應(yīng)用于電阻抗斷層成像檢測及預(yù)測癲癇發(fā)作的動物模型*

王蓉，梁國華，朱文靜，王蕾

(西北工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院，西安 710072)

引言

癲癇是由于大腦神經(jīng)元突發(fā)性異常放電，導(dǎo)致短暫大腦功能障礙的一種神經(jīng)性疾病，影響全球大約5 000萬人，是全球范圍內(nèi)最常見的神經(jīng)性疾病之一。癲癇發(fā)作的特點主要有突然性、不可預(yù)知性以及反復(fù)性[1]。對于癲癇，一部分人仍對其存有恐懼、歧視態(tài)度，這嚴(yán)重影響到患者及其家庭的生活質(zhì)量[2]。

盡管目前大多數(shù)癲癇患者應(yīng)用抗癲癇藥物可得到很好控制，但仍有30%的患者對藥物治療無效，發(fā)展為難治性癲癇(refractory epilepsy，RE)[3]。難治性癲癇占癲癇患者的20%～30%，而僅有50%的難治性癲癇患者適于手術(shù)切除病灶，對于藥物和手術(shù)均無法治療的患者，不僅要持續(xù)承受病痛的折磨，而且癲癇發(fā)作會對大腦造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害。

癲癇外科治療的關(guān)鍵是對癲癇灶的準(zhǔn)確定位。腦電圖檢查是癲癇外科術(shù)前綜合評價的重要組成部分，但對于術(shù)前檢查呈現(xiàn)多個病灶區(qū)、病灶區(qū)位于腦功能區(qū)、現(xiàn)有檢測技術(shù)無法提供明確致癇灶的難治性癲癇患者，手術(shù)治療無法開展。因此，臨床上亟需一種準(zhǔn)確定位癲癇灶的成像技術(shù)。此外，雖然癲癇發(fā)作具有突然性，但有研究表明，癲癇發(fā)作是一個隨時間演化的過程，理論上癲癇發(fā)作預(yù)測具有很高的可行性[4]。影像學(xué)研究已經(jīng)證實，癲癇發(fā)作前期腦血流灌注發(fā)生改變[5]。血液的電阻率為1.6 Ω·m，腦組織的電阻率為4 Ω·m[6]，血液的電阻率明顯低于腦組織的電阻率，癲癇發(fā)作前期腦血流灌注變化會引起致癇灶處電阻率的變化。因此，如能找到一種能夠?qū)崟r反應(yīng)癲癇發(fā)作前期電阻抗變化的檢測技術(shù)，將有可能為癲癇患者帶來新機。

電阻抗斷層成像技術(shù)(electrical impedance tomography，EIT)是一種基于組織阻抗特性進(jìn)行成像的新興技術(shù)，它能夠根據(jù)不同組織的不同電阻抗特性，或同一組織在不同的病理生理狀態(tài)下不同的電阻抗特性進(jìn)行成像。通過給人體注入小的安全電流，測量體表電位來重建人體內(nèi)部的電阻抗分布圖像，是醫(yī)學(xué)成像技術(shù)的一個新方向。其中，動態(tài)電阻抗成像將電阻抗變化以圖像的形式實時動態(tài)顯示，對電阻抗變化敏感、時間分辨率高、功能成像，具有便攜、快速、以及無創(chuàng)等優(yōu)勢[7]。研究表明，EIT是一種對于腦血流灌注變化很敏感的成像技術(shù)，能夠檢測到由腦出血和腦缺血引起的組織阻抗變化[8-9]。實際研究中，EIT也被證實對癲癇發(fā)作較為敏感，能夠檢測到癲癇發(fā)作前期腦血流灌注改變引起的電阻抗變化[10]。

