艾迪注射液對(duì)H22肝癌模型小鼠組織中阿霉素和阿霉醇分布的影響*

王艷麗， 朱曉青， 孫佳， 李勇軍， 劉春花， 陸苑**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 & 省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550004; 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球發(fā)病率第6、死亡率第4的惡性腫瘤疾病[1]，由于其具有較強(qiáng)的隱匿性，多數(shù)HCC患者就診時(shí)病情已達(dá)晚期[2]。盡管已經(jīng)研究出多種針對(duì)HCC的治療手段，但對(duì)于無(wú)法切除的中晚期HCC，可供選擇的治療方式非常有限，藥物化療依然是主要的手段[3]。阿霉素(doxorubicin, DOX)是HCC常用的化療藥物之一，但其臨床應(yīng)用受到以心臟毒性為主的多種毒副作用的限制[4]，DOX的主要活性代謝產(chǎn)物阿霉素醇(doxorubicinol, DOXol)是造成心臟毒副作用的主要原因[5]。艾迪注射液(aidi injection, ADI)是癌癥治療中常用的中藥制劑之一，由斑蝥、人參、黃芪、刺五加提取物組成，具有益氣扶正、祛邪攻毒的功效，在《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》(2019年版)中也明確將ADI納入輔助治療藥物之一[6]，研究認(rèn)為ADI聯(lián)合化療藥物可降低后者的毒性，提高臨床療效，改善患者生存質(zhì)量[7-8]。長(zhǎng)期聯(lián)合用藥時(shí)，中藥易對(duì)藥物代謝動(dòng)力學(xué)的體內(nèi)過程產(chǎn)生影響，改變藥物體內(nèi)分布，影響治療效果甚至造成毒副作用[9]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)ADI和DOX聯(lián)用時(shí)，ADI能夠顯著提高二乙基亞硝胺(n-nitrosodiethylamine，DEN)誘導(dǎo)的HCC大鼠體內(nèi)DOX和DOXol的血藥濃度[10]。鑒于有關(guān)ADI對(duì)DOX和DOXol在機(jī)體內(nèi)其它部位分布的研究報(bào)道較少，再加上DEN誘導(dǎo)的動(dòng)物肝癌模型建模周期長(zhǎng)、造模過程中死亡率較高等缺點(diǎn)[11-12]，本研究采用H22細(xì)胞肝癌模型小鼠，進(jìn)一步探究ADI與DOX聯(lián)用對(duì)DOX和DOXol藥物的體內(nèi)分布影響，為ADI與DOX的合理臨床用藥方案奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1儀器 ACQUITY UPLC型超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜串聯(lián)儀(美國(guó)Waters)，F(xiàn)orma 905-ULTS1490型醫(yī)用低溫冰箱(美國(guó) Thermo Fisher)，ALLEGRA X-30R型離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter)，IMS-20全自動(dòng)雪花制冰機(jī)(常熟市雪科電器有限公司)，KQ-300DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，ZH-2型渦旋混合器(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠)，XYN-15LP型氮吹儀氮?dú)獍l(fā)生器(上海析友分析儀器有限公司)。

1.1.2材料 H22小鼠肝癌細(xì)胞株購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司，艾迪注射液(批號(hào)20200303，規(guī)格10 mL/支)由貴州益佰有限責(zé)任公司提供，注射用鹽酸多柔比星(批號(hào)1910E1)購(gòu)自深圳萬(wàn)樂藥業(yè)有限公司，阿奇霉素(純度>98%，批號(hào) J1229A)購(gòu)于大連美侖生物科技有限公司，阿霉素醇對(duì)照品(純度>98%，批號(hào) GC43565)購(gòu)于美國(guó) GlpBio公司，色譜級(jí)甲酸購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜乙腈購(gòu)自德國(guó)Merck公司，其余溶劑均為分析純。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性ICR小鼠(18～22 g)，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，許可證編號(hào)SCXK(遼)2020-0001。動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)在相對(duì)溫度18～25 ℃，相對(duì)濕度50%～70%的環(huán)境中，所有動(dòng)物養(yǎng)護(hù)和實(shí)驗(yàn)研究均嚴(yán)格遵守國(guó)家衛(wèi)生研究院動(dòng)物養(yǎng)護(hù)和使用指南，并經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(1801207)。

