利用高密度Bin圖譜定位水稻抽穗期劍葉葉綠素含量QTL

趙凌，張勇，魏曉東，梁文化，趙春芳，周麗慧，姚姝，王才林，張亞?wèn)|

利用高密度Bin圖譜定位水稻抽穗期劍葉葉綠素含量QTL

趙凌，張勇，魏曉東，梁文化，趙春芳，周麗慧，姚姝，王才林，張亞?wèn)|*

江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/江蘇省優(yōu)質(zhì)水稻工程技術(shù)研究中心/國(guó)家水稻改良中心南京分中心，南京 210014

【目的】挖掘新的控制水稻葉綠素含量的相關(guān)位點(diǎn)和基因，為水稻葉綠素含量的遺傳機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)?！痉椒ā坷脛θ~葉色存在明顯差異的粳稻TD70和秈稻Kasalath雜交構(gòu)建的包含186個(gè)株系的重組自交系群體為供試材料，通過(guò)對(duì)兩親本及RIL群體重測(cè)序，構(gòu)建了包含12 328個(gè)Bin標(biāo)記的高密度遺傳圖譜。RIL群體及親本分別于2011和2020年正季在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種植。抽穗后第3天使用葉綠素儀測(cè)定劍葉SPAD值。使用IciMappingv3.4軟件完備區(qū)間作圖法，對(duì)控制水稻抽穗期劍葉葉綠素含量的QTL進(jìn)行鑒定。利用便攜式光合儀測(cè)定RIL群體中20個(gè)SPAD極端株系的水分利用效率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和凈光合速率等光合作用參數(shù)。【結(jié)果】2年共檢測(cè)到19個(gè)抽穗期劍葉葉綠素含量相關(guān)QTL，分別分布在除第8、9和10染色體外的其他9個(gè)染色體上。單一QTL貢獻(xiàn)率為3.09%—13.13%，LOD值為2.74—14.08。通過(guò)物理位置比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其中10個(gè)QTL與前人定位到的葉綠素含量相關(guān)位點(diǎn)在相同或鄰近區(qū)域。和2年均被檢測(cè)到，表現(xiàn)出較強(qiáng)的穩(wěn)定性。位于第2染色體的7.63—7.71 Mb處，2年LOD值分別為14.08和7.93，貢獻(xiàn)率分別為13.13%和7.94%。位于第5染色體的23.44—23.49 Mb處，2年LOD值分別為4.31和3.76，貢獻(xiàn)率分別為3.57%和4.82%。結(jié)合功能注釋和親本間序列分析，分別在和染色體區(qū)間內(nèi)找到2個(gè)與劍葉葉綠素含量相關(guān)的基因和。這兩個(gè)基因的核苷酸序列在兩親本間均存在差異。編碼水稻天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AAT1），是水稻氮代謝途徑中的重要酶，與蛋白質(zhì)及氨基酸含量有關(guān)。編碼葉面斑點(diǎn)相關(guān)蛋白，推測(cè)與葉片顏色有關(guān)。根據(jù)在CDS+273 bp有無(wú)突變對(duì)RIL群體進(jìn)行等位型分類。在20個(gè)SPAD極端株系中，不同等位型株系的劍葉SPAD值和水分利用效率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和凈光合速率等光合作用指標(biāo)均存在顯著差異?！窘Y(jié)論】共檢測(cè)到19個(gè)控制水稻抽穗期劍葉葉綠素含量QTL，鑒定了2個(gè)穩(wěn)定存在的QTL——和，在這兩個(gè)QTL區(qū)間篩選到2個(gè)可能調(diào)控水稻抽穗期劍葉葉綠素含量的基因。其中1個(gè)（）不同等位型的光合作用參數(shù)在20個(gè)極端SPAD株系中存在顯著差異，推測(cè)其為最可能的候選基因，可用于后續(xù)劍葉葉綠素調(diào)控基因的功能研究。

