最低，發(fā)芽率下降最慢，且在同一貯藏條件下高含水量的種子發(fā)芽率下降幅度比低含水量的種子大。

經(jīng)過12個月貯藏后，含水量為9.8%的種子在室內(nèi)、短期庫、中期庫、長期庫條件下的發(fā)芽率分別下降68.7%、55.1%、52.1%、46.4%；含水量為6.6%的種子發(fā)芽率在4種條件下分別下降63.5%、52.3%、50.4%、39.8%；含水量為3.7%的種子發(fā)芽率在4種條件下分別下降59.9%、48.9%、43.1%、29.0%。

3.2 不同貯藏條件對蒙古黃芪種子活性氧含量的影響

注：不同小寫字母表示同一時間點不同貯藏條件之間差異顯著(p<0.05)。下同。圖1 不同貯藏條件對蒙古黃芪種子發(fā)芽率的影響Fig.1 Effects of different storage conditions on the germination rate of A. mongholicus seeds

圖2 不同貯藏條件對蒙古黃芪種子產(chǎn)生速率的影響Fig.2 Effects of different storage conditions on the production rate of A. mongholicus seeds

3.2.2不同貯藏條件對蒙古黃芪種子H2O2含量的影響

如圖3所示，3個含水量的蒙古黃芪種子在0～6個月貯藏期間，不同貯藏條件(室內(nèi)、短期庫、中期庫、長期庫)之間的種子H2O2含量沒有顯著差別(p>0.05)，貯藏第9個月時，長期庫的種子H2O2含量顯著低于其他條件的種子(p<0.05)。

圖3 不同貯藏條件對蒙古黃芪種子H2O2含量的影響Fig.3 Effects of different storage conditions on the H2O2 content of A. mongholicus seeds

貯藏12個月后，含水量為9.8%的種子在4種貯藏條件下的H2O2含量分別增長44.3%、28.1%、15.8%、14.2%；含水量為6.6%的種子H2O2含量在4種條件下分別增長42.3%、36.0%、23.4%、18.8%；含水量為3.7%的種子H2O2含量在4種條件下分別增長34.7%、24.1%、19.2%、13.9%。

室溫貯藏的種子H2O2含量增幅大于其他條件，其中長期庫的種子H2O2含量增幅最小。高含水量的蒙古黃芪種子H2O2含量整體高于低含水量的種子。

3.3 不同貯藏條件對蒙古黃芪種子抗氧化酶活性的影響

3.3.1不同貯藏條件對蒙古黃芪種子SOD活性的影響

如圖4所示，含水量為9.8%和6.6%的種子在室內(nèi)、短期條件下貯藏期間其SOD活性呈先上升后下降趨勢，在中期庫和長期庫條件下貯藏期間其SOD活性整體呈上升趨勢；含水量為3.7%的種子，在室內(nèi)、中期庫和長期庫條件下貯藏其SOD活性整體呈先上升后下降趨勢，在短期庫條件下貯藏其SOD活性呈不斷上升趨勢。且不同含水量的種子在4種條件下貯藏12個月后其SOD活性高于貯藏初始階段的活性，整體呈上升趨勢。其中含水量為9.8%的種子在室內(nèi)、短期庫條件下貯藏前后SOD活性接近，在中期庫和長期庫貯藏后SOD活性有小幅增加(11.1%～13.7%)；含水量為6.6%的種子4種條件下貯藏后SOD活性均有小幅增加(6.9%～16.5%)；含水量為3.7%的種子4種條件下貯藏后SOD活性增幅較大(21.4%～36.1%)

圖4 不同貯藏條件對蒙古黃芪種子SOD活性的影響Fig.4 Effects of different storage conditions on SOD activity of A. mongholicus seeds

3.3.2不同貯藏條件對蒙古黃芪種子APX活性的影響

如圖5所示，不同貯藏條件下的蒙古黃芪種子隨貯藏時間延長，其APX活性總體呈下降趨勢。在室內(nèi)、短期庫、中期庫、長期庫條件下貯藏12個月后，含水量為9.8%的種子APX活性分別下降58.5%、32.1%、24.3%、18.4%；含水量為6.6%的種子APX活性分別下降54.9%、37.5%、32.4%、30.0%；含水量為3.7%的種子APX活性分別下降39.0%、27.1%、16.8%、18.3%。由此可見，低溫貯藏條件(短期庫、中期庫、長期庫)比室內(nèi)貯藏可以更好地保持APX酶活性，且低含水量的種子比高含水的種子APX酶活性高。