1.2 研究方法

1.2.1H22細(xì)胞培養(yǎng)及收集 H22細(xì)胞用含10%胎牛血清(FBS)和1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代，細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，每2～3 d傳代1次；將細(xì)胞收集至離心管中，于1 000 r/min離心5 min，離心后吸去上清液，管底細(xì)胞沉淀加入適量培養(yǎng)基重懸后置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)；收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，通過臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行染色，細(xì)胞存活率需大于95%，使用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個(gè)/mL，用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.2.2動(dòng)物造模及分組給藥 取24只健康雄性ICR小鼠，體質(zhì)量18～22 g，取1.2.1項(xiàng)下獲得的H22細(xì)胞懸液0.2 m射于小鼠右側(cè)腋皮下，當(dāng)小鼠腋下長(zhǎng)出米粒大小包塊即造模成功。造模成功以后將小鼠隨機(jī)分為DOX單次給藥組(SDOX組)、DOX多次給藥組(MDOX組)和ADI聯(lián)合MDOX組(AMDOX組)，SDOX組連續(xù)14 d每天腹腔給予20 mL/kg生理鹽水、于第15天腹腔注射3 mg/kg DOX，MDOX組連續(xù)15 d隔天腹腔注射3 mg/kg的DOX，AMDOX組連續(xù)15 d每天腹腔注射20 mL/kg ADI，隔天腹腔注射3 mg/kg DOX，觀察各組小鼠的一般狀況。分別于末次給藥2 h后眼眶取血，在室溫下靜置約20 min，離心(3 000 r/min，20 min)后收集上清備用，于-20 ℃冷凍保存。脫頸處死小鼠，取腫瘤、心、肝、腎等組織，清洗殘血稱重后，將各組織與生理鹽水按1 ∶2的重量比進(jìn)行勻漿，勻漿液于-20 ℃保存?zhèn)溆?，臨用前解凍。

1.2.3溶液配制及樣品處理 DOX標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取DOX對(duì)照品適量，加50%甲醇充分溶解，得1 g/L的 DOX儲(chǔ)備液，-20 ℃保存?zhèn)溆?。DOXol標(biāo)準(zhǔn)溶液：在1 mg的DOXol對(duì)照品瓶中加入50%甲醇1 mL充分溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL的容量瓶中定容至刻度，得200 mg/L的DOXol儲(chǔ)備液，分裝為1 mL/支，-80 ℃保存；取一支儲(chǔ)備液定容至10 mL，得濃度為20 mg/L的DOXol標(biāo)準(zhǔn)溶液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?內(nèi)標(biāo)溶液配制：精密稱阿奇霉素適量至5 mL容量瓶中，用30%甲醇溶解并定容至刻度，得100 mg/L的內(nèi)標(biāo)溶液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4樣品處理 100 μL血清和組織勻漿液室溫融化后，加入20 μL的內(nèi)標(biāo)溶液，用5%的甲酸甲醇500 μL進(jìn)行蛋白沉淀，渦混1 min，于-20 ℃冷凍30 min，超聲5 min，14 000 r/min 離心10 min，上清液用氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)苡?0%甲醇500 μL溶液中、14 000 r/min離心10 min，用UPLC-MS/MS分析。

1.2.5分析方法 根據(jù)課題組前期確定的分析方法進(jìn)行本次實(shí)驗(yàn)研究[10,13]，UPLC色譜條件采用Acquity UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相為0.1%甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脫條件為0～0.5 min、10%～30% A，0.5～1.5 min、30%～60% A，1.5～2.0 min、60%～90% A，2.0～3.0 min、90%～10% A，3.0～4.0 min、10%～90% A，4.0～5.0 min、90%～5% A；柱溫45 ℃，流速0.35 mL/min，進(jìn)樣體積2 μL。質(zhì)譜條件采用電噴霧電離源(ESI)，選擇多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式(MRM)正模式；去溶劑氣氮?dú)猓魉?0 00 L/h，溫度600℃；碰撞氣氬氣，流速50 L/h；檢測(cè)離子DOX [M+H]+為m/z 544.7，DOXol [M+H]+為m/z 546.3，阿奇霉素[M+H]+為m/z 749.6，錐孔電壓分別為 25、30、30 V，碰撞電壓分別為 25、25、25 eV。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0.1軟件對(duì)各組結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05代表結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H22移植瘤小鼠體內(nèi)DOX的組織分布

與SDOX組小鼠比較，MDOX組小鼠各組織中DOX的含量均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與MDOX組比較，ADOX組小鼠腫瘤中DOX含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明ADI增強(qiáng)DOX腫瘤治療效果可能是通過增加DOX在靶部位藥物濃度而實(shí)現(xiàn)；ADI與DOX聯(lián)用后，DOX在其余組織中均表現(xiàn)出降低趨勢(shì)，其中以血清和心臟中變化最為顯著，說明ADI降低DOX的心臟毒性作用可能是通過降低DOX在心臟中的蓄積實(shí)現(xiàn)(由于血清中DOX和DOXol的含量相比其它組織較低，故圖中未表現(xiàn))。見表1和圖1。