水稻；重組自交系；高密度Bin圖譜；葉綠素含量；QTL

0 引言

【研究意義】水稻是世界主要三大糧食作物之一，其產(chǎn)量主要來(lái)自于葉片光合作用的產(chǎn)物。葉綠素是水稻光合作用的物質(zhì)載體，是將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的主要元素，葉綠素含量是直接決定光合潛力和初級(jí)生產(chǎn)能力的因素[1-2]。提高葉片中葉綠素含量可以提高光合速率，進(jìn)而提高產(chǎn)量。此外，作物葉片葉綠素含量不僅可以作為營(yíng)養(yǎng)水平的指標(biāo)（如氮素含量），還可以指示作物對(duì)逆境脅迫的承受程度等[3-4]。有研究報(bào)道，劍葉在作物光合作用中起著積極的作用，對(duì)產(chǎn)量具有重要的促進(jìn)作用[5-6]。因此，改善水稻劍葉的葉綠素含量是提高水稻生物量和籽粒產(chǎn)量的有效途徑。【前人研究進(jìn)展】近年來(lái)，水稻葉綠素相關(guān)性狀的研究越來(lái)越受到重視，報(bào)道了苗期、分蘗期、齊穗期等時(shí)期以及不同氮素供應(yīng)、干旱、高溫等各種脅迫下水稻葉綠素含量和葉綠素a/b比等相關(guān)性狀的QTL定位結(jié)果，克隆了、等一些相關(guān)基因[7-12]。QTL定位是目前剖析水稻復(fù)雜數(shù)量性狀最有效的工具之一。傳統(tǒng)分子標(biāo)記構(gòu)建的遺傳圖譜密度較低，定位區(qū)間過(guò)大，容易導(dǎo)致精細(xì)定位和基因克隆困難。隨著基因組測(cè)序技術(shù)的快速深入發(fā)展，水稻遺傳育種已經(jīng)進(jìn)入高通量、大規(guī)模的全基因組水平時(shí)代。SNP標(biāo)記由于分布廣泛、多樣性高、數(shù)量大等特點(diǎn)，在水稻復(fù)雜數(shù)量性狀研究中得到了高度重視和廣泛應(yīng)用。取一定數(shù)量的連續(xù)SNP標(biāo)記作為判斷染色體重組事件的最小單位（recombination bin），判斷子代每個(gè)Bin的來(lái)源，得到每個(gè)子代的全基因組物理圖譜，所構(gòu)建出的遺傳圖譜稱之為Bin圖譜[13]。Bin圖譜是基于SSR/RFLP標(biāo)記的傳統(tǒng)遺傳圖譜后的新一代遺傳圖譜，通過(guò)高通量測(cè)序進(jìn)行，自動(dòng)化程度高、構(gòu)建時(shí)間短、精確度高，可以直接進(jìn)行QTL定位后續(xù)的候選基因篩選和分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)[14]。【本研究切入點(diǎn)】已經(jīng)定位和克隆的QTL/基因并不能完全解釋水稻葉綠素相關(guān)性狀的遺傳及變異，其分子機(jī)理還需要更加深入地研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究利用抽穗期劍葉葉綠素含量存在顯著差異的秈稻Kasalath和粳稻TD70衍生的重組自交系群體（RIL）為作圖群體，構(gòu)建了包括12 328個(gè)Bin標(biāo)記的高密度連鎖圖譜，定位和分析控制抽穗期劍葉葉綠素含量的QTL，尋找一些新的、穩(wěn)定的葉綠素含量相關(guān)位點(diǎn)，以期為水稻葉綠素含量相關(guān)基因的鑒定提供基礎(chǔ)，為水稻分子標(biāo)記育種提供新的篩選靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以一個(gè)來(lái)源于天鵝谷///9520//（72-496/蘇御糯）的粳稻品系TD70和秈稻品種Kasalath為親本配制組合。2005年夏從F1單株收取自交種子，以單粒傳方法構(gòu)建成由186個(gè)株系組成的RIL群體[15]?；蛐驼{(diào)查為F10世代，表型調(diào)查為F7和F11世代。

1.2 田間試驗(yàn)及葉綠素測(cè)定

分別于2011和2020年于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所試驗(yàn)田種植186個(gè)RIL群體及2個(gè)親本，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。2011年和2020年均于5月10日播種，6月10日移栽，每個(gè)株系種植4行，每行7株，單本栽插，行株距為25 cm×16.7 cm。移栽后至收獲不施肥，擱田后，田間保持干干濕濕至收獲，其他田間管理按常規(guī)栽培管理方法。

