基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討加味二陳湯治療多囊卵巢綜合征作用機(jī)制*

龔文婧，邵超，黃勝男

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100000

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)為臨床常見的婦科內(nèi)分泌性疾病，是育齡期婦女的多發(fā)疾病，主要臨床表現(xiàn)為胰島素抵抗、高雄激素血癥、排卵障礙、卵巢多囊樣、不孕、多毛、肥胖等，但其發(fā)病機(jī)制和原因尚不明確，可能涉及遺傳、環(huán)境和心理因素等多方面原因。目前，臨床多采用個(gè)體化對(duì)癥治療，雖能暫時(shí)取得臨床療效，但是不良反應(yīng)多、藥效短、靶點(diǎn)單一。中醫(yī)藥治療PCOS存在藥物多靶點(diǎn)治療、系統(tǒng)性治療、藥效持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)勢(shì)。PCOS屬中醫(yī)學(xué)“閉經(jīng)”“癥瘕”“不孕癥”等范疇，病機(jī)為臟腑功能失調(diào)，痰瘀阻滯，虛實(shí)夾雜，常見證型為腎虛肝郁證、腎虛痰濕證、腎虛痰瘀證等，臨證時(shí)多從肝、脾、腎論治，應(yīng)注重補(bǔ)腎、活血、化痰燥濕，使氣血和調(diào)、胞宮按時(shí)盈滿[1]。加味二陳湯是筆者在二陳湯的基礎(chǔ)加入天南星、白術(shù)、枳實(shí)、澤蘭、菟絲子等藥物的自擬方劑，具有健脾燥濕化痰的作用?，F(xiàn)代研究表明，二陳湯可以改善胰島素抵抗、卵巢形態(tài)、調(diào)節(jié)性激素水平[2]，其中菟絲子可促進(jìn)卵巢和子宮發(fā)育，具有雌激素樣作用[3]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于藥物化學(xué)成分、靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)與疾病通路之間的相互作用，從多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)出發(fā)，這與中醫(yī)學(xué)整體觀理論有異曲同工之處，為研究中藥復(fù)雜成分的作用機(jī)制提供了新思路。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析加味二陳湯治療PCOS的潛在作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，以期為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 篩查加味二陳湯的活性成分將半夏、枳實(shí)、茯苓、菟絲子、天南星、澤蘭、陳皮、白術(shù)等8味中藥名稱輸入在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)平臺(tái)[4](http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，設(shè)置口服生物利用度(oral bioavailability，OB)為≥30%，類藥性(drug likeness，DL)≥0.18，據(jù)此對(duì)每一味中藥的活性成分進(jìn)行篩查，得到此復(fù)方的主要活性成分。

1.2 預(yù)測(cè)加味二陳湯作用靶點(diǎn)通過TCMSP平臺(tái)收集主要活性成分的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，為了數(shù)據(jù)處理的便捷性和標(biāo)準(zhǔn)性，通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)[5](https：//www.uniprot.org/)將加味二陳湯的主要活性成分對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)規(guī)范為基因靶標(biāo)。

1.3 構(gòu)建中藥-活性成分-基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)將中藥主要活性成分、中藥名和相應(yīng)的基因靶標(biāo)分別導(dǎo)入Excel再導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件，最終，借此突出其有效核心成分，并觀察其相互作用機(jī)制。

1.4 篩查PCOS疾病靶點(diǎn)以多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)為檢索詞，在基因名片數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneCards，https：//www.genecards.org)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)(online mendelian inheritance in man，OMIM，http：//www.omim.org)、藥物數(shù)據(jù)庫(kù)(Drugbank，https：//www.drugbank.ca)數(shù)據(jù)庫(kù)[6-7]和疾病相關(guān)基因與突變位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)(Disgenet，https：//www.disgenet.org)篩查PCOS疾病基因靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)[7]，因這些數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的疾病相關(guān)數(shù)據(jù)來源廣泛，故對(duì)檢索到的基因靶點(diǎn)進(jìn)行匯集、合并等處理，獲得PCOS最終的疾病靶點(diǎn)。