1 EIT應(yīng)用于癲癇疾病領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀

1994年，英國倫敦大學(xué)的Holder首次嘗試將EIT應(yīng)用于癲癇成像的研究，使用與癲癇發(fā)作機制類似的兔的皮質(zhì)擴散抑制模型，初步證實了EIT對癲癇成像的可行性[11]。1997年，Holder電刺激麻醉兔的前爪神經(jīng)制備癲癇模型，檢測到癲癇發(fā)作期間的電阻抗變化，首次實現(xiàn)EIT在動物癲癇發(fā)作過程中成像，但由于技術(shù)限制，該研究并未實現(xiàn)實時監(jiān)測，此外其時空分辨率較差[12]。之后，Holder 小組為探索癲癇發(fā)作與電阻抗變化的相關(guān)性，通過改進(jìn)誘導(dǎo)癲癇發(fā)作的電刺激參數(shù)和注射化學(xué)致癇劑獲得最接近人類癲癇發(fā)作機制的癲癇模型，不斷增加 EIT 系統(tǒng)的采集電極個數(shù)、提高采集精度，以實現(xiàn)EIT對于癲癇發(fā)作的實時成像。2016年，Aristovich等[13]使用30接觸電極墊對大鼠大腦皮層在誘發(fā)電位中的阻抗變化進(jìn)行了EIT成像。雖然該研究首次在ms級對神經(jīng)活動進(jìn)行成像，但是其成像的深度有限，僅局限于大腦皮層。王蕾等[10]2017年使用16電極的EIT系統(tǒng)和腦電的3電極實時監(jiān)測動物模型的癲癇發(fā)作，發(fā)現(xiàn)在癲癇發(fā)作過程中致癇灶處的電阻抗逐漸降低，直至癲癇發(fā)作結(jié)束，但因其在數(shù)據(jù)采集過程中所使用的電極較少，導(dǎo)致采集精度有限。2018年，Hannan等[14]采用電刺激麻醉大鼠誘導(dǎo)癲癇發(fā)作，使用57電極皮層陣列記錄大鼠腦部癲癇發(fā)作過程中快慢阻抗變化的頻率響應(yīng)，得到成像癲癇活動的最佳頻率，但是電刺激模型缺乏細(xì)胞特異性，且電刺激激活區(qū)域不固定。2020年，Hannan等[15]提出了新皮層癲癇ADs( A fterdischarges )模型和海馬癲癇ADs模型，雖然該模型可以嚴(yán)格控制癲癇發(fā)作，但是缺乏細(xì)胞特異性，很難完全模擬人類癲癇活動。2021年，Hannan等[16]使用植入大鼠大腦皮質(zhì)表面的非穿透電極，對大腦皮層和海馬的癲癇發(fā)作過程中的慢阻抗成像，該研究表明癲癇發(fā)作過程中腦組織阻抗緩慢增加，這與文獻(xiàn)[10]研究結(jié)果正好相反。

目前EIT應(yīng)用于癲癇的研究中，有兩種不同的研究結(jié)果。Holder小組檢測到癲癇發(fā)作期間病灶處的阻抗上升，王蕾等[10]則發(fā)現(xiàn)發(fā)作期間病灶處阻抗下降。這種差異可能由以下幾點原因造成：首先，兩項研究中所使用的癲癇模型不同，與化學(xué)模型相比，電刺激模型會有更多的皮質(zhì)錐體神經(jīng)元被激活并同步放電，從而導(dǎo)致更大的阻抗增加[16]。其次，兩項研究中使用的載波頻率也不相同，可能會導(dǎo)致阻抗變化有所不同。此外，兩項研究所關(guān)注的癲癇發(fā)作的時間尺度也不相同，Holder小組主要關(guān)注ms與s時間段內(nèi)的瞬時阻抗變化，而王蕾等[10]關(guān)注的則是癲癇發(fā)作的整個時間段。

綜上，在EIT對于癲癇的研究中，合適的動物模型對于研究結(jié)果至關(guān)重要，隨著EIT采集精度的提高，用于EIT研究的動物模型也需要注重癲癇活動的真實性。在研究中選擇合適的動物模型，會對了解癲癇發(fā)作前期與發(fā)作期間的阻抗變化有所幫助，可為實現(xiàn)用于難治性癲癇發(fā)作檢測和預(yù)測的電阻抗斷層成像新方法奠定基礎(chǔ)。

2 用于EIT的動物癲癇模型

2.1 動物癲癇模型的必要性

研究表明，通過基于人體的研究，了解癲癇發(fā)作機制是非常困難的，需要一套完整的臨床前安全性和有效性證據(jù)，證明研究的臨床進(jìn)展是合理的[17]。因此，實驗?zāi)Ｐ陀兄诖_定癲癇發(fā)生的機制和抗癲癇方法治療的效果[18]。所以對于難治性癲癇的研究，動物模型是闡明癲癇發(fā)生機制和測試新的抗癲癇治療方法的寶貴工具[19]。

