EMS處理對(duì)尾葉紫薇種子萌發(fā)的影響及半致死劑量的研究

續(xù) 言， 王景蕓， 吳宜靜， 張一鳴， 朱梓寧， 蔡 明， 潘會(huì)堂， 張啟翔

(北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院， 北京 100083)

紫薇(Lagerstroemiaindica)是千屈菜科紫薇屬的重要木本花卉，為我國原產(chǎn)樹種，有較為悠久的栽培歷史，自唐代就被作為觀賞花木栽培。紫薇屬植物在夏季少花季節(jié)開花，花色豐富、花期長(zhǎng)達(dá)3個(gè)多月，是良好的園林綠化樹種[1]。花香是園林植物重要的觀賞性狀之一，但有色少香是紫薇觀賞性狀的一個(gè)缺憾。尾葉紫薇(L.caudata)是紫薇屬中具有明顯花香的品種，常被用作香花育種的重要親本。但尾葉紫薇為小喬木，花色單一，花徑小，且尾葉紫薇與其他紫薇品種的雜交后代香味減弱。因此，仍需通過多種育種手段選育綜合性狀優(yōu)良的香花紫薇新品種。

化學(xué)誘變育種是利用化學(xué)藥劑改變植物的遺傳物質(zhì)，并將優(yōu)良的突變材料培育成為新品種的育種方法[2]。甲基黃酸乙酯(EMS)誘變劑是化學(xué)誘變劑中烷化劑的典型代表，具有高效低毒，可誘導(dǎo)高密度的系列等位基因點(diǎn)突變的特點(diǎn)，被公認(rèn)為世界上最有效和廣泛使用的化學(xué)誘變劑之一。利用EMS誘變技術(shù)已經(jīng)成功構(gòu)建了非洲菊[3]、菊苣[4]、觀賞辣椒[5]、長(zhǎng)春花[6]、春蘭[7]、大花萱草[8]、旱柳[9]、木槿[10]等觀賞植物的突變體庫。

紫薇EMS誘變開始于美國，1998年Whitcomb利用EMS技術(shù)誘導(dǎo)，獲得了顏色鮮紅、復(fù)色花及可持續(xù)開花等8個(gè)各具特色的優(yōu)良紫薇品種[11]。國內(nèi)對(duì)紫薇的EMS誘變育種研究開始較晚，伍漢斌等[12]以南紫薇種子為材料，用不同濃度EMS溶液對(duì)南紫薇種子進(jìn)行處理，研究了EMS處理對(duì)紫薇種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響，得到EMS誘變紫薇種子的半致死濃度為3%處理6 h。

本研究用EMS對(duì)尾葉紫薇的成熟種子進(jìn)行處理，研究在不同處理濃度和時(shí)間下EMS對(duì)尾葉紫薇種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響，篩選EMS誘變尾葉紫薇的最佳條件，為香花紫薇優(yōu)良品種的選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)材料為尾葉紫薇成熟種子，2020年8月采摘于北京市昌平區(qū)國家花卉工程中心小湯山基地。EMS誘變劑采購自SIGMA公司。

1.2 方 法

將尾葉紫薇的成熟種子用蒸餾水浸泡一夜進(jìn)行預(yù)處理。以不含誘變劑的蒸餾水為對(duì)照組，設(shè)置濃度梯度分別為0.5%、1%、2%、4%的EMS溶液，處理時(shí)間分別為4 h、8 h、12 h。使用大而飽滿的尾葉紫薇成熟種子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理，每個(gè)重復(fù)50粒種子，3組重復(fù)，共45個(gè)處理。將處理后的種子用5%的硫代硫酸溶液沖洗30 min后再用蒸餾水沖洗2 h，將清洗后的種子均勻播于墊有濕潤(rùn)試紙的培養(yǎng)皿中，在25 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。再次重復(fù)上述處理，將清洗后的種子點(diǎn)播在國家花卉工程中心小湯山基地溫室內(nèi)，進(jìn)行正常的養(yǎng)護(hù)管理。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1種子萌發(fā)的測(cè)定

