Toll 樣受體9 在呼吸系統(tǒng)疾病中的作用機(jī)制研究進(jìn)展

燕江雪 曹囡囡 丁霞 倪倩

Toll 樣受體（TLR）是一類模式識(shí)別受體，與配體結(jié)合后，啟動(dòng)胞內(nèi)免疫信號(hào)蛋白的級(jí)聯(lián)反應(yīng)、激活免疫應(yīng)答信號(hào)通路，在激活宿主天然免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)、增強(qiáng)免疫防御的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。人類TLR 共包含10 個(gè)功能性受體（TLR1～TLR10），TLR9 可在識(shí)別配體未甲基化的CpG 二核苷酸后，啟動(dòng)下游免疫信號(hào)通路，激活免疫反應(yīng)，從而在呼吸系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用。本文就TLR9 在呼吸系統(tǒng)常見疾病中的作用及其機(jī)制進(jìn)行綜述。

一、TLR9

1. TLR9 在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸途徑及信號(hào)通路

TLR9 位于靜息細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，需要內(nèi)體穿梭以啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。不協(xié)調(diào)的93 同系物B1（UNC93B1）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白，可調(diào)控TLR9 包裝為外殼蛋白復(fù)合物Ⅱ（COP Ⅱ）囊泡，從而使TLR9 轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體。靜息狀態(tài)下，TLR9 與UNC93B1 共同定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，TLR9 通過COP Ⅱ囊泡，沿分泌途徑到達(dá)高爾基體、質(zhì)膜；而TLR9可與質(zhì)膜上的激活蛋白2（AP-2）以網(wǎng)格蛋白依賴的方式內(nèi)吞進(jìn)入內(nèi)體溶酶體系統(tǒng)，在內(nèi)體酸化后，組織蛋白酶和肽鏈內(nèi)切酶水解TLR9。同時(shí)，TLR9的配體CpG 也以網(wǎng)格蛋白依賴的方式內(nèi)吞后進(jìn)入內(nèi)體溶酶體系統(tǒng)。當(dāng)TLR9 及其配體進(jìn)入內(nèi)體溶酶體系統(tǒng)后，啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

TLR9 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路募集的參與分子取決于細(xì)胞類型。在巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（pDC）和經(jīng)典DC 中，活化的TLR9 通過募集髓樣分化因子88（MyD88），激活I(lǐng)L-1 受體相關(guān)激酶4（IRAK 4）、IRAK1 和IRAK2 等信號(hào)分子，繼而激活核因子-κB（NF-κB）的信號(hào)通路，合成促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-6 和IL-12 等。但在pDC上，TLR9 主要啟動(dòng)Ⅰ型IFN（IFN-Ⅰ）合成途徑，MyD88 通過引導(dǎo)IFN 調(diào)節(jié)因子7（IRF7）向細(xì)胞核易位，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞合成IFN-I。

2. TLR9 的配體

未甲基化的CpG 二核苷酸是TLR9 的配體，存在于天然的細(xì)菌、病毒及線粒體的DNA 中。未甲基化的CpG 二核苷酸激活TLR9 及下游信號(hào)，可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的1 型輔助性T 淋巴細(xì)胞（Th1）為主的免疫反應(yīng)。Th1產(chǎn)生細(xì)胞因子如IFN-γ、 IL-12等，繼續(xù)活化自然殺傷（NK）細(xì)胞、增強(qiáng)CD8T 淋巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答。同時(shí)，這一級(jí)聯(lián)免疫反應(yīng)可抑制Th2 介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，減少細(xì)胞因子如IL-4、IL-5 等的生成。CpG 寡脫氧核苷酸（CpG ODN）是人工合成的含有非甲基化CpG 的ODN，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CpG ODN 可通過TLR9/MyD88 信號(hào)通路促進(jìn)IL-10 等產(chǎn)生，從而抑制過敏性氣道炎癥反應(yīng)。因此，TLR9 的配體可作為變應(yīng)性哮喘中病理性Th2免疫應(yīng)答反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑。另外，CpG ODN 聯(lián)合免疫靶點(diǎn)阻斷療法已用于腫瘤免疫治療的研究。

二、TLR9 與呼吸系統(tǒng)疾病

研究表明，TLR9 與多種呼吸系統(tǒng)疾病，如哮喘、肺癌和肺炎等疾病發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)，并影響疾病的轉(zhuǎn)歸與預(yù)后。