使用葉綠素儀（SPAD-502，Monito，Japan）測(cè)量186個(gè)株系及親本抽穗期的劍葉葉綠素含量。以每株系小區(qū)內(nèi)50%單株始穗日期為該株系的抽穗日期。每個(gè)株系抽穗后第3天測(cè)定劍葉SPAD值。隨機(jī)調(diào)查3個(gè)代表性植株，每個(gè)植株選擇位置一致的3張劍葉，每張葉片測(cè)量不同位置的5個(gè)SPAD值，取平均值作為該植株的葉綠素含量SPAD值，3個(gè)植株SPAD的平均值作為整個(gè)株系的葉綠素含量值。下文中葉綠素含量均用SPAD值來(lái)表示。

1.3 連鎖圖譜構(gòu)建與QTL定位

對(duì)186個(gè)粳稻TD70與秈稻Kasalath的RILs群體進(jìn)行全基因組重測(cè)序和基于SNP的Binmap連鎖圖譜構(gòu)建。構(gòu)建的高密度遺傳圖譜含有12 328個(gè)Bin標(biāo)記，各染色體Bin標(biāo)記數(shù)為763—1 367個(gè)，標(biāo)記間平均物理距離為30.26 kb[16]。利用QTL IciMapping V3.4軟件，采用完備區(qū)間作圖法（inclusive composite interval mapping，ICIM）在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行掃描[17]，掃描步長(zhǎng)為1.0 cM，檢測(cè)控制劍葉葉綠素含量的QTL。以LOD2.5作為閾值檢測(cè)QTL的存在，QTL的命名方法參照McCouch等[18]規(guī)則。

1.4 光合速率的測(cè)定

在RIL群體中選取劍葉葉綠素含量極高和極低的株系各10個(gè)，在成熟期，利用便攜式光合儀（Li-6800，LI-COR，USA）于上午9：00—11：00進(jìn)行光合參數(shù)測(cè)定。測(cè)量時(shí)，光照有效輻射和CO2含量分別設(shè)置為1 500 μmol·m-2s-1和400 ppm。每個(gè)株系測(cè)定3個(gè)植株作為生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 RIL群體及其親本的劍葉葉綠素含量表型變異

2011和2020年RIL群體及其雙親的劍葉葉綠素含量的表型變異見(jiàn)圖1。親本TD70劍葉的SPAD平均值分別為48.2和46.2，而Kasalath的劍葉SPAD平均值為34.50和38.10，2年不同環(huán)境下TD70的劍葉葉綠素含量均極顯著高于Kasalath（＜0.01，表1）。

2011年RIL群體的劍葉葉綠素含量SPAD均值為42.08，劍葉葉綠素含量最高的株系達(dá)到49.0，最低的株系為30.51（表1）。2020年RIL群體的劍葉葉綠素含量SPAD均值為40.58，劍葉葉綠素含量最

圖1 親本及部分RIL群體株系抽穗期的劍葉葉色

高的株系達(dá)到50.83，最低的株系為27.53（表1），群體中劍葉葉綠素含量存在明顯的超親現(xiàn)象。2011和2020年RIL群體的劍葉葉綠素含量峰度和偏度的絕對(duì)值都小于1，呈連續(xù)性并為正態(tài)分布，表現(xiàn)出數(shù)量性狀的遺傳特點(diǎn)（圖2），可以對(duì)其進(jìn)行QTL定位分析。

表1 親本與重組自交系群體抽穗期劍葉的葉綠素含量

K：Kasalath；T：TD70

2.2 劍葉葉綠素含量的QTL檢測(cè)

對(duì)RIL群體進(jìn)行劍葉葉綠素含量的QTL檢測(cè)，2年共檢測(cè)到19個(gè)QTL，分別分布在除第8、9和10染色體外的其他9個(gè)染色體上（表2）。其中，2011年檢測(cè)到8個(gè)QTL，分布于第1、2、3、5、6和7染色體，LOD值介于2.74—14.08，貢獻(xiàn)率介于3.57%—13.13%。2020年檢測(cè)到13個(gè)QTL，分別位于第1、2、3、4、5、6、11和12染色體，LOD值介于2.84—9.19，貢獻(xiàn)率為3.09%—10.95%。其中2個(gè)QTL（和）在2年均被檢測(cè)到。