定時(shí)觀察播種后的萌發(fā)情況，以種子露白作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，每天按時(shí)統(tǒng)計(jì)各處理的發(fā)芽數(shù)，連續(xù)3 d發(fā)芽數(shù)不再變化時(shí)視為發(fā)芽結(jié)束。測(cè)定種子的發(fā)芽勢(shì)，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。計(jì)算公式如下：

發(fā)芽勢(shì)(%)=(處理后9 d內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽率(%)=(處理后14 d內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù))×100%。

1.3.2根長(zhǎng)測(cè)定

將誘變后的尾葉紫薇種子培養(yǎng)至10 d，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量尾葉紫薇根長(zhǎng)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選擇10株測(cè)量，重復(fù)3次，取根長(zhǎng)的平均值。

1.3.3EMS誘變半致死劑量的確定

相對(duì)發(fā)芽率(%)=(處理組的發(fā)芽率/對(duì)照組的發(fā)芽率)×100%；

相對(duì)發(fā)芽勢(shì)(%)=(處理組的發(fā)芽勢(shì)/對(duì)照組的發(fā)芽勢(shì))×100%。

半致死劑量(Lethal concentration 50，LC50)以EMS處理尾葉紫薇種子的相對(duì)致死率確定，相對(duì)致死率為50%時(shí)獲得半致死劑量。

1.3.4紫薇幼苗形態(tài)學(xué)指標(biāo)的觀測(cè)

待幼苗正常生長(zhǎng)120 d后統(tǒng)計(jì)植株的分枝數(shù)、葉片數(shù)、莖粗、株高、冠幅，選取3片成熟葉片測(cè)量葉長(zhǎng)、葉寬并計(jì)算葉面積，葉形指數(shù)用“葉片長(zhǎng)/葉片寬”表示，成熟葉片面積使用Adobe Photoshop CC 2019軟件處理后獲得。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2019和SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用平均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用matlab 2018軟件對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過數(shù)學(xué)建模獲得尾葉紫薇EMS誘變處理的理論半致死劑量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)尾葉種子萌發(fā)的影響

將尾葉紫薇種子播種在培養(yǎng)皿6 d后，對(duì)照組的種子最先開始萌發(fā)(最早出苗的是蒸餾水處理4 h和蒸餾水處理12 h)；第7天起，0.5%和1%處理4 h、處理8 h組和0.5%處理12 h組開始萌發(fā)，第8天除4%處理組外其余處理組均開始萌發(fā)。隨著EMS濃度升高和處理時(shí)間延長(zhǎng)，萌發(fā)時(shí)間推遲越長(zhǎng)，到第9天，萌發(fā)起始完全結(jié)束；直至第14天，各處理組萌發(fā)數(shù)基本確定。結(jié)果表明，EMS處理能夠抑制尾葉紫薇種子的萌發(fā)，且EMS的濃度越高，處理時(shí)間越長(zhǎng)，抑制作用越明顯。與對(duì)照組相比，誘變組尾葉紫薇種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率隨EMS濃度的升高都呈逐漸下降的趨勢(shì)，且EMS濃度越高，萌發(fā)數(shù)值越低，與對(duì)照組差異極顯著。

注：不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(p<0.01)。下同。圖1 各處理組種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)Fig.1 Germination rate and germination potential of seeds in each treatment group

由圖1可知，不同濃度的EMS誘變劑對(duì)尾葉紫薇種子浸泡4 h后的發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和相對(duì)發(fā)芽勢(shì)都有顯著影響，且表現(xiàn)出一定的規(guī)律。與對(duì)照組相比，發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽率均隨EMS濃度的升高而降低，且濃度越高，發(fā)芽率下降越快。低濃度的EMS溶液處理對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用不明顯，0.5%處理的相對(duì)發(fā)芽率達(dá)80%以上，且與對(duì)照組的差異不顯著；高濃度的EMS溶液處理抑制作用明顯，2%～4%梯度下，相對(duì)發(fā)芽率下降了32.73%，下降速率最快。且隨著濃度的升高，發(fā)芽勢(shì)也呈降低趨勢(shì)，發(fā)芽勢(shì)的變化規(guī)律與發(fā)芽率基本相同。與4 h處理的變化規(guī)律相同，8 h、12 h的EMS溶液處理對(duì)尾葉紫薇種子的萌發(fā)具有抑制作用，經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的EMS處理后，不同組別間的差異極顯著(p<0.01)。且隨著濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用逐漸增強(qiáng)。在4%濃度下處理8 h、12 h種子全部致死。

