不同產(chǎn)地鹵蟲幼體對(duì)云龍石斑魚幼苗生長和抗脅迫能力的影響

劉曉翠，鄧洪剛，于學(xué)權(quán)，朱亞光，王鵬飛，隋麗英

(1. 天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院，天津300457；2. 天津食品集團(tuán)立達(dá)海水資源開發(fā)有限公司，天津300450；3. 西藏雙湖縣普若崗日生物科技有限公司，那曲853317)

石斑魚是具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的海洋魚類，近年來我國石斑魚養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年上升[1]，但由于石斑魚苗種畸形率高、對(duì)環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)烈、自相殘殺嚴(yán)重、病害多，因此工廠化培育難度大[2-3]．云龍石斑魚是云紋石斑魚(♀ Epinehelus moara)與鞍帶石斑魚(♂Epinehelus lanceolatus)雜交而成的新品種，具有耐低溫、肉質(zhì)鮮美的特點(diǎn)，其生長快、抗病能力強(qiáng)，是市場認(rèn)可度較高的優(yōu)質(zhì)雜交新品種．n-3高不飽和脂肪酸(n-3HUFA，C＞20)主要包括EPA和DHA，是細(xì)胞膜磷脂的重要成分，在細(xì)胞膜流動(dòng)性、脂質(zhì)性能、生殖發(fā)育、脂質(zhì)代謝和免疫功能等方面發(fā)揮重要作用．但是，海洋魚蝦蟹類自身不能合成HUFA或合成能力有限，需要在飼料或餌料中補(bǔ)充[4-5]．研究[6]表明，餌料中一定水平的n-3HUFA(1.47%～1.70%)可顯著提高雜交石斑魚(♀Epinephelus fuscoguttatus×♂Epinephelus lanceolatu)幼魚的生長速度、非特異性免疫力和抗病力，抑制炎癥反應(yīng)．飼料中一定水平的n-3HUFA(1.27%～1.42%)對(duì)斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)的增重率、餌料系數(shù)和蛋白質(zhì)利用率都有顯著促進(jìn)作用，且石斑魚肌肉中的n-3HUFA含量隨飼料n-3HUFA水平的增加而增加[7]．

鹵蟲(Artemia)具有使用方便、適口性好和營養(yǎng)較為豐富等特點(diǎn)，是水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物苗種重要的開口餌料[8]．全球商業(yè)化鹵蟲卵生產(chǎn)原料主要來源于中國、美國、俄羅斯和哈薩克斯坦等國的鹽湖或日曬鹽場．我國是鹵蟲卵資源采收、加工流通和使用的主要國家，鹵蟲卵資源主要分布在環(huán)渤海鹽田以及青海、新疆、西藏等地的鹽湖中．由于生物學(xué)和環(huán)境因子(如鹽度、溫度和餌料等)的差異，不同產(chǎn)地的鹵蟲卵徑和鹵蟲幼體的大小、營養(yǎng)組成和含量有較大差別，甚至同一產(chǎn)地、不同時(shí)間采收的鹵蟲卵，其營養(yǎng)水平也有所不同[9-11]．西藏其香錯(cuò)鹽湖鹵蟲個(gè)體大、顏色深紅、富含EPA、孵化率高，孵化后幼體與卵、空殼分離好，近年來產(chǎn)量較大且穩(wěn)定．中亞地區(qū)咸海鹵蟲卵市場價(jià)位具有競爭力，在國內(nèi)苗種培育中廣泛使用．咸海鹵蟲幼體EPA含量雖然較高，但與其香錯(cuò)鹵蟲幼體相比仍有一定的差距．

鹵蟲是非選擇性濾食動(dòng)物，可通過生物包裹的方式將水產(chǎn)苗種所需要的特殊成分(如HUFA、色素、免疫增強(qiáng)劑等)快速包裹于鹵蟲腸道，并通過攝食有效送達(dá)水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)，因此缺乏水產(chǎn)動(dòng)物必需脂肪酸的鹵蟲可以通過強(qiáng)化富含n-3HUFA的產(chǎn)品(如魚油、裂殖壺藻等)實(shí)現(xiàn)其在海水育苗中的有效應(yīng)用[12]．

本研究以西藏其香錯(cuò)鹵蟲幼體、裂殖壺藻強(qiáng)化的咸海鹵蟲幼體和不強(qiáng)化的咸海鹵蟲幼體投喂云龍石斑魚幼苗，分析比較不同產(chǎn)地鹵蟲幼體和營養(yǎng)強(qiáng)化對(duì)石斑魚幼苗生長、肌肉脂肪酸含量、抗氨氮脅迫和對(duì)弧菌攻毒的耐受力，旨在為不同產(chǎn)地鹵蟲幼體和營養(yǎng)強(qiáng)化在石斑魚育苗中的有效應(yīng)用提供參考．