位于第2染色體的7.63—7.71 Mb處，在2年環(huán)境中均被檢測(cè)到，表現(xiàn)出較強(qiáng)的穩(wěn)定性。在2011年可解釋13.13%的表型變異，是2011年檢測(cè)到效應(yīng)最大的QTL，來(lái)自于Kasalath的等位基因可使劍葉葉綠素含量的SPAD值升高1.81。在2020年檢測(cè)到LOD值為7.93，可解釋7.94%的表型變異。來(lái)自于Kasalath的等位基因可使劍葉葉綠素含量的SPAD值升高1.24。

2年均被檢測(cè)到的QTL位于第5染色體的23.44—23.49 Mb處，在2011年檢測(cè)到LOD值為4.31，可解釋3.57%的表型變異，來(lái)自于TD70的等位基因可使劍葉葉綠素含量SPAD值升高0.91。在2020年可解釋4.82%的表型變異，來(lái)自于TD70的等位基因可使劍葉葉綠素含量SPAD值升高0.86。

第1染色體上共有4個(gè)影響劍葉葉綠素含量的QTL，其中和在2011年被檢測(cè)到，分別位于第1染色體的25和31 Mb處，LOD值約為6.4，分別解釋6.47%和5.55%的表型變異，增效基因均來(lái)自于Kasalath。和在2020年被檢測(cè)到，位于第1染色體3—4 Mb，LOD值都在8以上，效應(yīng)較大，解釋的表型變異大于9%，增效等位基因均來(lái)自于TD70，可使劍葉葉綠素含量SPAD值升高1.42和1.32。

表2 檢測(cè)到控制抽穗期劍葉葉綠素含量的QTL

加性效應(yīng)值為正值，表明增效等位基因來(lái)源于TD70。*：在2年間重復(fù)檢測(cè)到的QTL。下同

Positive additive effect showed that source of favorable allele came from TD70.*: the QTL was detected in both two years.The same as below

第2染色體上共有3個(gè)控制劍葉葉綠素含量的QTL，除2年均被檢測(cè)到外，2011和2020年分別檢測(cè)到和，LOD值為2.74和3.27，均為來(lái)自于Kasalath的等位基因，可使劍葉葉綠素含量的SPAD值升高1.14和1.28。

第3染色體在2011和2020年各檢測(cè)到1個(gè)QTL（和），分別位于第3染色體25 Mb和頂端，LOD值均超過(guò)4.5，解釋的表型變異大于9%，均為來(lái)自于TD70的增效等位基因，可使劍葉葉綠素含量的SPAD值升高0.9左右。

第4、7和11染色體2年均只檢測(cè)到1個(gè)QTL，其中，2011年檢測(cè)到，2020年檢測(cè)到和。是所有檢測(cè)到的位點(diǎn)中增效效應(yīng)最大的位點(diǎn)，位于第7染色體的24.3 Mb處，來(lái)自于TD70的增效等位基因可使劍葉葉綠素含量的SPAD值升高2.37。和分別解釋7.7%和3.89%的表型變異。

除在2年中均被檢測(cè)到外，第5染色體上在2020年還檢測(cè)到，位于第5染色體的頂端，LOD值4.72，來(lái)自于TD70的等位基因可使劍葉葉綠素含量的SPAD值升高1.11。

2011和2020年分別在第6染色體上檢測(cè)到1個(gè)QTL。2011年檢測(cè)到的位于29.4 Mb，LOD值4.67，解釋3.92%的表型變異；2020年檢測(cè)到的位于24.4 Mb左右，LOD值為5.63，解釋5.68%的表型變異，它們均攜帶來(lái)自Kasalath的增效等位基因。

在第12染色體上共檢測(cè)到3個(gè)QTL，均于2020年被檢測(cè)到。其中，位于8.13—8.45 Mb，攜帶來(lái)自于TD70的增效等位基因；另外2個(gè)QTL（和）位于25 Mb相鄰的區(qū)域均攜帶來(lái)自Kasalath的等位基因，可升高SPAD值1左右。