1.5 繪制加味二陳湯與PCOS共同靶點(diǎn)韋恩圖及建立蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein protein interaction，PPI)模型將加味二陳湯藥物基因靶點(diǎn)與PCOS疾病基因靶點(diǎn)間同時(shí)導(dǎo)入線上生信作圖平臺(tái)(http：//www.bioinformatics.com.cn/)繪制韋恩圖。在EXCEL中提取共同基因靶點(diǎn)并將此導(dǎo)入STRING11.0數(shù)據(jù)庫(kù)[8](https：//string-db.org)構(gòu)建PPI模型：選擇“Homo sapiens”，最小互作閾值>0.4，隱藏游離基因靶標(biāo)，得到PPI模型。將PPI模型導(dǎo)入CytoScape3.7.1軟件，Tools工具作網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治?，設(shè)置卡值為“節(jié)點(diǎn)連接度(degree) ”的2倍中位數(shù)，進(jìn)一步明確提取核心基因靶標(biāo)。

1.6 共有靶點(diǎn)富集分析用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)[9-10](https：//david.ncifcrf.gov)對(duì)PCOS與加味二陳湯共同靶標(biāo)進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)生物功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopodia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，根據(jù)富集基因數(shù)選出前20個(gè)共有靶點(diǎn)，在Omicshare平臺(tái)(http：//www.omicshare.com/tools)作可視化圖。

2 結(jié)果

2.1 加味二陳湯活性成分篩選通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索加味二陳湯的各個(gè)藥物活性成分，滿足OB≥30%及DL≥0.18的活性成分共有82個(gè)，其中半夏有效成分13個(gè)、茯苓有效成分15個(gè)、枳實(shí)有效成分22個(gè)、陳皮有效成分5個(gè)、天南星有效成分7個(gè)、白術(shù)有效成分7個(gè)、澤蘭有效成分2個(gè)、菟絲子有效成分11個(gè)，去除重復(fù)的有效成分后剩余有效活性成分72個(gè)，潛在活性成分信息及對(duì)應(yīng)蛋白靶點(diǎn)個(gè)數(shù)見表1。

表1 加味二陳湯潛在活性成分及對(duì)應(yīng)蛋白靶點(diǎn)數(shù)

續(xù)表1 加味二陳湯潛在活性成分及對(duì)應(yīng)蛋白靶點(diǎn)數(shù)

2.2 加味二陳湯活性成分的作用靶點(diǎn)通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)將蛋白質(zhì)靶點(diǎn)規(guī)范化為基因靶點(diǎn)，共獲得935個(gè)作用靶點(diǎn)，刪除重復(fù)值后，最終確定257個(gè)作用靶點(diǎn)，見表2。

表2 加味二陳湯活性成分的作用靶點(diǎn)

2.3 中藥-活性成分-基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)將無相應(yīng)基因靶標(biāo)的活性成分排除后，把TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中收集到的中藥主要活性成分及規(guī)范化基因靶點(diǎn)導(dǎo)入Excel表，再在 Cytoscape 3.7.1創(chuàng)建中藥-活性成分-基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，獲得8個(gè)中藥節(jié)點(diǎn)、50個(gè)主要有效成分節(jié)點(diǎn)和257個(gè)基因靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)，共315個(gè)節(jié)點(diǎn)，994條關(guān)系線，見圖1。淺紫色代表白術(shù)活性成分，粉色代表半夏活性成分，橙紅色代表陳皮活性成分，玫紅色代表茯苓活性成分，粉綠色代表枳實(shí)活性成分，矢車菊色代表天南星活性成分，栗梅色代表菟絲子活性成分，因澤蘭的活性成分均與其他藥物重復(fù)，故將其設(shè)為土黃色和橙色。進(jìn)一步對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析可知，加味二陳湯中與基因靶標(biāo)聯(lián)系最為密切活性成分是為柚皮素(naringenin)、槲皮素(quercetin)、、豆甾醇(Stigmasterol)、β-谷甾醇 (β-sitosterol)、川陳皮素(nobiletin)，見表3。