1 材料與方法

1.1 鹵蟲幼體孵化與營養(yǎng)強(qiáng)化

本研究所用西藏其香錯(cuò)鹵蟲卵、中亞地區(qū)咸海鹵蟲卵分別由西藏雙湖縣普若崗日生物科技有限公司、天津食品集團(tuán)立達(dá)海水資源開發(fā)有限公司提供．鹵蟲卵孵化條件：溫度28℃，鹽度20～30g/L，光照強(qiáng)度2000lx，連續(xù)充氣．孵化24h后收集鹵蟲幼體，用相同鹽度稀釋鹵水沖洗，備用．

咸海鹵蟲幼體收集后暫養(yǎng)6h，用裂殖壺藻(青島越洋有限公司)進(jìn)行營養(yǎng)強(qiáng)化．鹵蟲幼體強(qiáng)化條件：溫度25℃，鹵蟲幼體密度150～200個(gè)/mL，裂殖壺藻劑量0.2g/L，強(qiáng)化時(shí)間6～12h．

1.2 石斑魚養(yǎng)殖條件

石斑魚苗種培育在天津食品集團(tuán)立達(dá)海水資源開發(fā)有限公司進(jìn)行．將石斑魚幼苗分為3組，每組2個(gè)平行池，分別投喂其香錯(cuò)鹵蟲幼體、裂殖壺藻強(qiáng)化咸海鹵蟲幼體和未強(qiáng)化的咸海鹵蟲幼體，連續(xù)投喂30d．單位養(yǎng)殖水體40m3，每個(gè)養(yǎng)殖池中布卵300g.養(yǎng)殖水體鹽度25g/L，溫度25℃，溶解氧(DO)含量6～7mg/L．每天分別于09：00和15：00投喂鹵蟲幼體，每池每天的平均投喂量為32×106個(gè)鹵蟲幼體．

1.3 指標(biāo)分析

1.3.1 鹵蟲幼體和石斑魚肌肉脂肪酸組成及含量測定

將鹵蟲幼體在冷凍干燥機(jī)(德國Marin Christ公司)中干燥．精確稱取凍干樣品0.03g，加入1mg脂肪酸內(nèi)標(biāo)C20：2n-6(美國NU-CHEK PREP公司).分別以V(甲醇)﹕V(甲苯)＝3﹕2、V(氯乙酰)﹕V(甲醇)＝1﹕20的比例配制混合試劑，各加入5mL，充分勻漿后煮沸1h進(jìn)行脂肪酸甲酯化，用正己烷萃取脂肪酸甲酯并濃縮．用氣相色譜儀(日本Shimadzu公司)進(jìn)行脂肪酸組成和含量的測定[9]．

養(yǎng)殖結(jié)束后，每組隨機(jī)取10尾魚，用無菌海水沖洗去除體表附著物，獲取石斑魚肌肉并進(jìn)行冷凍干燥．樣品處理及脂肪酸組成和含量測定方法同上．

1.3.2 石斑魚幼苗生長測定

育苗結(jié)束后，每組隨機(jī)取10尾魚，測定并計(jì)算平均體長、平均體質(zhì)量和出苗率．

1.3.3 脅迫實(shí)驗(yàn)

分別從每組中隨機(jī)取石斑魚若干，暫養(yǎng)2d．暫養(yǎng)條件同養(yǎng)殖條件，投喂顆粒飼料(三通生物工程有限公司)．暫養(yǎng)結(jié)束后，分別從各箱中隨機(jī)取20尾魚，進(jìn)行弧菌攻毒和氨氮脅迫實(shí)驗(yàn)．

哈維氏弧菌(Vibrio harveyi MCCC1A03218)購于自然資源部第三海洋研究所，有效感染量總計(jì)5×107mL-1．根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，氨氮脅迫NH4Cl-N質(zhì)量濃度總計(jì)12mg/L，計(jì)算得到非離子氨NH3-N質(zhì)量濃度總計(jì)0.95mg/L[13]．脅迫期間水體鹽度20g/L，溫度(25±1)℃，DO 6～7mg/L，單位水體10L．弧菌攻毒和氨氮脅迫時(shí)長均為72h，在此期間不投喂飼料，記錄每組石斑魚的最終死亡數(shù)．

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA單因素分析和Duncan’s多重比較分析．所有數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，不同字母表示組間具有顯著差異(P＜0.05)．

2 結(jié)果與分析

2.1 鹵蟲幼體脂肪酸組成和含量

鹵蟲幼體脂肪酸組成及含量(以干質(zhì)量計(jì))見表1．其香錯(cuò)鹵蟲幼體不飽和脂肪酸(PUFA，C＞18)和n-3HUFA含量最高，分別為125.73、31.78mg/g，EPA含量為30.53mg/g，遠(yuǎn)高于其他2種鹵蟲幼體．咸海鹵蟲幼體PUFA含量最低，為40.40mg/g．強(qiáng)化后咸海鹵蟲幼體DHA含量有所提高，為2.31mg/g．