2.3 候選基因的篩選

利用水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫(kù)（http://rice.uga.edu/）對(duì)2年重復(fù)檢測(cè)到的影響劍葉葉綠素含量位點(diǎn)和區(qū)間內(nèi)的基因進(jìn)行功能注釋（表3）。

表3 2個(gè)重復(fù)檢測(cè)到QTL區(qū)間內(nèi)基因的注釋

位于第2染色體的7.63—7.71 Mb處，該區(qū)間內(nèi)經(jīng)過(guò)查詢，共有8個(gè)注釋基因，除去不轉(zhuǎn)錄蛋白、假定蛋白等基因外，還有4個(gè)注釋有功能的基因。比較這4個(gè)基因在2個(gè)親本基因組中的序列，發(fā)現(xiàn)除基因外，其他3個(gè)基因的編碼區(qū)在親本間不存在錯(cuò)義突變。是水稻天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AAT1）基因，編碼的天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（EC 2.6.1.1）是水稻氮代謝途徑中的重要酶。已有報(bào)道與控制蛋白質(zhì)和氨基酸含量的QTL有對(duì)應(yīng)關(guān)系[19]。由于氮代謝和水稻葉色有非常重要和直接的關(guān)系，初步推測(cè)其可能與葉片顏色有關(guān)[20]。進(jìn)一步序列比較發(fā)現(xiàn)TD70和Kasalath的存在20處堿基差異，其中11處為單堿基轉(zhuǎn)換。有1處錯(cuò)義突變發(fā)生在CDS+273 bp（T/C），編碼的氨基酸分別為Ser和Pro。根據(jù)在CDS+273 bp有無(wú)突變對(duì)RIL群體進(jìn)行等位型分類，在CDS+273 bp處無(wú)突變的命名為HapA，堿基T突變?yōu)镃的株系命名為HapB。分析20個(gè)葉綠素含量極端株系的光合速率測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與HapA相比，HapB的株系顯著降低了劍葉SPAD值和葉綠素含量，同時(shí)HapB株系的水分利用效率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度和凈光合速率等光合作用指標(biāo)均顯著降低（圖3）。推測(cè)是水稻光合作用通路中比較重要的功能基因。

位于第5染色體的23.44—23.49 Mb處，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，該區(qū)間內(nèi)共有9個(gè)注釋基因，除去不轉(zhuǎn)錄蛋白、假定蛋白等基因外，發(fā)現(xiàn)有1個(gè)基因（）注釋是葉面斑點(diǎn)基因，推測(cè)與葉片顏色有關(guān)?；蛐蛄蟹治霭l(fā)現(xiàn)，除外，其他基因的編碼區(qū)在2個(gè)親本基因組中不存在錯(cuò)義突變。的產(chǎn)物是可表達(dá)的蛋白，其涉及的生物學(xué)進(jìn)程包括細(xì)胞內(nèi)骨架、泛素連接酶催化活性等。TD70和Kasalath的有5個(gè)位點(diǎn)變異，其中1個(gè)錯(cuò)義突變發(fā)生在CDS+571 bp（C/A），編碼的氨基酸分別為Asp和Glu。

HapA：AAT1在CDS+273 bp處為T；HapB：AAT1在CDS+273 bp處為C。不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）

3 討論

葉綠素含量是水稻生長(zhǎng)的重要農(nóng)學(xué)參數(shù)。在一定的養(yǎng)分水平下，葉綠素含量代表了水稻的生產(chǎn)能力。當(dāng)葉綠素含量較高且相對(duì)穩(wěn)定期較長(zhǎng)時(shí)，葉片能夠吸收更多的光能，從而更好地發(fā)揮產(chǎn)量潛力。在生產(chǎn)實(shí)踐中，盡管葉片葉綠素含量可以判斷水稻植株?duì)I養(yǎng)狀況、光合能力、逆境脅迫抗性，但作為多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，遺傳復(fù)雜，而且受氮肥等因素影響較大，在育種中很難有效選擇。目前已經(jīng)定位和克隆了一些控制不同時(shí)期水稻葉片葉綠素含量的QTL，在基因克隆方面也取得了進(jìn)展。但鑒定到的位點(diǎn)大都利用初級(jí)作圖群體，標(biāo)記數(shù)目較少往往導(dǎo)致QTL區(qū)間較大，很難進(jìn)行深入的效應(yīng)估計(jì)和候選基因鑒定以及標(biāo)記輔助選擇。本研究通過(guò)高密度的Bin圖譜對(duì)水稻抽穗期劍葉的葉綠素含量進(jìn)行QTL定位分析，希望能夠?yàn)槠饰銎溥z傳規(guī)律提供新的研究基礎(chǔ)。

