信號素3F對大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移的影響*

姚麗娜， 車雅男， 時偉， 趙娜

(河北省保定市第二中心醫(yī)院， 保定 071000)

心肺復(fù)蘇后心肌功能障礙被認(rèn)為是住院患者死亡的主要原因之一[1]。任何類型的組織損傷都會引起免疫系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)，其特征是白細(xì)胞從毛細(xì)血管后的小靜脈局部遷移到發(fā)炎的組織中[2]。在此過程中，白細(xì)胞從血流中通過緊密相鄰的內(nèi)皮細(xì)胞邊界(細(xì)胞旁)或通過內(nèi)皮細(xì)胞本身(跨細(xì)胞)移動[3],細(xì)胞間連接分子如血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1)參與白細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移[4]。PECAM-1是免疫球蛋白家族的成員，在血小板、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞亞群和內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)[5]。信號素3F是信號素家族的分泌成員，最初在發(fā)育中的大腦中被鑒定為神經(jīng)元指導(dǎo)分子[6]。在神經(jīng)系統(tǒng)之外，信號素3F在腫瘤和血管生物學(xué)中起著重要作用[7]。在過去幾年中，信號素3F已被確定為血管生成、腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的有效抑制劑[8]。信號素3F主要通過叢蛋白A1和神經(jīng)氈蛋白2(neuropilin 2，NRP2)組成的受體復(fù)合物在內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)出信號[9]。NRP2是一種跨膜糖蛋白，對于淋巴管和毛細(xì)血管的正常形成至關(guān)重要[10]。盡管信號素3F在血管生物學(xué)中具有公認(rèn)的重要性，但尚未見信號素3F在內(nèi)皮炎癥和白細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用的研究[11]。本文旨在探究信號素3F對心臟驟停存活心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及白細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 20只16～18周齡的(SPF級)雄性Sprague-Dawley大鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[許可證編號北京 SYXK(京)2017-0033]。

1.1.2試劑與設(shè)備 活性氧(reactive oxygen species，ROS)、過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ，SOD)及丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，RNeasy Mini試劑盒購自凱杰公司，SYBR-Green購自上海賽默飛世爾科技有限公司，二辛可寧酸測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，抗PECAM-1兔多克隆抗體(1 ∶1 000)、抗NRP2兔多克隆抗體(1 ∶1 000)、抗GAPDH兔多克隆抗體(1 ∶800)與山羊抗兔二抗均購自上海艾博抗貿(mào)易有限公司。研究獲動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號2020-1215A)。

1.2 方法

1.2.1動物分組 20只造模大鼠，實現(xiàn)心臟驟停18只，2只表現(xiàn)為一條直線、未誘出持續(xù)性室顫、誘導(dǎo)心臟驟停失敗。將18只成功誘導(dǎo)出心臟驟停的大鼠，在自主循環(huán)恢復(fù)之后，隨機(jī)均分為信號素3F組和模型組，信號素3F組大鼠大鼠尾靜脈注射重組信號素3F(50 ng/g ，500 μL)；模型組注射生理鹽水，1次/d，共注射3 d。另外篩選9只健康大鼠作為對照組。

1.2.2心臟驟停心肺復(fù)蘇模型 大鼠腹膜內(nèi)注射3.6%水合氯醛(10 mL/kg)麻醉仰臥于鼠手術(shù)臺上采用容量控制呼吸機(jī)(中國廣東省心肺腦復(fù)蘇研究所)進(jìn)行通氣，潮氣量為6 mL/kg，頻率為100次/min，連接到電刺激器(中國廣東省心肺腦復(fù)蘇研究所)的2個胸前針電極誘導(dǎo)心臟驟停，連續(xù)電刺激(2～3 mA)直至心室纖維性顫動(ventricular fibrillation，VF)，成功誘導(dǎo)VF后，停止機(jī)械通氣；心臟驟停約5 min后，使用100%氧氣以100次/min的氣管內(nèi)通氣開始動物心肺復(fù)蘇。用動物心肺復(fù)蘇器以200次/min的速度進(jìn)行機(jī)械胸部按壓，壓縮深度為大鼠前、后胸徑的1/3(中國廣東省心肺腦復(fù)蘇研究所)。在自主循環(huán)恢復(fù)后3 h，再次測量動脈血氣以觀察酸堿參數(shù)。

