白細胞介素-6和鐵代謝相關蛋白在一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病中的表達變化

韓琴 高葉 雷蕊綺 蔣力 辜剛鳳 彭紅艷 李經倫

一氧化碳中毒遲發(fā)性腦病(delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning，DEACMP)是指急性一氧化碳(carbon monoxide，CO)中毒患者經及時救治后意識恢復，并度過“假愈期”(2～60 d)后，再次出現(xiàn)以認知功能障礙、行為障礙、失語癥、錐體外系等為主的神經精神癥狀。研究認為DEACMP主要病理機制是海馬區(qū)神經元延遲死亡，其發(fā)病機制可能與缺血缺氧、免疫與炎癥、線粒體功能抑制等有關[1]。研究發(fā)現(xiàn)腦鐵過載是多種認知功能障礙疾病的重要環(huán)節(jié)[2]。楊曉燕[3]研究發(fā)現(xiàn)急性CO中毒期，大鼠腦組織缺氧，應激狀態(tài)下可釋放大量炎癥因子白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)。去鐵胺(defetoxamine，DFO)是一種鐵螯合劑，能快速與鐵離子結合形成復合物排出體外。已有研究證實DFO可通過減少鐵沉積、抑制炎癥反應和脂質過氧化等減少細胞凋亡[4]。但是DEACMP腦組織中是否存在鐵代謝紊亂，DFO能否改善DEACMP的神經功能障礙均尚無定論。因此，本實驗擬通過建立DEACMP大鼠模型，觀察急性大鼠CO中毒后海馬區(qū)鐵代謝相關蛋白的表達變化，探討鐵代謝紊亂與DEACMP的相關性、DFO的干預效果及其可能機制，以及IL-6在鐵代謝中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：體重300～320 g雄性SD大鼠170只〔購于成都達碩實驗動物有限公司，動物許可證：SCXK(川) 2019-030，飼養(yǎng)于干凈恒溫動物房，室內溫度20～24℃，濕度為40%～60%，12 h明暗交替〕。

1.1.2主要試劑和儀器：CO氣體(體積分數為99.9%，購于瀘州市西南化工研究院)；Morris水迷宮分析跟蹤系統(tǒng)(由西南醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院提供)；DFO(瑞士諾華制藥有限公司，批號S0965)；兔源鐵調素(hepcidin，Hep)抗體購于美國LSBio公司，鼠源IL-6抗體、二價金屬離子轉運體1(divalent metal-ion transporter-1，DMT1)抗體及兔源膜鐵轉運蛋白(ferroportin，F(xiàn)PN)抗體、兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體均購于英國Abcam公司；蘇木素染液、伊紅染液、核固紅染液、2%(質量濃度)亞鐵氰化鉀水溶液、2%(體積濃度)鹽酸、DS-PAGE凝膠制備試劑盒、RIPA總蛋白裂解液、異硫氰酸熒光素(FITC)標記羊抗兔IgG抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔和羊抗鼠IgG抗體、ECL化學發(fā)光檢測試劑盒、BCA蛋白質濃度測定試劑盒均購自美國ASPEN公司；蛋白提取試劑盒購于北京普利萊公司；TBST緩沖液購于德國Sigma公司；4%(質量濃度)多聚甲醛、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染液、抗熒光淬滅封片劑均購于武漢阿斯本生物技術有限公司。5%(質量濃度)牛血清白蛋白(BSA)購于瑞士Roche公司；普通光學、倒置顯微鏡購于OLYMPUS。脫水機、包埋機、組織攤片機均購于武漢俊杰電子有限公司。

1.2 方法

1.2.1實驗動物篩選及實驗分組：采用Morris水迷宮試驗對170只大鼠訓練6 d，于第7天用定位航行和空間探索實驗檢測大鼠認知功能。(1)定位航行實驗：將大鼠面朝水池壁，分別從四個象限放入水池，直到大鼠成功爬上平臺，記錄其從下水至找到平臺的時間(逃避潛伏期)，評估大鼠學習能力。(2)空間探索實驗：完成定位航行實驗后撤去水迷宮中的平臺，記錄大鼠在120 s內穿越平臺次數，評估大鼠記憶能力。參照趙瑛等[5]的研究方法，大鼠逃避潛伏期小于120 s，判定為合格。其中165只大鼠合格，用于后續(xù)實驗。