圖5 不同貯藏條件對蒙古黃芪種子APX活性的影響Fig.5 Effects of different storage conditions on APX activity of A. mongholicus seeds

3.4 不同貯藏條件對蒙古黃芪種子MDA含量的影響

如圖6所示，蒙古黃芪種子在不同條件下貯藏其MDA含量隨時間延長整體呈上升趨勢。在室內(nèi)、短期庫、中期庫、長期庫條件下貯藏12個月后，含水量為9.8%的種子MDA含量分別上升34.0%、26.1%、21.0%、18.2%；含水量為6.6%的種子MDA含量分別上升21.1%、15.8%、8.1%、6.3%；含水量為3.7%的種子MDA含量分別上升22.5%、17.1%、12.9%、8.0%。含水量為9.8%的種子MDA含量經(jīng)過12個月貯藏后增幅最大，含水量為3.7%的種子次之，含水量為6.6%的種子MDA含量增幅最小，貯藏末期時種子MDA含量隨種子含水量下降而降低。同一含水量同一時期，低溫貯藏條件的蒙古黃芪種子積累的MDA含量要小于室內(nèi)條件貯藏的種子。

圖6 不同貯藏條件對蒙古黃芪種子MDA含量的影響Fig.6 Effects of different storage conditions on the MDA content of A. mongholicus seeds

3.5 不同貯藏條件對蒙古黃芪種子貯藏物質(zhì)含量的影響

3.5.1不同貯藏條件對蒙古黃芪種子可溶性糖含量的影響

如圖7所示，蒙古黃芪種子在室內(nèi)、短期庫、中期庫、長期庫4種條件下貯藏過程中，其可溶性糖含量均整體呈下降趨勢，且前6個月含量變化幅度小。在室內(nèi)、短期庫、中期庫、長期庫條件下貯藏12個月后，含水量為9.8%的種子可溶性糖含量分別下降31.8%、10.8%、9.6%、5.4%；含水量為6.6%的種子可溶性糖含量分別下降25.2%、20.8%、8.2%、4.8%；含水量為3.7%的種子可溶性糖含量分別下降20.9%、17.5%、14.8%、12.8%。貯藏末期，低溫貯藏條件下的蒙古黃芪種子可溶性糖含量高于低溫下的可溶性糖含量，且低含水量的種子可溶性糖含量高于高含水量的種子。

圖7 不同貯藏條件對蒙古黃芪種子可溶性糖含量的影響Fig.7 Effects of different storage conditions on the soluble sugar content of A. mongholicus seeds

3.5.2不同貯藏條件對蒙古黃芪種子可溶性蛋白含量的影響

如圖8所示，不同條件下貯藏的蒙古黃芪種子可溶性蛋白均隨貯藏時間延長而逐漸下降。在室內(nèi)、短期庫、中期庫、長期庫條件下貯藏12個月后，含水量為9.8%的種子可溶性蛋白含量分別下降27.3%、21.0%、19.5%、8.4%；含水量6.6%的種子可溶性蛋白含量分別下降25.6%、24.4%、21.7%、11.5%；含水量為3.7%的種子可溶性蛋白含量分別下降26.3%、23.3%、20.1%、8.1%。貯藏前期(0～3個月)不同貯藏條件下的蒙古黃芪種子可溶性蛋白含量差異不明顯，貯藏后期(9～12個月)不同貯藏條件下的蒙古黃芪種子可溶性蛋白含量差距較大，長期庫條件貯藏的種子可溶性蛋白含量顯著高于其他條件(p<0.05)，室內(nèi)貯藏的種子可溶性蛋白含量最低。含水量為6.6%的種子可溶性蛋白含量在不同條件下貯藏12個月后下降幅度最大，其次為含水量6.6%的種子，含水量為3.7%的種子可溶性蛋白含量下降幅度最小。且貯藏12個月后含水量為3.7%種子的可溶性蛋白含量要高于含水量為9.8%的種子，含水量6.6%種子居中。

圖8 不同貯藏條件對蒙古黃芪種子可溶性蛋白含量的影響Fig.8 Effects of different storage conditions on the soluble protein content of A. mongholicus seeds

4 討 論

種子自發(fā)育成熟后就會經(jīng)歷自然老化，但適宜的貯藏條件可以延緩種子活力喪失的過程。種子含水量和貯藏溫度是影響種子活力的兩大影響因素。通常情況下種子貯藏時間越長其活力越低，而其活力喪失快慢取決于種子的含水量以及貯藏溫度。種子含水量和貯藏溫度有協(xié)同作用，在同一含水量條件下溫度越高活力喪失越快，同樣在同一溫度下，含水量越高種子活力喪失越快。因此，在種子保存時一般采用低溫低濕條件。