2.2 不同EMS處理對(duì)尾葉紫薇根長(zhǎng)的影響

觀察發(fā)現(xiàn)，EMS處理對(duì)尾葉紫薇根的形態(tài)造成了影響。相同處理濃度下，處理時(shí)間越長(zhǎng)，根長(zhǎng)越短，EMS處理濃度與根長(zhǎng)關(guān)系也呈相同的變化規(guī)律。從圖2可知，不同處理時(shí)間對(duì)尾葉紫薇種子幼苗根長(zhǎng)影響達(dá)極顯著(p<0.01)，不同處理濃度對(duì)尾葉紫薇根長(zhǎng)也存在極顯著影響，處理濃度和處理時(shí)間相互作用時(shí)，根長(zhǎng)變化也呈顯著差異。

圖2 各處理組根長(zhǎng)Fig.2 Root length of each treatment group

2.3 尾葉紫薇EMS處理半致死劑量的初步選擇

由表1可知，EMS處理抑制了尾葉紫薇的萌發(fā)，處理時(shí)間越長(zhǎng)，濃度越高，相對(duì)致死率越高。低濃度處理4 h對(duì)尾葉紫薇種子的萌發(fā)效應(yīng)不顯著，0.5%處理4 h后相對(duì)致死率與對(duì)照組沒有顯著差異，但4%處理后相對(duì)致死率顯著增加，達(dá)到80.91%。方差分析結(jié)果顯示，隨著處理時(shí)間的增加，各組別之間差異極顯著(p<0.01)，說明不同的處理濃度和處理時(shí)間對(duì)尾葉紫薇種子萌發(fā)的相對(duì)致死率有極顯著影響。半致死劑量通常作為有效誘發(fā)植物產(chǎn)生突變的適宜誘變劑量。本實(shí)驗(yàn)表明，2%濃度處理4 h的相對(duì)致死率為48.18%，1%濃度處理12 h的相對(duì)致死率為58.25%，以上2種處理最接近半致死劑量，經(jīng)過比較初步確定EMS處理尾葉紫薇的半致死劑量為2%處理4 h。

表1 不同處理對(duì)尾葉紫薇萌發(fā)相對(duì)致死率的影響Table 1 Effects of different treatments on the germination relative lethal rate of Lagerstroemia caudata

2.4 尾葉紫薇EMS處理理論半致死劑量的選擇

相對(duì)致死率的變化受處理濃度和處理時(shí)間的影響，但本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較為分散，無法準(zhǔn)確估計(jì)半致死劑量。插值函數(shù)被廣泛應(yīng)用于數(shù)據(jù)分析中，指在離散數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上補(bǔ)插連續(xù)函數(shù)，使得這條連續(xù)曲線通過全部的離散數(shù)據(jù)點(diǎn)[13]。采用“雙線性插值”的方法對(duì)實(shí)異極顯著(p<0.01)。下同。

驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，既可以保證插值結(jié)果在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)上的誤差為零，又可以保證插值結(jié)果符合之前定性分析中得出的相對(duì)致死率隨處理濃度和處理時(shí)間的變化趨勢(shì)。本次試驗(yàn)利用matlab軟件自帶的插值函數(shù)interp 2在matlab軟件內(nèi)編程實(shí)現(xiàn)。最終通過線性插值的方法得到如圖3所示的模型，揭示了處理時(shí)間、處理濃度和相對(duì)致死率的變化規(guī)律，可以快速獲得大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。將相對(duì)致死率(z)=50%代入模型中，可以得到處理濃度和處理時(shí)間的具體值。本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)處理濃度為0.78%、處理時(shí)間為12 h時(shí)，取得EMS最低濃度下誘導(dǎo)尾葉紫薇的半致死劑量；當(dāng)處理濃度為2.11%、處理時(shí)間為4 h時(shí)，取得最短處理時(shí)間下的誘導(dǎo)尾葉紫薇的半致死劑量。