實驗將分為對照組、模型組、干預組三組，每組各50只，按照隨機數字表法從合格SD大鼠中選出。三組大鼠于造模前1天隨機各選10只大鼠完成水迷宮實驗，將此次的記錄結果作為基線結果。

1.2.2模型制備：參照李勇軍等[6]的方法用改良式間隔腹腔注射CO制備DEACMP大鼠模型。(1)模型組：大鼠首次(上午8：00)按體重100 mL/kg腹腔注射CO氣體，每隔4 h追加首劑的50%(按體重50 mL/kg)共3次，制備DEACMP模型。(2)干預組：制備DEACMP模型同模型組；于造模前1 h(7：00)按體重100 mg/kg腹腔注射DFO，之后每天上午7：00注射等量DFO 1次，直至處死。(3)對照組：與模型組同法注射等體積空氣，無其他操作。如大鼠死亡，立即按相應方法重新操作，以保證每組50只。

參照張曉莉[7]DEACMP大鼠造模成功標準：大鼠出現(xiàn)精神萎靡、呼吸急促、口唇及皮膚黏膜呈櫻桃紅、肢體抽搐、昏迷等CO中毒癥狀；并且水迷宮實驗發(fā)現(xiàn)大鼠認知功能下降。

1.2.3各組大鼠臨床表現(xiàn)及認知功能檢測：觀察三組大鼠注射空氣或CO后的臨床表現(xiàn)，并分別于造模后第1、3、7、14、21天的上午9：00隨機選10只，采用水迷宮試驗(同實驗動物篩選)檢測大鼠學習和記憶能力。

1.2.4各組大鼠海馬CA1區(qū)腦組織形態(tài)觀察及相關指標檢測：三組均于造模后第1、3、7、14、21天(上午10：00)隨機抽取5只大鼠，腹腔注射10%(質量濃度)水合氯醛(按體重3 mL/kg)進行麻醉，生理鹽水心臟灌洗、4%(質量濃度)多聚甲醛固定，取出腦組織于固定液中固定24 h以上，酒精梯度脫水，石蠟包埋，行冠狀位切片，片厚4 μm，每個腦組織連續(xù)選取8張海馬組織切片，其中2張用于HE染色、3張用于免疫熒光、3張用于普魯士藍染色。其余大鼠麻醉處死，于冰面上分離新鮮海馬組織，放入-80℃冰箱中，用于Western blot實驗。

(1)HE染色：取海馬組織石蠟切片，進行HE染色，脫水封片。400倍光學顯微鏡下觀察三組大鼠各時間點海馬CA1區(qū)錐體細胞形態(tài)變化。

(2)免疫熒光檢測：各組海馬標本切片風干后置于EDTA中修復，避光孵育10 min，PBS浸洗，甩干后5%(質量濃度)BSA封閉20 min；依次加入稀釋的Hep抗體(1︰1000)、FITC標記的羊抗兔IgG抗體(1︰50)37℃孵育30 min，DAPI染液(15 min)PBS沖洗3次，待染色后滴加適量的熒光淬滅劑封片，每張切片取5個不同的400倍視野，熒光顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)Hep蛋白表達情況，并用ImageJ軟件進行分析。本實驗中采用DAPI染色固定細胞核，被DAPI染色的細胞核呈藍色。Hep蛋白在細胞膜上，F(xiàn)ITC標記后出現(xiàn)紅色熒光。

(3)Western Blot檢測：按蛋白提取試劑盒說明提取海馬組織總蛋白，以BCA蛋白質濃度測定試劑盒測定海馬組織蛋白濃度，經電泳、轉膜，加入IL-6(1∶500)、Hep(1∶1000)、FPN(1∶500)、DMT1(1∶1000)、內參GAPDH(1∶1000)一抗過夜，用TBST洗3次后，加入稀釋好的HRP標記的相應種屬二抗(1∶1000)，孵育30 min，滴加ECL化學發(fā)光檢測試劑，于暗室中曝光、顯影、定影，將膠片進行掃描存檔，采用AlphaEaseFC軟件分析IL-6、Hep、FPN、DMT1蛋白表達條帶灰度值。以GAPDH表達相對水平的平均值作為標準化內參。目標蛋白的相對含量=目標蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