3.1 Bin圖譜定位水稻復(fù)雜性狀QTL具有明顯的優(yōu)勢(shì)

基于測(cè)序技術(shù)構(gòu)建的Bin圖譜與傳統(tǒng)遺傳圖譜相比，不僅標(biāo)記密度更高，能夠提供準(zhǔn)確的物理位置，而且能夠精確檢測(cè)雙交換事件，使QTL定位更準(zhǔn)確，區(qū)間更小。本研究采用基因分型測(cè)序（genotyping by sequencing，GBS）技術(shù)構(gòu)建的高密度Bin圖譜共包含12 328個(gè)Bin標(biāo)記，標(biāo)記間平均物理距離為30.26 kb，使得直接從定位區(qū)間篩選候選基因成為可能。

已有研究表明，QTL的緊密連鎖或者成簇分布可能是水稻葉綠素含量的遺傳基礎(chǔ)之一[21-22]。當(dāng)LOD值超過(guò)閾值的一段區(qū)域內(nèi)存在多個(gè)峰值時(shí)，通過(guò)傳統(tǒng)遺傳圖譜很難區(qū)分開(kāi)，往往導(dǎo)致效應(yīng)較小的位點(diǎn)被遮蓋[23]。本研究在位置相鄰的區(qū)域定位到了控制劍葉葉綠素含量的多個(gè)QTL，如和分別位于第2染色體35.03—35.10 Mb和35.12—35.15 Mb；和分別位于第12染色體25.50—25.54 Mb和25.70—25.74 Mb。此外，本研究鑒定的一些位點(diǎn)和已知水稻葉綠素含量相關(guān)QTL或者基因之間也存在這種位置相鄰的現(xiàn)象，如：位于第3染色體25.41—25.44 Mb處，而已經(jīng)克隆的葉綠素b還原酶基因（）位于25.52 Mb。和位點(diǎn)附近，也有影響葉綠素含量的谷氨酸-1-半醛轉(zhuǎn)氨酶基因（glutamate -1-semialdehyde aminotransferase，GSA）、羥甲基后膽色素原合成酶基因（）和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。位于第5染色體23.44—23.49 Mb處，而已經(jīng)克隆的水稻葉色相關(guān)基因（）位于23.35 Mb（http://www.gramene.org），編碼谷氨酸-1-半醛轉(zhuǎn)氨酶，具有一個(gè)吡哆醛磷酸鹽介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，在葉綠素生物合成從谷氨酰到葉綠素a的過(guò)程中發(fā)揮作用[24]。董驥馳等[25]利用02428和玉針香高密度Bin圖譜進(jìn)行水稻抽穗期QTL定位，發(fā)現(xiàn)定位的抽穗期QTL之間存在這種位置相鄰的現(xiàn)象。說(shuō)明利用Bin圖譜進(jìn)行QTL檢測(cè)可將位置非常臨近的QTL有效地分離開(kāi)來(lái)，測(cè)序分型得到的大量SNP標(biāo)記還可以快速應(yīng)用于分子育種，在水稻復(fù)雜性狀的定位、候選基因鑒定和標(biāo)記輔助選擇方面具有非常大的應(yīng)用前景。

3.2 本研究與前人定位QTL的比較

諸多研究者利用不同的遺傳群體和標(biāo)記，定位到很多控制不同時(shí)期、不同部位葉片的葉綠素含量相關(guān)QTL，比較發(fā)現(xiàn)這些位點(diǎn)的貢獻(xiàn)率絕大多數(shù)在10%以下，主效基因較少，表明葉綠素含量主要由微效QTL控制，這和葉綠素a和葉綠素b通過(guò)多個(gè)步驟合成相一致[22]。本研究應(yīng)用水稻秈粳交RIL群體構(gòu)建高密度Bin連鎖圖譜，2年共檢測(cè)到19個(gè)控制抽穗期劍葉葉綠素含量的QTL，貢獻(xiàn)率為3.09%—13.13%，與上述研究結(jié)果基本一致，反映了葉綠素含量這一生理性狀遺傳的復(fù)雜性。