4.1 不同貯藏條件對蒙古黃芪種子活力的影響

本研究中蒙古黃芪種子貯藏期間其活力不斷降低，貯藏12個月后種子活力下降幅度較大。其中在室內(nèi)貯藏條件下，3個含水量的種子發(fā)芽率下降幅度都在50%以上，而低溫貯藏條件的種子活力下降幅度較小，其中以長期庫(-18 ℃)保存的種子發(fā)芽率最高，說明低溫延緩了種子老化的速度。貯藏12個月后同一溫度條件下，低含水量種子的發(fā)芽率高于高含水量的種子，說明含水量是種子貯藏過程中的重要影響因素，蒙古黃芪種子貯藏時含水量(3.7%)比含水量為6.6%和9.8%更有利于種子活力的保持，與李吟平等[8]在黃精種子貯藏研究中結(jié)果一致。

4.2 不同貯藏條件對蒙古黃芪種子活性氧含量的影響

4.3 不同貯藏條件對蒙古黃芪種子抗氧化酶活性的影響

本研究中，SOD在蒙古黃芪種子貯藏過程中呈上升趨勢，與燕麥(白燕7號)種子貯藏結(jié)果研究一致[14]，說明SOD在種子貯藏過程中持續(xù)發(fā)揮著清除自由基的重要作用。蒙古黃芪種子貯藏過程中APX活性表現(xiàn)為隨時間延長呈不斷下降趨勢，同時發(fā)芽率也逐漸降低，說明活性氧積累導致了種子活力的喪失。同等條件下，貯藏溫度越高APX活性越低，含水量越低種子APX酶活性越高，與水稻貯藏研究結(jié)果相似[15]。

4.4 不同貯藏條件對蒙古黃芪種子MDA含量的影響

種子老化過程中，體內(nèi)活性氧積累隨著貯藏時間延長，活性氧脅迫引起的膜質(zhì)過氧化作用加劇，其產(chǎn)物如MDA等含量不斷上升，MDA可以與核酸蛋白質(zhì)等發(fā)生反應(yīng)，導致這些大分子交聯(lián)聚合，細胞受毒害程度加深[16]。本研究中，不同含水量和不同貯藏條件的種子隨著貯藏時間延長，MDA含量均逐漸升高，這與細辛[17]和白鮮、芍藥[18]貯藏研究結(jié)果一致。

4.5 不同貯藏條件對蒙古黃芪種子貯藏物質(zhì)含量的影響

可溶性糖和可溶性蛋白是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)價物質(zhì)，且能為植物生長發(fā)育提供必需的能量，種子老化過程中二者一般呈先上升再下降趨勢，貯藏時間越長下降幅度越大。陳星可[19]在多花木蘭種子貯藏研究中發(fā)現(xiàn)，其種子可溶性糖在貯藏4～9個月時呈上升趨勢，而貯藏9～12個月時呈下降趨勢。

本研究中，貯藏6～12個月時可溶性糖呈明顯下降趨勢，可能是由于貯藏時間延長，可溶性糖作為呼吸底物被消耗掉，導致細胞內(nèi)可溶性糖含量減少，而且貯藏后高含水量種子的可溶性糖含量低于低含水量，這可能是由于種子含水量高呼吸作用強，消耗的呼吸底物更多有關(guān)[20]。蛋白質(zhì)是維持細胞功能和結(jié)構(gòu)的重要物質(zhì)，貯藏蛋白與種子活力密切相關(guān)，一般情況下認為低活力的種子，其蛋白質(zhì)合成能力下降，且蛋白和酶結(jié)構(gòu)被破壞。本研究表明，蒙古黃芪種子貯藏過程中，可溶性蛋白不斷下降，與Demirkaya M等[21]研究結(jié)果一致。

5 結(jié) 論

本研究將3種含水量的蒙古黃芪種子貯藏在4種不同溫度條件下12個月，貯藏過程中每隔3個月測定種子的發(fā)芽指標及生理生化指標，分析不同含水量及貯藏條件對種子活力的影響，結(jié)果表明，低含水量且低溫貯藏的種子，其在貯藏過程中產(chǎn)生的活性氧更少，抗氧化酶活性更高，積累的有毒物質(zhì)少，貯藏物質(zhì)損失小，種子活力更高，發(fā)芽率更高。本研究中蒙古黃芪種子貯藏最適條件為：含水量為3.7%、溫度為-18 ℃。