(4)普魯士藍染色：將2%(質量濃度)亞鐵氰化鉀水溶液、2%(體積濃度)鹽酸溶液按1∶1混合后對切片進行染色，核固紅染液浸染、水洗，脫水封片。于400倍顯微鏡下觀察三組大鼠海馬CA1區(qū)鐵沉積情況。若在海馬CA1區(qū)細胞內及細胞間觀察到藍色顆粒，說明有鐵沉積。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS 25.0軟件進行分析。計量資料均符合正態(tài)分布，用均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較用最小顯著差異法(LSD-t)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組動物臨床表現(xiàn)對照組大鼠腹腔注射空氣后正常進食，精神行為無異常。模型組和干預組大鼠腹腔注射CO氣體數分鐘后開始出現(xiàn)CO中毒癥狀：呼吸急促、躁動不安、大小便失禁、口唇黏膜呈櫻桃紅色，之后逐漸站立不穩(wěn)、四肢癱軟、精神萎靡、蜷縮于角落，少數出現(xiàn)抽搐、昏迷，立即將其置于通風處，癥狀可逐漸恢復。

2.2 Morris水迷宮檢測大鼠認知功能對照組各時間點大鼠逃避潛伏期及穿越平臺次數差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。模型組及干預組，與造模前、造模后第1、3、7天比較，造模后第14、21天大鼠逃避潛伏期延長、穿越平臺次數減少(P<0.05)。造模前及造模后第1、3、7天比較，以及造模后第14和21天比較，逃避潛伏期及穿越平臺次數差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

對照組、模型組和干預組三組比較，造模前、造模后第1、3、7天逃避潛伏期及穿越平臺次數差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與對照組造模后第14、21天比較，模型組和干預組大鼠逃避潛伏期明顯延長，穿越平臺次數顯著減少(P<0.05)；與模型組造模后第14、21天比較，干預組逃避潛伏期縮短、穿越平臺次數顯著增加(P<0.05)。具體見表1、表2。以上結果顯示，在造模后第14天模型組大鼠出現(xiàn)明顯的認知功能障礙，表明在造模后第14天大鼠發(fā)生DEACMP。

表1 各組大鼠不同時間點逃避潛伏期比較

表2 各組大鼠不同時間點穿越平臺次數比較次)

2.3 三組大鼠海馬CA1區(qū)神經元形態(tài)比較對照組各時間點海馬CA1區(qū)神經元，整齊排列，細胞膜結構完整，細胞質均一染色，胞核輪廓清晰，呈深藍色。模型組造模后第1天細胞形態(tài)無明顯改變，第3天和第7天海馬細胞腫脹、排列紊亂無序、稀疏，第14天和第21天海馬CA1區(qū)細胞呈不規(guī)則形，胞漿濃縮深染、核固縮、碎裂，神經元水腫、壞死明顯。與模型組相比，干預組造模后第3、7天部分細胞腫脹減輕，第14、21天海馬CA1區(qū)神經元壞死明顯減少。具體見圖1。

注：A：對照組；B：模型組；C：干預組 圖 1 造模后第14天時各組大鼠海馬CA1區(qū)神經元表現(xiàn)比較(HE×400)：對照組海馬神經元整齊排列，細胞膜結構完整，細胞質均一染色，胞核輪廓清晰，呈深藍色；模型組和干預組均有神經元壞死，與模型組比較，干預組神經元壞死減少(圖B、C中箭頭所示為壞死神經元)

2.4 三組大鼠海馬CA1區(qū)Hep蛋白表達比較對照組海馬CA1區(qū)Hep蛋白在各時間點表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。模型組、干預組各時間點Hep蛋白表達呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，于第7天達高峰，第1、3、7天依次增高，第7、14、21天依次降低(均P<0.05)。與對照組比較，模型組和干預組大鼠各時間點海馬CA1區(qū)細胞膜Hep蛋白表達均增加(P<0.05)，且干預組與模型組比較各時間點Hep蛋白表達均減少(P<0.05)。具體見圖2、表3。

注：Hep：鐵調素；藍色熒光為細胞核，紅色熒光為細胞膜Hep蛋白；DAPI：4′，6-二脒基-2-苯基吲哚；Merge：DAPI+Hep；圖中箭頭所示為Hep蛋白 圖 2 造模第14天各組大鼠海馬CA1區(qū)Hep蛋白的表達情況(免疫熒光×400)