通過(guò)遺傳圖譜的對(duì)比（http://www.gramene.org），發(fā)現(xiàn)本研究定位到的一些劍葉葉綠素含量位點(diǎn)和已知影響水稻葉綠素含量的位點(diǎn)間有著區(qū)間的重疊（表4）。如本研究檢測(cè)到的位于第1染色體31.76—31.83 Mb，在該區(qū)域檢測(cè)到多個(gè)相關(guān)QTL。胡頌平等[26]利用珍汕97B/IRAT109的RILs群體在30.1—33.86 Mb檢測(cè)到控制干旱脅迫下的劍葉或倒2葉葉綠素含量的QTL，表型貢獻(xiàn)率為6.46%，LOD值為4.56。Teng等[27]利用ZYQ8/JX17的DH群體，檢測(cè)到控制分蘗期上部展開(kāi)葉葉綠素含量的，位于30.06—32.06 Mb。劉進(jìn)等[28]利用沈農(nóng)0530-9/北陸129的F2及F2:3群體，在這個(gè)區(qū)域也檢測(cè)到了控制拔節(jié)期劍葉葉綠素含量的QTL。此外，胡茂龍等[29]利用日本晴/Kasalath//日本晴的BILs群體，在第1染色體25.13—26.19 Mb區(qū)間檢測(cè)到控制抽隨后7 d葉綠素含量的位點(diǎn)，表型貢獻(xiàn)率為10.7%，LOD值為3.34，和本研究的在同一區(qū)域內(nèi)。

在2年均被檢測(cè)到的位點(diǎn)和附近也發(fā)現(xiàn)有多個(gè)葉綠素含量相關(guān)位點(diǎn)。在第2染色體7.63—7.71 Mb內(nèi)的位點(diǎn)，表型貢獻(xiàn)率為13.13%，LOD值為14.08，是本研究定位到的效應(yīng)最大的葉綠素含量位點(diǎn)。在其所在區(qū)域有多個(gè)相關(guān)QTL被檢測(cè)到，如利用沈農(nóng)265/麗江新團(tuán)黑谷的RILs群體、崗46B/A232的RILs群體、ZS97/WY2的DHs群體，以成熟期、分蘗期劍葉葉綠素含量和發(fā)育期劍葉葉綠素b含量為表型，分別在第2染色體2.88—9.47、5.20—8.76和7.43—11.41 Mb區(qū)間內(nèi)檢測(cè)到了相關(guān)QTL[11, 30-31]。這些QTL區(qū)間較大，都覆蓋了本研究定位的。第5染色體上的位點(diǎn)也是相同的情況，利用窄葉青8號(hào)/京系17的DHs、Dular/Lemont RILs、十和田/麗江新團(tuán)黑谷RILs分別檢測(cè)到了控制齊穗期劍葉葉綠素b含量、齊穗期劍葉葉綠素含量和孕穗期劍葉葉綠素b含量的位點(diǎn)，分別在第5染色體19.27—31.45 Mb和3.89—24.09 Mb附近，覆蓋了本研究所在的23.44—23.49 Mb區(qū)間[32-35]。和不僅在本研究中穩(wěn)定存在，而且位于多個(gè)不同群體鑒定到的葉綠素含量QTL的區(qū)域內(nèi)，值得進(jìn)一步深入研究。

位于第4染色體23.3 Mb，表型貢獻(xiàn)率為7.71%，LOD值為7.47，在該區(qū)域檢測(cè)到多個(gè)已知的葉綠素含量相關(guān)QTL，與分蘗期劍葉、苗期的葉綠素含量、抽穗5和25 d葉綠素含量的降低等性狀相關(guān)[30, 36, 38]。已經(jīng)定位的苗期葉綠素含量QTL（AQAE002）覆蓋了此區(qū)域[36]。、、這3個(gè)位點(diǎn)分別和已經(jīng)發(fā)表的控制干旱脅迫下的劍葉或倒2葉葉綠素含量、抽穗后5 d和25 d葉綠素含量的降低、成熟期劍葉的葉綠素含量QTL存在區(qū)域重疊現(xiàn)象，其他QTL所在區(qū)域暫時(shí)未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報(bào)道。