圖1 加味二陳湯中藥-活性成分-基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表3 與基因靶點(diǎn)關(guān)系密切的活性成分及相關(guān)信息

2.4 PCOS疾病相關(guān)靶點(diǎn)篩選基于GeneCards、OMIM、Drugbank和Disgenet數(shù)據(jù)庫(kù)篩選PCOS的疾病基因靶點(diǎn)，結(jié)果顯示，GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)獲得PCOS疾病基因靶點(diǎn)2 301個(gè)，運(yùn)用Excel中的“MEDIAN”算法計(jì)算其相關(guān)性分?jǐn)?shù)(relevance score)的中位數(shù)，然后按照“依據(jù)大于或等于中位數(shù)”的篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，最終獲得 1 151 個(gè)疾病基因靶點(diǎn)。通過同樣的操作，在各數(shù)據(jù)庫(kù)獲得基因靶標(biāo)分別為OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)629個(gè)，Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)36個(gè)，Disgenet數(shù)據(jù)庫(kù)988個(gè)。去除重復(fù)值后合并匯集，最終獲得疾病基因靶標(biāo)2 354個(gè)。

2.5 繪制韋恩圖及構(gòu)建PPI模型圖將加味二陳湯篩選獲得的基因靶標(biāo)257個(gè)與疾病基因靶點(diǎn) 2 354 個(gè)導(dǎo)入在線作圖平臺(tái)繪制韋恩圖，顯示共同基因靶點(diǎn)143個(gè)，見圖2。用EXCEL篩出共同基因靶標(biāo)，并導(dǎo)入STRIG 11.0平臺(tái)獲得PPI模型，圖中共有142個(gè)節(jié)點(diǎn)，2 932條邊，邊代表共同基因之間的關(guān)聯(lián)度，關(guān)聯(lián)度隨與邊的粗細(xì)成正比；節(jié)點(diǎn)為具體的共同基因，見圖3。

圖2 加味二陳湯和PCOS韋恩圖

圖3 加味二陳湯和PCOS相互作用PPI模型圖

2.6 加味二陳湯與PCOS相互作用核心靶基因?qū)PI模型導(dǎo)入CytoScape 3.7.1，用Tools工具分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩?，以進(jìn)一步分析PPI模型的核心靶基因。核心靶基因?yàn)榻z氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(Akt1)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤蛋白P53(tumor protein 53，TP53)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGFA)、絲裂原活化蛋白激酶3(mitogen activated prtotein kinases 3，MAPK3)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、JUN原癌基因、MAPK1、表皮生長(zhǎng)因子受體(epithelial grouth factor receptor，EGFR)、細(xì)胞凋亡相關(guān)半胱氨酸肽酶3(caspase 3，CASP3)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP9)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)、MAPK8、前列腺素-過氧化物合酶-2、原癌基因蛋白、ESR1、G1/S特異性細(xì)胞周期蛋白D1、2，4-雙烯酰輔酶A還原酶1、原癌基因c-Fos、MMP2、磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸肌醇3-磷酸酶和雙特異性蛋白磷酸酶，見圖4。

圖4 加味二陳湯和PCOS相互作用核心靶基因圖

2.7 GO富集分析共有基因靶點(diǎn)的GO富集分析在DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)完成，包括生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細(xì)胞組成(cellular component，CC)等3個(gè)部分，其中BP共得637個(gè)條目，按照富集基因數(shù)量進(jìn)行排序，前20個(gè)條目主要涉及轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、負(fù)調(diào)控、藥物反應(yīng)、凋亡過程及其調(diào)控、細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控、雌二醇反應(yīng)等生物過程，見圖5。MF共得111個(gè)條目，其按照富集基因數(shù)篩選得的前20條主要涉及蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、DNA結(jié)合、ATP結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合及活性等分子功能，見圖6。CC共得65個(gè)條目，前20條目主要參與核、細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜、細(xì)胞外區(qū)域等細(xì)胞組分的組成，見圖7。圖中Rich Factor為富集于此功能中的基因與所有位于此功能的基因的比值，富集程度與比值成正比；氣泡的大小表示基因數(shù)，氣泡越大表示富集的基因數(shù)與氣泡成正比，而顏色越紅則顯著性越高。