表1 3組H22移植瘤小鼠各組織中DOX的含量(n=6)Tab.1 The concentrations of DOX in H22 HCC-bearing mice in each group(n=6)

注：(1)與SDOX組比較,P<0.05；(2)與MDOX組比較,P<0.05。圖1 H22移植瘤小鼠各治療組中阿霉素的分布Fig.1 Biodistribution of DOX in H22 HCC-bearing mice in each group

2.2 H22移植瘤小鼠體內(nèi)DOXol的組織分布

除DOXol在血清中的含量低于定量限外，其余組織部位均能準(zhǔn)確檢測(cè)DOXol的含量。結(jié)果表明，與SDOX組小鼠比較，MDOX組小鼠各組織中DOXol的蓄積均明顯增加；聯(lián)合用藥后，DOXol除在腫瘤中的含量有增加趨勢(shì)外，其余組織中均表現(xiàn)出不同程度的降低，其中以心臟和肺的累計(jì)變化最為顯著，表明ADI發(fā)揮增效作用可能是通過提高DOXol在腫瘤部位的分布達(dá)到目的；此外，ADI還能在不同程度上減少DOXol在其它部位的蓄積。見表2和圖2。

表2 3組H22移植瘤小鼠各組織中DOXol含量Tab.2 The concentrations of DOXol in H22 HCC-bearing mice in each

注：(1)與SDOX組比較, P<0.05；(2)與MDOX組比較,P<0.05。圖2 H22移植瘤小鼠各治療組中阿霉素醇的分布(n=6)Fig.2 Biodistribution of DOXol in H22 HCC-bearing mice in each group(n=6)

3 討論

HCC是最常見的原發(fā)性肝癌，具有高復(fù)發(fā)率、高轉(zhuǎn)移率、隱匿性強(qiáng)以及預(yù)后差等特點(diǎn)[2]。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，治療選擇也趨于多樣化，目前主要包括手術(shù)切除、肝臟移植、局部消融、肝動(dòng)脈介入、放射治療和全身療法[14]。在這些選擇中，盡管手術(shù)切除和肝移植是首選的治療方法，但卻只適用于15%的HCC患者[15]。多數(shù)患者就診時(shí)病情已達(dá)晚期，此時(shí)以藥物化療為主的全身治療最被認(rèn)可[3]。然而多數(shù)化療藥物在治療的同時(shí)也被發(fā)現(xiàn)有嚴(yán)重的毒副作用，如阿霉素的累積心臟毒性會(huì)造成不可逆心衰[16]；5-氟尿嘧啶會(huì)造成神經(jīng)毒性和骨髓抑制[17]。

近年來，隨著對(duì)中醫(yī)藥研究的不斷深入，許多中藥制劑也被批準(zhǔn)納入HCC治療方案[6]。實(shí)際應(yīng)用上，中藥常作為佐劑，在肝癌化療前后的輔助治療中，對(duì)肝癌化療后綜合征有明顯的緩解作用，一定程度上起到增效減毒的效果[18-19]。ADI作為腫瘤治療的常用中藥制劑，通常與阿霉素、奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶和羥基喜樹堿等化療藥物聯(lián)合使用[20-21]。雖然臨床療效已被認(rèn)可，但是聯(lián)合用藥中，ADI對(duì)于化療藥物影響的基礎(chǔ)研究卻較少。因此有必要通過動(dòng)物肝癌模型研究中藥對(duì)化療藥物的體內(nèi)分布，為臨床用藥的安全性和有效性提供理論依據(jù)。