動物癲癇模型既克服了人體研究的不足，且癲癇發(fā)作條件可控，又易于取得腦組織標(biāo)本，用于難治性癲癇發(fā)病機制的研究。但是所有動物模型都只是人類疾病復(fù)雜系統(tǒng)的近似值，因此，對于所得的實驗結(jié)果都應(yīng)該謹(jǐn)慎對待，這是全部動物模型的固有特性。此外，與人類自發(fā)性癲癇發(fā)作相比，某些動物模型的誘發(fā)機制可能有所不同[20]。根據(jù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的定義，模型無需是臨床條件的完美復(fù)制，重要的是模型提供的驗證適合實驗?zāi)康腫21]。

2.2 常見的癲癇動物種類

癲癇模型在各種實驗動物中都有研究，從簡單的生物、非哺乳類生物[22]到非人類靈長類動物。常見的實驗動物主要有大鼠、小鼠[23]、貓[24]、兔子、豬、狒狒[25]、獼猴[26]等。

其中，大鼠和小鼠是最常用的兩種實驗動物，因為它們體型小、溫順、繁殖快，尤其可以很好地概括人類癲癇背后的致病機制、人類狀況的表型特征和臨床上看到的治療反應(yīng)[27]，并且長期研究所需的成本和維護(hù)要求較低[28]。此外，作為疾病模型大鼠更具優(yōu)勢，其體型較大，因此能夠容納更多的電極[15]，且大鼠身體素質(zhì)較高，癲癇模型死亡率較低。

2.3 已應(yīng)用于EIT研究的化學(xué)癲癇模型

化學(xué)誘導(dǎo)的癲癇模型最常見的物質(zhì)是驚厥藥物，如海人酸、青霉素和匹羅卡品等。在全身或顱內(nèi)注射后，這些藥物會觸發(fā)持續(xù)性癲癇(status epilepticus，SE)，在經(jīng)歷潛伏期后引發(fā)癲癇的發(fā)作和自發(fā)性反復(fù)發(fā)作( SRS )[29]。

海人酸模型是研究癲癇發(fā)生和相關(guān)病理變化最常用的動物模型之一?？扇斫o藥或海馬內(nèi)注射[17]，給藥后48 h內(nèi)，大鼠普遍出現(xiàn)SE，引起組織的廣泛損傷，與人類難治性癲癇病理特征相似[30]。海人酸模型的優(yōu)越性在于較低的死亡率[31]。匹羅卡品是一種毒蕈堿乙酰膽堿受體激動劑，腹腔注射匹羅卡品可以成功地誘發(fā)癲癇發(fā)作。匹羅卡品癲癇模型的神經(jīng)病理變化與癲癇患者的相似[32]。該模型的顯著缺點是在全身給藥后，包括海馬體、杏仁核在內(nèi)的多個大腦區(qū)域均會產(chǎn)生廣泛損傷，病變范圍更廣[33]，但是匹羅卡品模型的可靠性較高。研究表明，幾乎所有腹腔注射匹羅卡品的大鼠都會發(fā)生自發(fā)性癲癇[34]。青霉素是目前應(yīng)用最廣泛的急性致癇劑，也是最常應(yīng)用于EIT研究中的化學(xué)致癇劑。

2016年，Vongerichten使用4-氨基吡啶(4-AP)、印防己毒素或青霉素三種化學(xué)致癇劑分別注入麻醉大鼠大腦皮層內(nèi)制備癲癇模型，該研究首次關(guān)注了癲癇發(fā)作間期的阻抗變化。由于青霉素是典型的急性致癇劑，未觀察到其發(fā)作間期的阻抗變化。三種模型都選擇深入大腦皮層1 mm局部注射致癇劑，未考慮到針頭可能會對大腦皮層造成損傷，進(jìn)而引起組織阻抗發(fā)生變化。王蕾等[10]在2017年也使用了青霉素誘導(dǎo)的大鼠急性癲癇模型，成功地從大鼠的大腦皮層記錄到多次癲癇發(fā)作。研究發(fā)現(xiàn)，在青霉素注射部位，大多數(shù)癲癇發(fā)作期間電阻抗降低，且直至癲癇發(fā)生結(jié)束，此變化與生理鹽水對照組的電阻抗變化具有顯著性差異。該研究結(jié)果還提示致癇灶處電阻抗降低在癲癇發(fā)作前就已出現(xiàn)，該結(jié)果對于EIT在癲癇發(fā)作預(yù)測領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。但是青霉素癲癇模型是典型的急性癲癇模型，在注射后20～30 min后就會誘發(fā)癲癇發(fā)作，因此，并未有足夠的時間研究其發(fā)作間期的阻抗變化。2021年Witkowska-Wrobel等[35]提出了豬的癲癇模型，該模型是在豬的腦內(nèi)注射青霉素誘發(fā)急性癲癇發(fā)作。研究表明，在豬腦中單次顱內(nèi)注射BPN可導(dǎo)致癲癇發(fā)作。豬腦在大小、大體解剖學(xué)和發(fā)育程度上與人腦相似，因此，該模型可以更好地反映臨床情況下的人腦。但是研究過程中未考慮到局部注射可能會造成阻抗變化，且急性癲癇模型與人類難治性癲癇發(fā)作機制可能有所不同。各化學(xué)癲癇模型見表1。