表3 造模后不同時間點各組大鼠Hep蛋白表達比較

2.5 各組IL-6、Hep、FPN、DMT1蛋白的表達對照組各時間點IL-6、Hep、FPN、DMT1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。模型組、干預組IL-6、Hep、DMT1表達呈先升高后降低的趨勢，于第7天達高峰，第1、3、7天依次增高，第7、14、21天依次降低(均P<0.05)；FPN呈先降低再升高趨勢，于第7天達低谷，第1、3、7天依次降低，第7、14、21天依次增高(均P<0.05)。

與對照組各時間點比較，模型組和干預組IL-6、Hep、DMT1表達增多，F(xiàn)PN表達減少(P<0.05)，且干預組與模型組各時間點比較IL-6、Hep、DMT1表達減少，F(xiàn)PN表達增多(P<0.05)。具體見圖3、表4～7。

注：IL-6：白細胞介素-6 ；Hep：鐵調素 ；FPN：膜鐵轉運蛋白；DMT1：二價金屬離子轉運體；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶(標準化的內參 ) ；因對照組在各時間點無明顯差異，故僅列出1個條帶 圖 3 各組大鼠海馬區(qū)IL-6、Hep、FPN、DMT1蛋白的表達(Western Blot)

表4 三組大鼠各時間點IL-6 蛋白相對表達水平比較

表5 三組大鼠各時間點Hep蛋白相對表達水平比較

表6 三組大鼠各時間點FPN蛋白相對表達水平比較

表7 三組大鼠各時間點DMT1蛋白相對表達水平比較

2.6 各組大鼠海馬CA1區(qū)鐵沉積比較對照組各時間點海馬CA1區(qū)均未見明顯鐵沉積。模型組、干預組在第1、3、7天未見明顯鐵沉積，第14、21天海馬CA1區(qū)觀察到鐵沉積于細胞質或細胞間隙中，但與模型組比較，干預組鐵沉積減少(圖4)。

注：A：對照組B：模型組 C：干預組；圖中箭頭所示為鐵沉積 圖 4 造模第14天時三組大鼠海馬CA1區(qū)鐵沉積比較(普魯士藍染色×400)

3 討論

DEACMP具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率的特點，是CO中毒嚴重的后遺癥之一，嚴重影響患者的生活質量，增加家庭及社會經濟負擔。目前DEACMP的發(fā)病機制仍未完全明確，因此探究其病理機制及相關預防治療手段成為全球研究重點。 本實驗通過改良式腹腔注射CO法建立大鼠DEACMP模型，在注射CO后大鼠出現(xiàn)明顯的中毒表現(xiàn)，Morris水迷宮檢測提示模型組在造模后第14天出現(xiàn)了明顯學習和記憶力下降，且大鼠海馬CA1區(qū)出現(xiàn)大量神經元壞死，與前人研究結果符合[8]，提示造模成功，大鼠發(fā)生DEACMP。大鼠海馬區(qū)的病理改變(神經元延遲死亡)與 Morris水迷宮行為學檢測結果相符，與臨床上發(fā)生DEACMP的時間吻合。

在中樞神經系統(tǒng)中，鐵參與運輸氧、神經遞質和髓鞘的合成、DNA合成、細胞代謝等重要的生理過程。目前已知Hep是hepcidin 抗微生物肽(hepcidin antimicrobial peptide，Hamp)基因編碼的鐵代謝關鍵調節(jié)蛋白，具有由8個半胱氨酸殘基和4個二硫鍵構成穩(wěn)定的發(fā)夾結構。研究表明FPN1是目前已知的惟一跨膜鐵輸出蛋白，Hep主要通過與細胞膜表面的FPN1結合，介導其內化降解，減少鐵向細胞外轉移。DMT1是哺乳動物體內的跨膜金屬離子轉運體，促進亞鐵轉入細胞質[9]。在細胞鐵代謝相關研究中，Hep、FPN、DMT1常作為其重要蛋白標志物。Ward等[10]的研究證實鐵穩(wěn)態(tài)受損會導致細胞內鐵代謝紊亂，繼而引起細胞凋亡，導致遲發(fā)性損傷。與對照組比較，模型組在中毒后第1、3天Hep、DMT1蛋白表達輕度增多，第7天達高峰，F(xiàn)PN表達減少，第7天達低谷，此時海馬區(qū)鐵沉積不明顯，海馬神經元腫脹，排列紊亂無序，大鼠學習和記憶能力正常，大鼠未發(fā)生DEACMP。中毒后第14天、21天Hep、DMT1蛋白表達仍高，F(xiàn)PN蛋白表達少，海馬區(qū)出現(xiàn)鐵沉積，且神經元壞死嚴重；水迷宮實驗結果顯示大鼠逃避潛伏期延長，穿越平臺次數減少，大鼠出現(xiàn)認知功能障礙，表明已發(fā)生DEACMP。上述結果提示在急性CO中毒大鼠海馬區(qū)存在鐵代謝紊亂，且后者可能與DEACMP的發(fā)生發(fā)展有關。