表1 鹵蟲幼體脂肪酸組成及含量Tab. 1 Fatty acid composition and contents of Artemia nauplii

2.2 石斑魚幼苗的生長

石斑魚平均體長、平均體質(zhì)量和出苗率見表2.石斑魚出苗率為2.53%～7.60%，整體水平較低，這與魚卵質(zhì)量和養(yǎng)殖水體質(zhì)量等有關(guān)．投喂其香錯(cuò)鹵蟲幼體和強(qiáng)化咸海鹵蟲幼體的石斑魚平均體長顯著高于投喂未強(qiáng)化咸海鹵蟲幼體組(P＜0.05)．投喂其香錯(cuò)鹵蟲幼體石斑魚平均體質(zhì)量顯著大于強(qiáng)化咸海鹵蟲幼體組和未強(qiáng)化咸海鹵蟲幼體組(P＜0.05).

表2 石斑魚平均體長、平均體質(zhì)量和出苗率Tab. 2 Average body length，average body weight and survival percentage of grouper juveniles

2.3 石斑魚肌肉脂肪酸組成和含量

石斑魚肌肉脂肪酸組成和含量(以干質(zhì)量計(jì))見表3．投喂其香錯(cuò)鹵蟲幼體石斑魚肌肉PUFA和n-3HUFA含量最高，強(qiáng)化咸海鹵蟲幼體組居中，未強(qiáng)化咸海鹵蟲幼體組最低(P＜0.05)．

表3 石斑魚肌肉脂肪酸組成和含量Tab. 3 Fatty acid composition and contents of grouper juvenile muscles

2.4 石斑魚對(duì)弧菌攻毒和氨氮脅迫的耐受力

弧菌攻毒和氨氮脅迫72h的石斑魚存活率見圖1.弧菌攻毒72h后，投喂其香錯(cuò)鹵蟲幼體石斑魚存活率(100%)顯著高于其他兩組(P＜0.05)，強(qiáng)化咸海鹵蟲幼體組和未強(qiáng)化組石斑魚存活率沒有顯著差異．

圖1 弧菌攻毒和氨氮脅迫72h的石斑魚存活率Fig. 1 Survival percentage of grouper juvenileswhen exposed to Vibrio harveyi and ammonia nitrogen stress for 72h

氨氮脅迫72h后，投喂其香錯(cuò)鹵蟲幼體石斑魚存活率(96.67%)顯著高于其他兩組，強(qiáng)化咸海鹵蟲幼體組最低(P＜0.05)．

3 討 論

3.1 不同產(chǎn)地鹵蟲對(duì)云龍石斑魚生長和肌肉脂肪酸含量的影響

本研究表明，投喂其香錯(cuò)鹵蟲幼體和裂殖壺藻強(qiáng)化咸海鹵蟲幼體可顯著促進(jìn)石斑魚苗種的生長．EPA和DHA是維持海水魚蝦蟹生長、發(fā)育和繁殖的必需脂肪酸[14-15]．作為海水魚蝦蟹育苗的重要生物餌料，雖然不同產(chǎn)地鹵蟲幼體PUFA和n-3HUFA含量差異較大[9-10]，但通過魚油和裂殖壺藻等強(qiáng)化劑進(jìn)行短期營養(yǎng)強(qiáng)化，可顯著提高其HUFA含量[16-18]．研究表明，通過魚油強(qiáng)化提高鹵蟲幼體中n-3HUFA含量和DHA與EPA的比例，顯著提升了中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)蚤狀幼體的變態(tài)生長、存活和抗鹽度脅迫能力[17]；與投喂油酸(C18：1n-9)強(qiáng)化的鹵蟲幼體相比，投喂n-3HUFA強(qiáng)化的鹵蟲幼體能夠顯著提高日本牙鲆(Paralichthys olivaceus)幼苗的生長、存活和耐鹽能力[18]．

由于病害和自相殘殺等原因，石斑魚育苗出苗率普遍較低[3]．研究[19]發(fā)現(xiàn)，鞍帶石斑魚(♂)與褐點(diǎn)石斑魚(♀)雜交獲得的石斑魚苗，用未強(qiáng)化的鹵蟲和橈足類等生物餌料培育至30日齡，成活率為0.5%，平均體長為2.25cm；黃進(jìn)光等[20]對(duì)云紋石斑魚工廠化育苗60d，成活率為2%，平均體長為3.85cm；余慶等[14]應(yīng)用在不同時(shí)期投喂小球藻和魚油強(qiáng)化的輪蟲、鹵蟲和橈足類的策略進(jìn)行珍珠龍膽石斑魚育苗35d，成活率為10.5%，平均體長為2.55cm．本研究中云龍石斑魚幼苗培育30d后，各組石斑魚成活率為2.53%～7.60%，平均體長為2.62～3.17cm，其中其香錯(cuò)鹵蟲幼體組和裂殖壺藻強(qiáng)化咸海鹵蟲幼體組石斑魚體長顯著大于未強(qiáng)化鹵蟲幼體組，應(yīng)該與其香錯(cuò)鹵蟲幼體較高的EPA含量以及強(qiáng)化后咸海鹵蟲幼體DHA含量的提升有關(guān)．