1. TLR9 與哮喘

哮喘是慢性氣道免疫炎癥性疾病，其病理機(jī)制主要為：Th2 生成的細(xì)胞因子（如IL-4、IL-5、IL-9 和IL-13）增多，Th1 生成的細(xì)胞因子（IL-2）減少，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IgE增多，募集肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等，促進(jìn)哮喘的氣道炎癥。

TLR9/IL-2 軸通過抑制IL-17A 的過度生成而加重哮喘。IL-2 是Th17 生成IL-17A 的負(fù)調(diào)控因子。在屋塵螨誘導(dǎo)的過敏性哮喘動(dòng)物模型中，TLR9 缺失小鼠與野生型（WT）小鼠相比，嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量減少，氣道高反應(yīng)性降低；同時(shí)Th2 細(xì)胞因子IL-4、IL-5 和IL-13 的產(chǎn)生受到抑制，Th1 生成的IL-2 減少，導(dǎo)致Th17 生成的IL-17A 增多，而過量的IL-17A 可抑制過敏性氣道炎癥反應(yīng)，提示TLR9/IL-2 軸通過抑制IL-17A 的過量產(chǎn)生，從而促進(jìn)氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥。另外，NaR9 是TLR9 抑制抗體，可以抑制屋塵螨誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性和Th2 型炎癥反應(yīng)；使用NaR9 阻斷TLR9，IL-17A 的生成增多，這與TLR9 缺失小鼠表現(xiàn)類似，結(jié)合以上研究結(jié)果，證明在屋塵螨誘導(dǎo)的過敏性哮喘中，NaR9 通過抑制TLR9/IL-2 軸，促進(jìn)IL-17A 的過量生成，從而抑制過敏性哮喘的炎癥反應(yīng)。

c-Jun 氨基末端激酶（JNK）/TLR9 信號(hào)通路通過抑制褪黑素生物合成，介導(dǎo)過敏性氣道炎癥。SP600125 是JNK 的特異性抑制劑，可減輕卵清蛋白（OVA）誘導(dǎo)的WT 小鼠過敏性氣道炎癥。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，由OVA 誘導(dǎo)構(gòu)建的過敏性氣道疾病動(dòng)物模型中，TLR9 和磷酸化JNK 的表達(dá)水平明顯升高。TLR9 缺失可有效抑制氣道炎癥，使肺部炎癥細(xì)胞的募集和黏液分泌明顯減少，血清中特異性的IgE 表達(dá)水平降低，支氣管肺泡灌洗液內(nèi)的炎癥因子，如IL-4、IL-13 及IFN-γ 表達(dá)水平明顯減少。TLR9 缺失對(duì)JNK 的磷酸化表達(dá)水平?jīng)]有影響，但通過SP600125 抑制JNK 后TLR9 的表達(dá)水平明顯降低，提示JNK 作為TLR9 信號(hào)通路的上游分子，參與誘導(dǎo)過敏性氣道炎癥。褪黑素屬于胺類激素，具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能，由色氨酸合成，其合成途徑涉及2 種關(guān)鍵酶，分別是N-乙?；D(zhuǎn)移酶和羥基吲哚-氧-甲基轉(zhuǎn)移酶（HIOMT）。研究表明，哮喘患者的唾液或血清褪黑素表達(dá)水平明顯低于健康對(duì)照組，外源性和內(nèi)源性褪黑素均可抑制氣道炎癥。當(dāng)OVA 刺激小鼠后，肺組織中HIOMT蛋白表達(dá)減少，在支氣管肺泡灌洗液和血清中，褪黑素的表達(dá)水平降低；但在TLR9 缺失后，這種作用消除。SP600125 升高了OVA 誘導(dǎo)小鼠模型中HIOMT 蛋白表達(dá)和褪黑素表達(dá)水平，但這種影響在TLR9 缺失后消除。以上結(jié)果表明OVA 刺激可激活JNK/TLR9 信號(hào)通路，該信號(hào)通路可作為負(fù)信號(hào)調(diào)節(jié)HIOMT 蛋白的表達(dá)和褪黑素的產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)過敏性氣道炎癥反應(yīng)。也有研究報(bào)道，MyD88 缺失小鼠在OVA 誘導(dǎo)下產(chǎn)生氣道炎癥，提示OVA 通過激活非MyD88 依賴性的TLR9 信號(hào)通路，導(dǎo)致氣道炎癥。