表1 目前已應(yīng)用于EIT研究的化學(xué)癲癇模型

2.4 已應(yīng)用于EIT研究的物理癲癇模型

動物的物理癲癇模型具有在完整的大腦中復(fù)制致癇特征的優(yōu)勢，死亡率低、可重復(fù)性高。此外，與化學(xué)誘發(fā)癲癇相比，當(dāng)致癇條件不再存在時，可以研究電刺激引起的術(shù)后改變，但電刺激模型無法提供大腦細(xì)胞類型的特異性[36]。

電刺激誘發(fā)癲癇是目前研究最多的電刺激模型之一，使用方便，無需立體定向植入電極。單誘發(fā)癲癇后放電模型(AD)是電刺激的另一重要方法，是在大腦的特定區(qū)域誘發(fā)。AD 常用于研究局灶性癲癇的電生理學(xué)特性[37]。點燃是研究最多的電刺激模型。點燃指的是一種癲癇誘發(fā)的可塑性現(xiàn)象，即通過電刺激特定的大腦區(qū)域重復(fù)誘發(fā)AD，從而引起癲癇易感性的逐步增強[38]。電刺激癲癇模型是EIT研究領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的癲癇模型之一。

1994年，Boone等[11]使用了與癲癇發(fā)作類似的兔的皮質(zhì)擴散抑制模型初步證實EIT對于神經(jīng)功能活動成像的可行性，皮質(zhì)擴散性抑制模型是由0.6～1.5 mA的直流電刺激麻醉兔的大腦皮層30～60 s引起的，刺激強度均足以誘發(fā)擴散性抑制。雖然該研究首次證明EIT在神經(jīng)活動成像的可行性，但是他們在動物實驗中并未考慮到由大腦干燥、刺激偽影帶來的誤差影響，最重要的是兔的皮質(zhì)抑制模型只是發(fā)作機制與人類癲癇相似，但是無法完全模擬癲癇發(fā)作機制。 2016年，Aristovich等[13]使用電壓刺激器刺激大鼠對角相鄰的晶須造模，獲得麻醉大鼠皮層活動的第一張EIT圖像，但是該模型僅模擬了大鼠快速電活動發(fā)作時的皮層活動，并未深入大腦其它區(qū)域，穿透深度有限，其次該研究使用的模型是與癲癇發(fā)作類似的快速電活動，并非真實的癲癇。2018年，Hannan通過電刺激麻醉大鼠感覺運動皮層制備急性癲癇模型。與化學(xué)模型相比，間歇性電刺激皮質(zhì)組織不會導(dǎo)致局部神經(jīng)回路不可逆轉(zhuǎn)的變化，因此，電刺激模型表現(xiàn)的時間依賴性變化最小。此外，模型的發(fā)作時間可以受到嚴(yán)格的控制，能夠合理控制實驗進(jìn)程。然而，雖然電刺激的活動中心在空間上局限于體感皮質(zhì)的顆粒下層，但實際激活的體積仍可能超過較淺表的皮質(zhì)層，同時電刺激模型最顯著的缺點在于其缺乏神經(jīng)細(xì)胞的特異性。2020年，Hannan提出了海馬癲癇ADs模型[39]與新皮質(zhì)癲癇ADs模型[15]，是通過電刺激麻醉大鼠的穿支通路和感覺運動皮層從而誘發(fā)癲癇。這兩種模型的優(yōu)點在于能夠頻繁地誘導(dǎo)可重現(xiàn)的癲癇發(fā)作，通常表現(xiàn)出比化學(xué)模型更小的電信號變異性，從而能夠完全控制研究進(jìn)程。但是它缺乏細(xì)胞類型特異性，無法影響特定神經(jīng)元組的放電特征。與化學(xué)癲癇模型相比，它不能提供最真實的人類難治性癲癇模型。各電刺激癲癇模型見表2。