IL-6可使STAT3(信號轉導與轉錄激活因子)蛋白發(fā)生磷酸化，后者與Hep啟動子結合，促進Hep mRNA的轉錄、Hep蛋白表達增多，還可促進膜受體蛋白FPN泛素化降解，最終導致鐵外排受限[11]。Urrutia等[12]發(fā)現(xiàn)炎癥反應可誘導DMT1表達介導細胞內鐵聚集。有研究發(fā)現(xiàn)過載鐵通過促炎性細胞因子分泌和Fenton反應產生自由基，發(fā)生氧化應激反應，引起細胞功能損傷，繼而導致海馬神經元壞死，認知功能障礙[13]。本研究結果顯示，與對照組相比，模型組IL-6在中毒后呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，于第7天達高峰，第21天時IL-6表達仍較高，提示CO中毒大鼠海馬區(qū)存在持續(xù)炎癥反應。本研究還發(fā)現(xiàn)，模型組Hep、DMT1蛋白的表達趨勢與IL-6一致，F(xiàn)PN蛋白表達趨勢與IL-6相反，提示鐵代謝紊亂可能與IL-6介導的持續(xù)炎癥反應有關。

DFO是一種具有三異羥肟酸結構的多價螯合劑，其主要與游離鐵、鐵蛋白和含鐵血黃素中的三價鐵離子結合形成穩(wěn)定無毒的鐵胺復合物排出體外，從而降低活性鐵的濃度或清除過量游離鐵[14]，其保護作用在出血性腦卒中、阿爾茨海默病、脊髓損傷、帕金森病等疾病研究中初步得到證實[15]。既往研究顯示DFO可以改善認知功能。朱丹等[16]采用腹腔注射DFO可通過下調鐵蛋白的含量改善SD老齡大鼠術后學習和記憶能力。Zeinivand等[17]的研究也發(fā)現(xiàn)DFO可能通過抑制神經炎癥因子釋放和氧化應激來維持鐵穩(wěn)態(tài)，改善2型糖尿病的記憶功能障礙。本研究中模型組各時間點IL-6、Hep、DMT1蛋白表達增加，F(xiàn)PN蛋白表達減少，且于造模后第14、21天出現(xiàn)鐵沉積，海馬神經元明顯壞死，大鼠出現(xiàn)認知功能障礙(逃避潛伏期延長，穿越平臺次數減少)；與模型組比較，采用DFO干預后IL-6、Hep、DMT1蛋白表達降低，F(xiàn)PN蛋白表達增加，且鐵沉積減少，海馬CA1區(qū)神經元壞死減少，大鼠認知功能改善。上述結果提示DFO可能通過螯合蓄積鐵離子和抑制IL-6的表達，調節(jié)海馬區(qū)鐵代謝，減少海馬區(qū)鐵沉積和神經元延遲死亡，從而改善急性CO 中毒后遲發(fā)的認知功能障礙。

綜上，急性CO中毒大鼠海馬區(qū)存在鐵代謝紊亂，且鐵代謝紊亂可能與DEACMP的發(fā)生發(fā)展有關。DFO可能通過螯合游離鐵離子和抑制炎癥反應減少鐵沉積，減輕神經元死亡，改善CO中毒后神經細胞損傷和認知功能障礙，可能為DEACMP的臨床治療提供了新的實驗依據和方向。