但在多種OVA 誘導(dǎo)的過敏性疾病的動(dòng)物模型中，CpG ODN 可抑制過敏性氣道炎癥反應(yīng)，這是由于純化的CpG ODN 可通過TLR9/MyD88 信號(hào)通路，促進(jìn)IL-10 等產(chǎn)生，從而改善氣道炎癥。目前TLR9 作為過敏性氣道疾病新的治療靶點(diǎn)仍存在爭(zhēng)議，因此需要更多的研究進(jìn)一步探索TLR9 在哮喘等過敏性疾病中的機(jī)制。

2. TLR9 與肺癌

肺癌是人體常見腫瘤之一。炎癥是腫瘤的標(biāo)志性反應(yīng)之一，在腫瘤微環(huán)境中存在的TLR 在識(shí)別特異性配體后激活，并誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生適應(yīng)性免疫反應(yīng)。TLR 就像一把雙刃劍，一方面識(shí)別腫瘤特異性抗原并激活天然免疫反應(yīng)，另一方面通過誘導(dǎo)持續(xù)的適應(yīng)性反應(yīng)來促進(jìn)潛伏的慢性炎癥，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前已發(fā)現(xiàn)TLR9 在肺癌進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用，但其相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

有研究者通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肺腺癌細(xì)胞中激活的TLR9 可誘導(dǎo)神經(jīng)酰胺酶活化，導(dǎo)致1 磷酸鞘氨醇（S1P）形成甚至過表達(dá)，從而介導(dǎo)NF-κB通路釋放TNF-α 等，表明TLR9/S1P 軸依賴性的炎癥信號(hào)通路通過誘導(dǎo)有利于S1P 的神經(jīng)酰胺/S1P 的失衡，在炎性呼吸疾病的惡化中發(fā)揮重要作用。

程序性死亡受體1（PD-1）及其配體作為靶點(diǎn)的免疫療法，是臨床上針對(duì)非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤的一個(gè)重要的治療方案。但當(dāng)抗PD-1 抗體單獨(dú)用于治療非小細(xì)胞肺癌時(shí)，僅對(duì)約20%患者有效，這表明需要進(jìn)一步聯(lián)合治療。Perry 等在肺腺癌和肺鱗癌的小鼠原位癌轉(zhuǎn)移模型中，以非潤(rùn)濕模板粒子復(fù)制技術(shù)生產(chǎn)的納米顆粒作為載體，經(jīng)口氣管滴注，將CpG 遞送到小鼠肺臟中，明顯促進(jìn)了腫瘤的消退，并限制了與可溶性CpG 相關(guān)的全身毒性反應(yīng)，證明局部CpG 可以協(xié)調(diào)天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)的活化，加強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)。研究表明，吸入霧化TLR9 激動(dòng)劑聯(lián)合抗PD-1 治療可增強(qiáng)機(jī)體免疫細(xì)胞對(duì)肺內(nèi)、肺外腫瘤的殺傷作用，這與腫瘤微環(huán)境中功能性效應(yīng)CD8T 淋巴細(xì)胞的增多有關(guān)。IMO-2055 是一種CpG ODN，屬于TLR9 激動(dòng)劑，目前已在Ⅰ期和Ⅱ期試驗(yàn)中證實(shí)其可聯(lián)合靶向免疫藥物治療肺癌。一項(xiàng)晚期非小細(xì)胞肺癌的I 期臨床試驗(yàn)證明，IMO-2055 與厄洛替尼和貝伐珠單抗聯(lián)合治療具有良好的耐受性和抗腫瘤活性。以上研究提示，TLR9能否成為肺癌免疫治療的新靶點(diǎn)仍需進(jìn)一步的探索研究。

3. TLR9 與肺炎

3.1 TLR9 與非感染性肺炎

TLR9 可加重矽肺小鼠的肺部炎癥和纖維化的程度。在矽肺動(dòng)物模型中，WT 小鼠暴露于二氧化硅（SiO）顆粒后出現(xiàn)肺部炎癥、形成肉芽腫和纖維化。暴露于SiO顆粒的TLR9 缺失小鼠的肺部炎癥和纖維化程度相對(duì)較低，且肺功能得到改善。接觸SiO顆粒會(huì)導(dǎo)致線粒體損傷、DNA 釋放和線粒體自噬，釋放的游離線粒體DNA（ mtDNA）可激活TLR9，進(jìn)而加重肺部炎癥反應(yīng)。以上證據(jù)表明，TLR9 與矽肺的疾病進(jìn)展密切相關(guān)。