圖5 共同基因靶點(diǎn)GO功能分析生物過程氣泡圖

圖6 共同基因靶點(diǎn)GO功能分析分子功能氣泡圖

圖7 共同基因靶點(diǎn)GO功能分析細(xì)胞組成氣泡圖

2.8 KEGG通路富集分析143個(gè)共有基因靶標(biāo)進(jìn)行KEGG富集分析在DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)完成，得到121個(gè)條目，根據(jù)條目富集的基因數(shù)量進(jìn)行排序，前20個(gè)條目主要涉及PI3K/Akt、MAPK、TNF等多條信號(hào)通路，見表4，選擇前20個(gè)條目作氣泡圖，見圖8，氣泡越大表明該通路富集的共同基因靶點(diǎn)靶點(diǎn)通路富集數(shù)量越多。

表4 共同基因靶點(diǎn)KEGG通路富集前20個(gè)條目

圖8 共同基因靶點(diǎn)KEGG通路富集氣泡圖

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)加味二陳湯進(jìn)行活性成分、靶點(diǎn)與疾病的生物學(xué)信息的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，探討該復(fù)方對(duì)PCOS的作用機(jī)制。研究通過TCMSP平臺(tái)篩選、Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)規(guī)范化及Cytoscape3.7.1軟件可視化處理后發(fā)現(xiàn)，加味二陳湯涉及靶點(diǎn)前5位的活性成分分別為槲皮素、β-谷甾醇、柚皮素、豆甾醇和川陳皮素。槲皮素是自然界分布最廣的黃酮類之一[11]，具有調(diào)節(jié)激素水平紊亂及治療PCOS各種并發(fā)癥的作用[12]。研究表明，槲皮素能夠通過抑制PI3K信號(hào)通路并下調(diào)CYP17A1基因，同時(shí)具有抗雄激素的作用，可以降低睪丸激素水平，還能將低水平的雌二醇和孕酮逆轉(zhuǎn)至近乎正常水平[13-14]。槲皮素可降低促黃體生成素水平，還能增強(qiáng)脂聯(lián)素活性等途徑從而降低胰島素抵抗[12]。POCS通常伴有血脂異常、肥胖等并發(fā)癥[15]，血脂升高是PCOS 血管內(nèi)皮損傷的重要因素[16]，而β-谷甾醇、豆甾醇作為甾醇成分均能抑制膽固醇吸收與合成、干擾三酰甘油吸收，從而改善體內(nèi)血脂水平[17]。柚皮素是一種天然黃烷酮，具有消炎、鎮(zhèn)痛的作用，HONG YL等[18]研究指出，柚皮素能顯著提高活性氧清除酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶的水平，能防止PCOS大鼠體質(zhì)量過度增加，還可顯著降低血清葡萄糖水平，并通過降低PCOS大鼠模型中類固醇生成酶3β-羥基類固醇脫氫酶和17β-羥基類固醇脫氫酶的活性來降低雌二醇、睪丸激素的水平，減弱類固醇生成酶的活性，以維持卵巢的正常解剖結(jié)構(gòu)。川陳皮素是一種多甲氧基黃酮類化合物，其能抑制炎癥介質(zhì)產(chǎn)生、抗糖尿病胰島素抵抗從而對(duì)PCOS的發(fā)生起到一定的治療作用[19]。