綜上，目前已應(yīng)用于EIT研究的動物癲癇模型存在一定的局限性，在尚未完全掌握癲癇發(fā)作前期及發(fā)作期電阻抗變化規(guī)律前，需要提出一種適合于EIT研究的動物癲癇模型，用于難治性癲癇檢測及預(yù)測方法的研究。為了滿足研究需求，所尋找的動物癲癇模型需要滿足以下幾點要求：(1)癲癇模型在行為學(xué)、神經(jīng)病理學(xué)、腦電圖特征等方面與真實的人類難治性癲癇相似，否則缺乏說服力；(2)要有明確的發(fā)作間期與發(fā)作期，目前對于癲癇發(fā)作期間電阻抗的變化仍存在爭議，合適的動物模型的提出可能對探索癲癇發(fā)作期間阻抗變化提供支持，明確的發(fā)作間期與發(fā)作期為實現(xiàn)癲癇預(yù)測提供可能性；(3)選擇合適的麻醉劑對動物進(jìn)行麻醉，以消除癲癇發(fā)作過程中的運動偽影；(4)所選模型具有一定的穩(wěn)定性，可重復(fù)多次發(fā)生癲癇活動，以便能夠評估重建的準(zhǔn)確性。

表2 目前已應(yīng)用于EIT研究的電刺激誘導(dǎo)的癲癇動物模型

3 有可能適用于EIT研究的動物癲癇模型

動物的癲癇模型種類繁多，但是若想應(yīng)用于EIT的研究中，需考慮多方面因素。首先，由于EIT的工作特點，化學(xué)致癇劑誘導(dǎo)的癲癇模型可能更適用于EIT的研究。EIT是通過對待測物表面施加安全激勵電流或電壓，同時測量物體表面的電壓或電流信號，進(jìn)而重建圖像，而在電刺激模型中，同樣需要對模型施加一定電流，以誘導(dǎo)癲癇的發(fā)作。那么在實驗過程中，很難排除電刺激對于EIT信號采集的干擾。化學(xué)致癇劑一般分為全身和局部注射，局部注射時針頭的插入可能會造成部分組織損傷，影響組織的阻抗變化。雖然全身注射誘導(dǎo)效果稍遜色，但也排除了受損組織阻抗變化對于EIT數(shù)據(jù)采集的影響?；瘜W(xué)誘導(dǎo)的癲癇模型可分為慢性和急性，急性模型發(fā)作強烈，神經(jīng)元的參與程度遠(yuǎn)超于人類癲癇發(fā)作，其機制可能與人類癲癇發(fā)作不同；其次，急性模型只能持續(xù)幾分鐘到幾個小時，不會反復(fù)發(fā)作，這對于EIT的長期監(jiān)測不利；另外，急性模型的死亡率一般較高，實驗成本較大，而慢性模型雖然實驗周期較長，但是模型存活率較高，且更接近人類癲癇。

綜上，若能尋找到一種通過全身注射某種化學(xué)致癇劑誘導(dǎo)的慢性動物癲癇模型，且該模型的行為學(xué)、病理學(xué)以及腦電特征與人類難治性癲癇具有很高的相似性，模型構(gòu)造過程中未引起組織阻抗的變化，將有可能會為EIT在癲癇疾病領(lǐng)域的研究提供幫助。

4 展望

EIT作為一種新興蓬勃的醫(yī)學(xué)成像技術(shù)，已經(jīng)在癲癇研究領(lǐng)域展示了其與眾不同的優(yōu)勢。對于無法確定致癇灶的難治性癲癇患者，EIT功能成像的優(yōu)勢可以用來輔助腦電定位致癇灶。其次，EIT作為一種對癲癇發(fā)作較為敏感的成像技術(shù)，若能夠輔助腦電在癲癇發(fā)作前期就檢測到腦血流灌注的變化，及時給予干預(yù)治療，可減輕癲癇患者的痛苦。

合適的動物模型是研究的基礎(chǔ)，也是關(guān)鍵。若尋找到與人類難治性癲癇發(fā)作類似的、有明確且足夠長的發(fā)作期與發(fā)作間期的動物難治性癲癇模型，通過腦電特征波確定癲癇發(fā)作期，探索癲癇發(fā)作前期及發(fā)作期間的阻抗變化規(guī)律，提取電阻抗變化的特征參數(shù)，利用癲癇發(fā)作前期電阻抗變化特征信息實現(xiàn)EIT實時預(yù)測癲癇發(fā)作，就能為實現(xiàn)癲癇預(yù)測提供新方法，為難治性癲癇患者帶來新機遇。