1.2.3標(biāo)本收集 造模成功后24 h后對大鼠麻醉處死，取各組大鼠的心肌組織，通過langendoff裝置分離心肌細(xì)胞。

1.2.4檢測心肌細(xì)胞內(nèi)ROS和H2O2水平 干預(yù)后1 h，使用ROS和H2O2測定試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)ROS和H2O2水平。將心肌細(xì)胞與10 μmoL DCFH-DA探針在37 ℃下孵育35 min，用PBS洗滌細(xì)胞1次，并在黑暗中于37 ℃與MitoSOX Red(5 μmoL)一起溫育10 min，通過流式細(xì)胞術(shù)(流式細(xì)胞儀型號：BD LSRFortessa X-20)分析熒光。

1.2.5檢測心肌細(xì)胞內(nèi)MDA和SOD含量 通過ELISA試驗檢測MDA和SOD含量。根據(jù)試劑盒的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或作為抗凝劑，然后加入10%(V/V)抗凝劑(0.1 mo1/L檸檬酸鈉或1% heparin 或2.0% EDTA溶劑)混合大約15 min后，3 000 r/m離心20 min，收集樣本上清液；將樣品加于酶標(biāo)板底部，輕輕晃動混勻、室溫溫育、洗滌，定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化，避免反應(yīng)過強(qiáng)影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。

1.2.6腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和干擾素-γ(IFN-γ)表達(dá) 使用RNeasy Mini試劑盒提取總RNA，用Superscript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)為cDNA，通過具有SYBR-Green化學(xué)的ABI7000定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行qPCR，以GAPDH為內(nèi)參基因。qPCR反應(yīng)體積為20 μL，由1×PCR SYBR-Green緩沖液、0.125 μmol/L引物、200 μmol/L每種dNTP、2 mmol/L MgCl2和0.025 U/μL AmpliTaqGold組成。 擴(kuò)增參數(shù)為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，35個循環(huán)，引物序列見表1。特定樣品達(dá)到任意熒光閾值(Ct)的循環(huán)與輸入模板的量成比例。

表1 qPCR引物序列Tab.1 qPCR primer sequence

1.2.7腹腔灌洗液中白細(xì)胞數(shù)量 利用生理鹽水灌洗大鼠腹腔5 min，無菌狀態(tài)下吸出灌洗液，適當(dāng)稀釋倍數(shù)后并吹勻，吸出20 μL注入血細(xì)胞計數(shù)板的計數(shù)池內(nèi)，等待1 min至計數(shù)池內(nèi)細(xì)胞分布均勻，光學(xué)顯微鏡下數(shù)出計數(shù)池內(nèi)四角4個大方格內(nèi)白細(xì)胞數(shù)量，每個細(xì)胞液樣本均計數(shù)3次。

1.2.8心肌PECAM-1和NRP2的蛋白含量 使用二辛可寧酸測定試劑盒測定心肌提取物中的蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)(50 mg)在6%或10% SDS-PAGE上分離，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。用含有Tween-20的Tris緩沖鹽水中的5%脫脂牛奶封閉膜，分別加入抗PECAM-1兔多克隆抗體(1 ∶1 000)、抗NRP2兔多克隆抗體(1 ∶1 000)、抗GAPDH兔多克隆抗體(1 ∶800)，在4 ℃冰箱孵育過夜。用含Tween-20的Tris緩沖鹽水漂洗膜，并在室溫下與二抗山羊抗兔IgG孵育1 h。使用ECL試劑檢測蛋白質(zhì)，Quantity One 1-D分析軟件計算光密度，NMDAR1、Beclin-1和Parkin水平歸一化為GAPDH。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ROS和H2O2含量

與模型組比較，信號素3F組大鼠心肌細(xì)胞中 ROS和H2O2含量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖1。

表2 各組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)ROS和H2O2 含量比較Tab.2 Comparison of ROS and H2O2 contents in cardiomyocytes of all

圖1 各組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)ROS和H2O2含量(流式細(xì)胞圖)Fig.1 Contents of ROS and H2O2 in cardiomyocytes of all groups (flow cytometry)

2.2 心肌細(xì)胞內(nèi)MDA和SOD含量

與模型組比較，信號素3F組MDA和SOD含量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示信號素3F促進(jìn)心臟驟停大鼠存活的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激。見表3。

表3 各組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)MDA和SOD含量比較Tab.3 Comparison of MDA and SOD contents in cardiomyocytes of all

2.3 心肌細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IFN-γ mRNA表達(dá)

與模型組比較，信號素3F組大鼠心肌細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和IFN-γ mRNA表達(dá)量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示信號素3F促進(jìn)心臟驟停大鼠存活的心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)。見表4、圖2。

表4 各組大鼠心肌細(xì)胞TNF-α、IL-1β和 IFN-γ mRNA表達(dá)量比較Tab.4 Comparison of TNF- α, IL-1β, and IFN-γ mRNA expression in cardiomyocytes of all groups

2.4 腹腔灌洗液中白細(xì)胞數(shù)