水產(chǎn)動(dòng)物肌肉的脂肪酸積累主要來源于餌料或飼料[6-7,21]．銀黑鯛和金頭鯛肌肉n-3HUFA含量隨著餌料n-3HUFA水平的升高呈上升趨勢[22-23]，中華絨螯蟹肝胰腺脂肪酸含量隨餌料n-3HUFA水平的增加而增加[17]．本研究中其香錯(cuò)鹵蟲幼體組石斑魚肌肉PUFA和n-3HUFA含量顯著高于強(qiáng)化咸海鹵蟲幼體組和未強(qiáng)化鹵蟲幼體組，表明餌料HUFA影響石斑魚肌肉PUFA和n-3HUFA組成．

3.2 投喂不同產(chǎn)地鹵蟲對(duì)云龍石斑魚弧菌攻毒和氨氮脅迫耐受力的影響

致病性弧菌給海水養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[24]. n-3HUFA能夠有效提高水產(chǎn)動(dòng)物的免疫能力，n-3HUFA可調(diào)節(jié)虹鱒魚(Oncorhynchus mykiss)免疫力，提高巨噬細(xì)胞的殺菌能力[25]．餌料中一定水平的n-3HUFA可提高石斑魚抵抗哈維氏弧菌的能力[6]，促進(jìn)大黃魚非特異性免疫和抵抗寄生蟲的能力[5]，有效提高金鯧魚(Trachinotus ovatus)血清和肝臟中n-3HUFA含量，促進(jìn)免疫反應(yīng)[26]．本研究中哈維氏弧菌攻毒72h后，其香錯(cuò)鹵蟲幼體組石斑魚存活率為100%，其余兩組分別為41.67%和38.33%，這可能與其香錯(cuò)鹵蟲幼體中較高的n-3HUFA，特別是較高的EPA含量有關(guān)．裂殖壺藻強(qiáng)化咸海鹵蟲幼體組石斑魚存活率高于未強(qiáng)化組，可能與強(qiáng)化鹵蟲幼體中較高的DHA含量有關(guān)．

養(yǎng)殖環(huán)境中的氨氮是主要的污染因子，其來源于蛋白質(zhì)的分解代謝[27]．氨氮脅迫使蝦蟹魚類機(jī)體非特異性免疫系統(tǒng)遭到破壞，抗氧化能力降低，影響機(jī)體健康[28-31]．研究發(fā)現(xiàn)，投喂n-3HUFA強(qiáng)化的鹵蟲幼體可以顯著提高粉紅蝦(Farfantepenaeus paulensis)對(duì)氨氮的耐受能力[31]，提高金鯧魚抗氧化的能力[26]，投喂n-3HUFA和維生素C共同強(qiáng)化的鹵蟲幼體顯著提高波斯鱘(Acipenser persicus)和歐洲鰉魚(Huso huso)對(duì)溫度、鹽度和氨氮的耐受力[32]．本研究投喂其香錯(cuò)鹵蟲幼體組石斑魚氨氮脅迫72h后存活率最高，表明投喂西藏鹵蟲幼體可以顯著提高云龍石斑魚抵抗氨氮脅迫的能力．

4 結(jié) 論

西藏其香錯(cuò)鹵蟲幼體中PUFA和EPA的含量明顯高于咸海鹵蟲幼體，裂殖壺藻強(qiáng)化后咸海鹵蟲幼體PUFA和DHA含量有所提升．投喂其香錯(cuò)鹵蟲幼體和強(qiáng)化鹵蟲幼體可顯著促進(jìn)云龍石斑魚苗種的生長，提高石斑魚肌肉中PUFA和n-3HUFA的含量；投喂其香錯(cuò)鹵蟲幼體顯著提升石斑魚對(duì)弧菌攻毒和氨氮脅迫的耐受力，說明生物餌料鹵蟲幼體中較高的n-3HUFA水平對(duì)石斑魚苗種培育具有積極作用．應(yīng)該指出的是，使用其香錯(cuò)鹵蟲幼體無需營養(yǎng)強(qiáng)化操作，且石斑魚的總體狀況優(yōu)于投喂裂殖壺藻強(qiáng)化的咸海鹵蟲，所以西藏其香錯(cuò)鹵蟲幼體更適合作為石斑魚苗種培育的生物餌料．