游離mtDNA 是線粒體損傷相關(guān)分子模式（DAMP）的主要成分，在病理狀態(tài)下釋放增加，并參與各種炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展。游離mtDNA 含有大量未甲基化的CpG 二核苷酸，通過TLR9 激發(fā)促炎信號(hào)，導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。紅細(xì)胞內(nèi)的TLR9 可清除游離mtDNA，從而減輕肺損傷。Hotz 等通過研究發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞可表達(dá)TLR9，DNA 與紅細(xì)胞的結(jié)合是由TLR9 介導(dǎo)的，紅細(xì)胞可從循環(huán)中清除CpG-DNA，紅細(xì)胞的DNA清除功能缺陷可增強(qiáng)CpG-DNA 介導(dǎo)的肺損傷，表明紅細(xì)胞上TLR9 介導(dǎo)的游離mtDNA 清除對(duì)減輕肺損傷是必要的。

3.2 TLR9 與感染性肺炎

TLR9 可增強(qiáng)流行性感冒（流感）患者繼發(fā)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）感染的易感性。流感病毒屬于單鏈RNA 病毒。人流感病毒分為甲型、乙型及丙型。流感可引起季節(jié)性流行，并可繼發(fā)細(xì)菌性肺炎，如肺炎鏈球菌肺炎和金黃色葡萄球菌肺炎，增加流感患者的病死率。流感病毒感染可誘導(dǎo)IFN-Ⅰ介導(dǎo)的免疫信號(hào)，抑制中性粒細(xì)胞的募集及IL-17 的免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致宿主繼發(fā)細(xì)菌感染的易感性增加。在流感病毒感染繼發(fā)細(xì)菌感染后，機(jī)體代償性募集中性粒細(xì)胞，提高宿主對(duì)細(xì)菌感染的抵抗力。甲型流感病毒（IAV）感染可增加人單核細(xì)胞和DC 中TLR9 的表達(dá)水平。與WT 小鼠相比，TLR9 缺失小鼠對(duì)IAV 或MRSA感染的易感性未見差異；但在IAV 繼發(fā)MRSA 感染后，TLR9 缺失小鼠存活率提高，肺部細(xì)菌清除能力增強(qiáng)，而病毒載量未見差異。另外，在IAV繼發(fā)肺炎鏈球菌感染后，細(xì)菌清除作用沒有改善。以上結(jié)果表明，TLR9 可增強(qiáng)流感繼發(fā)MRSA 的易感性，但對(duì)繼發(fā)性肺炎鏈球菌肺炎的易感性無影響［20-21］。

在鮑曼不動(dòng)桿菌肺炎的小鼠模型中，TLR9 缺失小鼠的肺部細(xì)菌負(fù)荷明顯增加，肺外細(xì)菌播散增多，肺損傷加重，證明TLR9 介導(dǎo)的信號(hào)通路對(duì)于宿主防御鮑曼不動(dòng)桿菌具有重要意義。在肺炎克雷伯菌和肺炎鏈球菌感染的動(dòng)物模型中，TLR9缺失小鼠的病死率升高，細(xì)菌負(fù)荷增多。與WT 小鼠相比，TLR9 缺失小鼠更易感染隱球菌，且IFN-γ 和IL-17 的生成減少，感染后的肺損傷加重，病死率升高，證明在宿主抵御隱球菌感染的過程中TLR9 發(fā)揮了重要作用。以上研究均表明，TLR9 與肺部炎癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但TLR9能否作為治療靶點(diǎn)尚不能下定論，還需要更深入的研究探討。

三、結(jié) 論

TLR9 在免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞的內(nèi)體膜上均有大量表達(dá)，其與配體結(jié)合活化后，通過激活天然和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，在哮喘、肺癌和肺炎等呼吸系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用。TLR9 的配體有可能是預(yù)防及治療呼吸系統(tǒng)上述疾病的潛在治療靶點(diǎn)。目前需要更多的研究來深入了解TLR9 與呼吸系統(tǒng)疾病的相關(guān)致病機(jī)制，為呼吸系統(tǒng)疾病的治療開拓新思路。