與模型組[(58.37±5.84) 109/L]比較，信號素3F處理組[(167.23±12.26) 109/L]大鼠腹腔灌洗中白細(xì)胞計數(shù)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示信號素3F促進(jìn)心肌驟停大鼠的白細(xì)胞外滲到腹膜腔中。

2.5 心肌PECAM-1、NRP2蛋白表達(dá)

與模型組比較，信號素3F組大鼠心肌組織PECAM-1和NRP2蛋白表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示信號素3F促進(jìn)心臟驟停大鼠白細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移。見圖2。

注：(1)與模型組比較，P<0.05。圖2 PECAM-1和NRP2蛋白表達(dá)量Fig.2 The protein expressions of PECAM-1 and NRP2

3 討論

本研究揭示了信號素3F在心臟驟停存活心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及白細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移的作用，證明重組信號素3F導(dǎo)致大鼠心臟驟停模型中氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及炎癥部位白細(xì)胞積聚增加。本研究中，信號素3F組ROS、H2O2、MDA和SOD含量與模型組相比增加，說明信號素3F促進(jìn)心臟驟停存活心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激。心臟驟停即猝死是世界性的人們的主要死亡原因之一，嚴(yán)重危及公眾的生活。達(dá)到自主循環(huán)恢復(fù)后，全身缺血/再灌注損傷導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞和免疫系統(tǒng)的激活，導(dǎo)致心臟驟停后綜合征(post-cardiac arrest syndrome，PCAS)[12]。除腦損傷外，PCAS還包括心肌功能障礙，血流動力學(xué)不穩(wěn)定和膿毒癥樣炎癥綜合征，強(qiáng)烈預(yù)測心臟驟停后的預(yù)后不良[13]。越來越多的證據(jù)表明心臟驟停患者的血清含有多種炎性細(xì)胞因子，包括TNFα、IL-1、IL-6、IL-8和IL-10，它們引起內(nèi)皮炎癥反應(yīng)并有助于病理生理學(xué)研究[14]。本研究證實了信號素3F組TNF-α、IL-1β和IFN-γmRNA表達(dá)量與模型組相比增加，說明信號素3F促進(jìn)心臟驟停存活心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，該觀察結(jié)果與以前的研究一致，即信號素是已知的缺血/再灌注損傷調(diào)節(jié)劑。信號素3A在腎臟缺血/再灌注損傷后上調(diào)，并且抑制信號素3A免于急性腎損傷[15]。另一項研究表明，信號素7A通過抑制中性粒細(xì)胞募集減少了肝臟的缺血/再灌注損傷[16]。本研究結(jié)果表明，信號素3F是心臟驟停后全身缺血/再灌注損傷的新型參與者。

研究表明，信號素家族成員是免疫系統(tǒng)的中樞調(diào)節(jié)因子，并在炎癥過程中差異控制白細(xì)胞遷移[17]。信號素7A增加了中性粒細(xì)胞的遷移并加重了肺部炎癥。信號素3A可阻滯單核細(xì)胞遷移并減少心肌梗死后的炎癥。盡管其在血管生物學(xué)調(diào)節(jié)中的重要性，但在心臟驟停期間信號素3F/NRP2信號傳導(dǎo)的功能和機(jī)制尚不完全清楚[18]。本研究的主要發(fā)現(xiàn)是信號素3F/NRP2信號傳導(dǎo)在體內(nèi)發(fā)揮促炎作用，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激并增加白細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移。信號素3F和NRP2信號傳導(dǎo)與不同環(huán)境中的白細(xì)胞遷移相關(guān)，信號素3F/NRP2信號傳導(dǎo)減少了胸腺細(xì)胞和惡性T細(xì)胞的遷移[19]。另一項研究報道，在脂多糖吸入后，NRP2的髓樣特異性消融改變了支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞亞群的組成，表明髓樣細(xì)胞中的NRP2參與了氣道炎癥的病理生理學(xué)[20]。這些研究與本研究的觀察結(jié)果一起證實了信號素3F/NRP2信號傳導(dǎo)是炎癥期間的重要途徑。白細(xì)胞遷移需要在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)PECAM-1。盡管PECAM-1在炎癥生物學(xué)中起關(guān)鍵作用，但對內(nèi)皮細(xì)胞中PECAM-1表達(dá)的調(diào)節(jié)知之甚少。本研究提供了對PECAM-1表達(dá)調(diào)控的新見解，并將PECAM-1鑒定為內(nèi)皮細(xì)胞中信號素3F/NRP2信號傳導(dǎo)的下游靶標(biāo)。

綜上所述，信號素是炎癥和控制炎癥細(xì)胞遷移過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，信號素3F可能影響心臟驟停存活心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及白細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移。