表4 本研究定位的QTL和已知葉綠素含量相關(guān)位點(diǎn)的位置比較

4 結(jié)論

檢測(cè)到19個(gè)控制抽穗期劍葉葉綠素含量的QTL。鑒定了2個(gè)穩(wěn)定存在的QTL——和。編碼水稻天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的可能是調(diào)控抽穗期劍葉葉綠素含量的候選基因。

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Mapping of QTLs for Chlorophyll Content in Flag Leaves of Rice on High-Density Bin Map

ZHAO Ling, ZHANG Yong, WEI XiaoDong, LIANG WenHua, ZHAO ChunFang, ZHOU LiHui, YAO Shu, WANG CaiLin, ZHANG YaDong*

Institute of Food Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu High Quality Rice R&D Center /Nanjing Branch of China National Center for Rice Improvement, Nanjing 210014

【Objective】Finding new loci and genes related to rice chlorophyll content, and providing new theoretical basis for the research on the genetic mechanism of rice chlorophyll content.【Method】A recombinant inbred line (RIL) population containing 186 lines was constructed by crossing the japonica rice TD70 and the indica rice Kasalath with obvious difference in the chlorophyll content of the flag leaf.The two parents and RIL population were re-sequenced to construct a high-density genetic linkage map with 12 328 recombination Bin markers.The RILs and two parents were planted in fields at the Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, in Nanjing in 2011 and 2020.The contents of chlorophyll of flag leaves were directly measured using the chlorophyll meter SPAD-502 on the 3rdday after heading.QTLs that control the chlorophyll content of the flag leaf at the heading stage of rice were detected by IciMappingv3.4 software with inclusive compound interval mapping method.The photosynthesis parameters of 20 SPAD extreme strains in the RIL population were measured with a portable photosynthesis system.【Result】19 QTLs controlling chlorophyll content of flag leaves were detected on 9 chromosomes except Chr.8, Chr.9 and Chr.10 in two years.The phenotype variation explained (PVE) of single QTL ranged from 3.09% to 13.13%, LOD value ranged from 2.74 to 14.08.After comparing the physical positions, 10 QTLs were found to locate in the same interval or adjacent to previously QTLs.andwere detectedevery year showing their genetic stabilitywas mappedbetween the 7.63-7.71 Mb on chromosome 2, and the two-year LOD values are 14.08 and 7.93 with the PVE 13.13% and 7.94%, respectively.was mappedbetween the 23.44-23.49 Mb on chromosome 5, and the two-year LOD values are 4.31 and 3.76, respectively.After the annotation and sequences analysis of genes located in the region ofandtwo genes,and, were found to be associated with chlorophyll content of flag leaves in the rice.There are differences in sequences of the two genes between TD70 and Kasalath.is thegene encoding the Aspartate Aminotransferase, whichis an important enzyme in nitrogen metabolism and related to protein and amino acid content of rice.encodes protein relating to spotted leaf, which might associate with leaf color.Based on the mutation ofat CDS+273 bp, the haplotypes ofwere classified in RIL population.Among the 20 extreme SPAD RIL lines,there were significant differences between different haplotype of【Conclusion】19 QTLs associated with chlorophyll content in flag leaf at heading stage of rice were detected and two stable QTL loci,andwere identified.Two candidate genes were obtained after annotation and sequence comparison.One of them,, was considered as the most possible candidate gene after effort analysis of different haplotypes in photosynthetic efficiency.The QTLs and gene we obtained could be used for subsequent functional studies of flag leaf chlorophyll regulation and molecular marker breeding.

rice (L.); recombinant inbred lines; high-density bin map; chlorophyll content; QTL

2021-10-20；

2021-11-25

江蘇省重點(diǎn)研究發(fā)展計(jì)劃（BE2019375)

趙凌，Tel：025-84390306；E-mail：zhaoling@jaas.ac.cn。通信作者張亞?wèn)|，Tel：025-84390314；E-mail：zhangyd@jaas.ac.cn

（責(zé)任編輯 李莉）