目前肝癌動(dòng)物建模方法包括自發(fā)型、誘發(fā)型、移植型和轉(zhuǎn)基因等[22]?；瘜W(xué)誘導(dǎo)肝癌模型因?yàn)榫哂信c人體肝癌相似的病變過程和病理學(xué)變化而被廣泛應(yīng)用[23]。前期研究中本研究也采用了DEN誘導(dǎo)大鼠HCC，但是由于造模周期較長(zhǎng)(4個(gè)月)，存在較高的死亡率和成癌失敗率[24-25]，因此本研究考慮選用其它模型。移植型肝癌動(dòng)物模型操作簡(jiǎn)單、成本較低、造模成功率高、瘤體可見，且移植瘤可保持原有的特征和生物學(xué)特性基本不發(fā)生變化，成模較快，多用于藥物研究中小鼠肝癌模型的建立[10]。其中，H22腫瘤株建立的小鼠肝癌模型被認(rèn)為是中醫(yī)藥研究抗腫瘤作用及機(jī)制的良好腫瘤模型[26]，故本研究采用H22小鼠移植瘤模型進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與SDOX組相比，多次給藥后DOX及其活性代謝產(chǎn)物DOXol在各組織中的分布量均顯著增加，證實(shí)了DOX的毒副作用與其體內(nèi)的蓄積量有關(guān)[27]。這提示當(dāng)DOX連續(xù)用于腫瘤治療時(shí)，除能增強(qiáng)抗腫瘤效果外，還要特別注意藥物在其它部位的蓄積可能引起的不良反應(yīng)，尤其是DOX劑量依賴性心臟毒性和肝腎損傷等[28-29]。ADI與DOX聯(lián)合用藥后，DOX和DOXol在腫瘤部位的含量均有所增加；而在其它部位的分布減少，尤其以心臟中的變化最為明顯，表明ADI增強(qiáng)DOX抗腫瘤作用，降低DOX的心臟毒性作用可能是通過改變DOX和DOXol的體內(nèi)分布狀態(tài)實(shí)現(xiàn)。

肝臟作為藥物代謝的主要部位，直接影響藥物在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)行為。研究表明DOX主要經(jīng)羰基還原酶1(CBR1)、細(xì)胞色素P450(CYP450)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)代謝[30-31]。CBR1主要分布在心臟和肝臟中，是DOX代謝成DOXol的關(guān)鍵作用酶[32]，而DOXol是DOX誘導(dǎo)心臟毒性的主要原因，ADI聯(lián)合DOX給藥后，DOXol在心臟的含量顯著降低，表明ADI可能通過改變CBR1的表達(dá)降低DOX誘導(dǎo)的心臟毒性。同時(shí)前期實(shí)驗(yàn)中本研究還發(fā)現(xiàn)ADI可下調(diào)大鼠肝組織中CYP1A2、CYP2E1、CYP3A2、CYP2C11 mRNA和蛋白的表達(dá)[24]，并且通過降低GSTs的活性抑制DOX的體內(nèi)代謝[33]。此外，部分轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性或表達(dá)也被認(rèn)為與DOX的體內(nèi)分布密切相關(guān)，DOX通過攝取性轉(zhuǎn)運(yùn)體SLC22A16進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；而P-gp則負(fù)責(zé)將細(xì)胞內(nèi)的DOX外排[34]，尤其是P-gp在肝癌細(xì)胞中存在高表達(dá)情況[35]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)HCC大鼠體內(nèi)，SLC22A16的表達(dá)顯著降低，而 P-gp的表達(dá)則被明顯上調(diào)[13]。同時(shí)臨床研究指出ADI和化療藥物聯(lián)用時(shí)可以降低P-gp的表達(dá)[36]，而對(duì)于SLC22A16的影響則不清楚。綜上，這些都可能是ADI增加DOX抗腫瘤能力，降低DOX誘導(dǎo)心臟毒性的重要原因。

前期本研究課題組考察了DEN誘導(dǎo)的大鼠肝癌模型中，ADI可以顯著提高血漿中的DOX和DOXol水平[13]。這可能是因?yàn)镈EN誘導(dǎo)的HCC過程，肝臟經(jīng)歷了“肝炎—肝硬化—肝癌”的三部曲，發(fā)生HCC時(shí)，其他肝臟組織可能正處于肝炎或肝硬化階段(也是嚴(yán)重病變)，各藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體處于異常狀態(tài)，其病變會(huì)很大程度影響藥物的體內(nèi)過程，從而使DOX代謝變慢。本實(shí)驗(yàn)中本研究采用異位移植的H22小鼠肝癌模型，這種方法的肝臟是正常狀態(tài)。原發(fā)性肝癌和異位種植模型產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異，可能是主要代謝器官肝臟處于不同模型狀態(tài)導(dǎo)致。這提示，肝癌動(dòng)物模型各有特點(diǎn)，不同建模方法可以形成不同病理特點(diǎn)和生物特性，應(yīng)依據(jù)實(shí)際需要選用合適模型。

綜上所述，本研究采用UPLC-MS/MS考察了ADI和DOX聯(lián)用后對(duì)DOX和DOXol在血漿、腫瘤、心、肝、肺、腎中的分布情況，從藥物體內(nèi)分布情況角度上解釋了ADI與DOX發(fā)揮增效減毒作用的原因，為兩種藥物聯(lián)用的合理性奠定了理論基礎(chǔ)。