圖3 使用matlab得到的不同處理組尾葉紫薇半致死率的函數(shù)Fig.3 The function of half-lethal rate of Lagerstroemia caudata in different treatment groups obtained using matlab

2.5 不同濃度處理對(duì)尾葉紫薇幼苗生長(zhǎng)的影響

不同濃度EMS溶液處理4 h后，正常養(yǎng)護(hù)管理生長(zhǎng)120 d的植株進(jìn)行形態(tài)學(xué)測(cè)量，結(jié)果見表2。由表2可知，經(jīng)過不同濃度的EMS處理后，尾葉紫薇幼苗的生長(zhǎng)受到了一定的影響，4%處理下，尾葉紫薇的分枝數(shù)明顯多于其他處理組，與其他處理組的差異極顯著，說明高濃度的EMS處理可促進(jìn)尾葉紫薇分枝。隨著EMS處理濃度的增加，尾葉紫薇幼苗的株高呈先升后降的趨勢(shì)，2%處理組的株高最高，達(dá)48.79 cm。莖粗和冠幅對(duì)EMS處理的響應(yīng)不明顯，各處理組間沒有表現(xiàn)出明顯的變化規(guī)律。同時(shí)，由表3可知，4%處理組的葉片數(shù)、葉形指數(shù)、葉面積都大于其他處理組，表現(xiàn)為促進(jìn)作用，且與其他處理組的差異極顯著。但是在低濃度的EMS處理后，葉形指數(shù)在2.0～2.2之間，葉面積在11～13 cm2之間波動(dòng)，處理組的葉片形態(tài)與對(duì)照組沒有明顯的差異。

表2 不同濃度處理對(duì)尾葉紫薇幼苗生長(zhǎng)的影響Table 2 Effects of different concentrations on the growth of Lagerstroemia caudata seedlings

表3 不同濃度處理對(duì)尾葉紫薇幼苗葉片的影響Table 3 Effects of different concentration treatments on the leaves of Lagerstroemia caudata seedlings

3 結(jié)論與討論

EMS誘變簡(jiǎn)單高效，對(duì)植物染色體的損傷較小，被用于植物體各個(gè)部位組織、器官的誘變。吸脹后的種子吸收誘變劑的速率非常高，能夠使更多的誘變劑以更快的速度進(jìn)入胚組織，成為實(shí)驗(yàn)中最常見的誘變材料之一[14-15]。

不同處理濃度和處理時(shí)間對(duì)尾葉紫薇種子的發(fā)芽時(shí)間、發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)以及幼苗根的生長(zhǎng)都有顯著的影響。處理濃度和處理時(shí)間是決定EMS誘變的關(guān)鍵因素，且經(jīng)EMS溶液處理后，尾葉紫薇種子的發(fā)芽起始時(shí)間和發(fā)芽進(jìn)程都出現(xiàn)了一定程度的延緩，說明EMS處理能夠抑制種子的萌發(fā)。幼苗對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收情況與根的長(zhǎng)度有關(guān)，根的長(zhǎng)度過于短小不利于幼苗吸收營(yíng)養(yǎng)，高濃度EMS誘變下尾葉紫薇幼苗成活率較低可能與此有關(guān)。有研究證明，低濃度的EMS處理可以促進(jìn)部分植物種類的種子萌發(fā)，如醉魚草[16]、知母[17]、無芒雀[18]等，這可能與不同物種種皮的透水性、種子的大小和內(nèi)部結(jié)構(gòu)以及種子的休眠機(jī)制有關(guān)。