此外，根據(jù)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，加味二陳湯治療PCOS的潛在核心靶點(diǎn)包含Akt1、IL-6、TP53、TNF、JUN、MAPK1、MAPK3、MAPK8、PTGS2、ESR1、PTEN等。而研究顯示，MAPK1、TP53和MAPK9可能是PCOS卵巢組織中自噬相關(guān)基因被廣泛激活的原因[20]。PCOS被認(rèn)為是慢性低度炎癥性疾病，臨床上常伴有性激素水平紊亂、胰島素抵抗，而在患者卵巢組織中檢測(cè)出IL-6、TNF-α水平升高，這可能是維持PCOS低度炎癥的關(guān)鍵原因。TNF-α由脂肪細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等釋放，是重要的炎癥因子，研究表明，TNF-α表達(dá)上調(diào)能夠誘導(dǎo)卵泡顆粒細(xì)胞凋亡、激活卵泡膜間質(zhì)細(xì)胞有絲分裂，卵泡顆粒細(xì)胞減少而卵泡膜間質(zhì)細(xì)胞增加，最終導(dǎo)致出現(xiàn)雌激素合成障礙、雄激素合成增多的現(xiàn)象[21]。還有研究表明，TNF-α參與調(diào)節(jié)糖脂代謝并與胰島素抵抗相關(guān)，還參與了卵巢卵泡膜細(xì)胞的增殖和類固醇生成[22]。PTEN是抑癌基因，具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶雙重磷酸酶活性，可通過雌二醇對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞磷酸化的影響調(diào)節(jié)內(nèi)膜細(xì)胞的增殖與凋亡。PTEN還與胰島素抵抗相關(guān)，miR-499-5p參與了胰島素抵抗過程，而PTEN是miR-499-5p的靶基因，研究表明下調(diào)miR-499-5p水平可通過靶向PTEN破壞PI3K/AKT/GSK信號(hào)通路和糖原合成[14]。

KEGG富集分析顯示，加味二陳湯的潛在作用靶點(diǎn)富集在PI3K/Akt和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這兩條通路恰好是經(jīng)典的胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。PI3K/Akt信號(hào)通路介導(dǎo)胰島素的促進(jìn)代謝作用，比如糖原合成等，是胰島素參與糖代謝的關(guān)鍵途徑，也是卵巢功能的物質(zhì)基礎(chǔ)[23]。胰島素樣生長(zhǎng)因子、胰島素等與自身受體結(jié)合后激活受體，受體發(fā)生酪氨酸磷酸化，PI3K的亞基則與這些受體結(jié)合從而解除對(duì)自身的抑制，繼而激活 PI3K/Akt信號(hào)通路。MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路是胰島素的促分裂的途徑，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化。隨著研究深入，越來越多研究表明，PI3K/Akt與自噬、胰島素抵抗、糖代謝、脂肪代謝相關(guān)。正常水平的自噬可清除細(xì)胞的有害物質(zhì)及受損細(xì)胞器，從而維持細(xì)胞的正常功能。PI3K可與相關(guān)自噬蛋白形成復(fù)合體，調(diào)控其他自噬蛋白定位到自噬前體的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致PCOS卵巢組織PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路失調(diào)[17]。還有研究表明，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的Akt過度磷酸化導(dǎo)致內(nèi)膜上皮不典型增生[23]，且PI3K/Akt作用于卵巢顆粒細(xì)胞，影響小卵泡的發(fā)育，導(dǎo)致PCOS患者無法形成優(yōu)勢(shì)卵泡，進(jìn)而影響排卵功能[24]。此外，PCOS患者伴有胰島素抵抗導(dǎo)致高胰島素狀態(tài)，可引發(fā)高雄激素血癥，可能與PI3K/Akt、MAPK/ERK1/2這兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)[25]。

綜上所述，加味二陳湯主要通過PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮治療PCOS的作用，同時(shí)還能通過降低睪丸激素、雌二醇、促黃體生成素的激素水平，抑制胰島素抵抗及調(diào)控自噬水平以恢復(fù)卵巢功能，并通過降低膽固醇、三酰甘油水平調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)代謝。加味二陳湯治療PCOS具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，涉及多條信號(hào)通路，可見其發(fā)揮治療PCOS機(jī)制的系統(tǒng)性和復(fù)雜程度。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果揭示了加味二陳湯活性成分、潛在作用靶點(diǎn)、PCOS疾病靶點(diǎn)及相關(guān)信號(hào)通路，為進(jìn)一步研究藥理作用機(jī)制提供了新思路。