在本次試驗(yàn)中，2%濃度處理4 h尾葉紫薇成熟種子的相對(duì)致死率為48.18%，1%濃度處理12 h的相對(duì)致死率為58.25%，以上2種處理最接近半致死濃度。在進(jìn)行誘變實(shí)驗(yàn)時(shí)可以選擇2%處理4 h作為處理方式。本試驗(yàn)采用“雙線性插值”的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，通過數(shù)學(xué)分析得出，當(dāng)處理濃度為0.78%、處理時(shí)間為12 h時(shí)，取得EMS最低濃度下誘導(dǎo)尾葉紫薇的半致死劑量；當(dāng)處理濃度為2.11%、處理時(shí)間為4 h時(shí)取得最短處理時(shí)間下的誘導(dǎo)尾葉紫薇的半致死劑量。

當(dāng)前紫薇屬植物的EMS誘變研究較少，伍漢斌等[12]在對(duì)南紫薇種子進(jìn)行EMS誘變?cè)囼?yàn)時(shí)得出，3.0%EMS濃度處理6 h為誘變南紫薇種子的半致死劑量，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與之有較大差異，可能是尾葉紫薇與南紫薇的種間差異性。在其他木本觀賞植物中，慎家輝等[19]探索了EMS對(duì)杜梨的誘變效應(yīng)，得到0.3%處理24 h為杜梨誘變的最佳劑量，Dhakshanamoorthy等[20]得到EMS誘變麻風(fēng)樹的半致死劑量為3%處理8 h；孫慧[21]根據(jù)萌發(fā)率和成苗率確定海濱木槿種子的適宜誘變濃度為1.5%，誘變處理時(shí)間4 h；朱翠翠等[22]對(duì)青檀種子的研究發(fā)現(xiàn)，1.2%～1.5%EMS濃度處理48 h為青檀種子的半致死劑量。這說明不同植物對(duì)EMS處理的敏感性不同，誘變效果存在很大差異。

研究發(fā)現(xiàn)，浸種時(shí)間越長(zhǎng)，尾葉紫薇的萌發(fā)率越高。對(duì)照組處理12 h，發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)明顯高于4 h處理組。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，EMS誘變處理尾葉紫薇種子時(shí)，較高的環(huán)境溫度可以提高萌發(fā)率。結(jié)果表明，在一定溫度范圍內(nèi)，溫度升高有利于突變頻率提高?？勺鳛榻窈髮?shí)驗(yàn)的探索依據(jù)。

EMS處理對(duì)尾葉紫薇后期的生長(zhǎng)產(chǎn)生了一定的影響。高濃度的EMS處理可以促進(jìn)尾葉紫薇分枝和葉片增大，較低濃度的EMS處理可以促進(jìn)株高增長(zhǎng)。在冠幅、莖粗等方面，EMS處理的效應(yīng)不明顯。但誘變效應(yīng)具有很大的隨機(jī)性，處理組間個(gè)體差異性較大，具體變化規(guī)律仍需加大實(shí)驗(yàn)量再次進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了不同的濃度梯度，在3個(gè)不同處理時(shí)間下使用EMS溶液對(duì)尾葉紫薇進(jìn)行浸種，通過對(duì)各處理組發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)以及幼苗根的長(zhǎng)度、苗期生長(zhǎng)狀況等指標(biāo)進(jìn)行研究分析，最終獲得了尾葉紫薇種子各種指標(biāo)在EMS處理?xiàng)l件下的變化規(guī)律，使用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析獲得了處理時(shí)間和處理濃度的相互作用關(guān)系。通過對(duì)半致死劑量的初步估計(jì)，確定了尾葉紫薇EMS誘變的適宜劑量為2%濃度處理4 h。同時(shí)使用matlab軟件建造模型預(yù)測(cè)了EMS誘變尾葉紫薇種子的理論半致死組合，對(duì)播種后的幼苗進(jìn)行了初步的形態(tài)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)。試驗(yàn)結(jié)果可為尾葉紫薇的誘變體庫建立及誘變育種提供參考。