microRNA參與植物次生代謝與非生物脅迫的調控

李可欣， 田同同， 周 波,2)*

(1)東北林業(yè)大學生命科學學院， 哈爾濱 150040；2)東北鹽堿植被恢復與重建教育部重點實驗室(東北林業(yè)大學)， 哈爾濱 150040)

植物中的 miRNA(microRNA)由MIR基因編碼，其生物化學合成途徑包括3個主要步驟：轉錄、加工和功能復合物裝配。高通量測序等生物技術的進步和發(fā)展使鑒定大量編碼基因和非編碼RNA成為可能。成熟的miRNA長度大多為21 nt，它們與Argonaute (AGO)家族蛋白質結合，形成RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)后進一步通過降解靶mRNA或抑制翻譯來負調控基因表達水平[1-2]。

植物miRNA結合和調控靶基因表達的方式主要有3種類型：翻譯抑制、剪切降解和介導植物DNA的甲基化。通常認為翻譯抑制和剪切降解取決于miRNA與靶RNA之間互補配對的復雜性。序列幾乎或完全互補時會引起靶mRNA的快速降解；當序列互補程度較低時，靶mRNA的翻譯被直接抑制，有效達到蛋白質表達量降低的效果。此外，植物中的MIR基因還可以通過轉錄水平介導目標DNA甲基化的水平[3]。

植物在生長發(fā)育的過程中受到外部環(huán)境的影響，本文主要概述了參與非生物脅迫和植物次生代謝功能相關的miRNA及其靶基因的研究進展，以期更好的理解參與次生代謝和環(huán)境響應的miRNA的調控通路和功能。

1 植物微RNA與次生代謝

1.1 黃酮類生物合成相關miRNA

黃酮類化合物(flavonoids)是廣泛分布于高等植物中的一類次生代謝產物，具有增強免疫力、預防及治療心血管疾病、抑癌[4-5]、抗衰老和抗病毒等生理活性。研究證明，miRNAs主要通過調控參與黃酮類化合物合成過程的關鍵基因或轉錄因子，影響植物的多種生理進程[6]。近年來，花青素(anthocyanins)的合成調控得到了廣泛研究，明確了MYB(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)、SPL(squamosa promoter-binding protein like)等轉錄因子家族作為miRNA的靶標廣泛參與花青素的合成。Li等[7]通過小RNA測序、KEGG通路分析等技術將miR858確定為奇異果花青素合成的負調控因子，miR858的過度表達導致其靶基因MYBC1編碼的MYBC1轉錄因子表達量下降，不能啟動與花青素合成關鍵酶無色花青素雙加氧酶(leucoanthocyanidin dioxygenase，LODX)基因的表達，進而使得花青素的積累量下調。對茶樹miR828a的研究表明，其能夠靶向MYB4、MYB23和MYB82，進而負調節(jié)花青素的合成水平[8]。在過表達miR156的蘋果[9]和白楊[10]中，也發(fā)現了多種轉錄因子MYB、SPL表達量下調，花青素水平變化的現象。因此，miRNA作為非編碼的sRNA可以通過靶向轉錄調控基因，調控植物花青素合成途徑，這為理解植物花青素合成的復雜調控網絡提供了更多的線索。

1.2 萜類生物合成相關miRNA

青蒿素(artemisinin，ART)作為一種重要的次生代謝產物，其生物合成過程得到了廣泛的研究。Khan等人[11]經研究發(fā)現，青蒿的miR159、miR172和miR166均靶向細胞色素P450還原酶(cytochrome P450 reductase，CPR)合成基因。CPR參與催化青蒿素合成的三個步驟。miR858的靶基因是編碼紫穗槐二烯合酶(amorpha-4,11-diene synthase, ADS)的ADS。ADS也是參與青蒿素合成過程中的關鍵酶，在青蒿素合成通路中發(fā)揮著重要作用。極少種miRNA能夠增強青蒿素的表達，如miR5083和miR403可正調控NAC1基因，上調ADS、細胞色素P450單加氧酶基因CYP71AV1的表達量。Saifi等人[12]發(fā)現，miRStv_11和miR319 g分別上調貝殼杉烯酸羥化酶(Kaurenoicacid-13-hydroxylase，KAH)和下調貝殼杉烯氧化酶 (Kaureneoxidase，KO)、貝殼杉烯合酶 (Kaurenesynthase，KS)的表達。KAH、KO、KS都是參與合成甜菊苷的重要酶類。

1.3 生物堿類生物合成相關miRNA

生物堿(alkaloid)是一類含氮小分子化學物質，種類繁多，合成途徑復雜。pso-miR13和pso-miR 2161能分別抑制BIA生物合成過程中的關鍵酶7′-O-甲基轉移酶 (7′-O- transmethylase,7-OMT)和4′-O-甲基轉移酶(4′-O- transmethylase,4-OMT)基因，從而下調芐基異喹啉生物堿(benzylisoquinoline alkaloid，BIA)表達[13]。在馬鈴薯中鑒定發(fā)現，miR408靶向VS1環(huán)化酶(vetispiradiene cyclase)的合成基因，VS1的作用底物是糖苷生物堿合成過程的前體物質法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate，FPP)。miR408抑制VS1的合成導致底物FPP含量增加，從而使糖苷生物堿獲得一定的積累。Chen等[15]通過研究發(fā)現，在火龍果中多種miRNA通過下調甜菜堿合成通路中目標基因的轉錄水平參與甜菜堿的積累過程。例如miR157b靶向SPL6、miR858靶向MYBC1和MYB12等。

Fig.1 The miRNA-mediated synthesis pathway of secondary metabolites in plants A variety of miRNAs affect the synthesis of secondary metabolites by promoting or inhibiting the expression of target genes in different plants. “—| ”means negative regulation. “→”means positive regulation

2 植物微RNA與非生物脅迫

2.1 植物miRNA與干旱脅迫

水是制約植物生存、發(fā)育和繁衍等各種生命活動不可或缺的重要因素。植物缺水時會導致體內水分平衡被破壞，出現光合速率減弱、呼吸作用異常、葉片萎蔫等常見的生理生化變化，嚴重時造成植物死亡。人們在研究后發(fā)現，miRNA在維持植物水分平衡、抵抗干旱帶來的氧化應激影響中發(fā)揮著不可忽視的作用。研究證明，大部分植物在干旱條件下都有與正常生理環(huán)境差異表達的miRNA，它們極有可能在消除氧化應激影響中扮演著重要角色。有研究發(fā)現，大麥miR397的靶基因是漆酶基因LAC。漆酶能夠催化合成木質素，被認為參與了植物的發(fā)育和逆境反應[16]。除此之外，Lpez-Galiano等人[17]的研究指出，miR159及其靶基因MYB33的表達模式相反。干旱脅迫模式下導致miR159下調和MYB33表達增強。miR166f是桑樹抵抗干旱的正調控因子。過表達miR166f會使靶標同源異型域—亮氨酸拉鏈(HD-Zip)轉錄因子和具有組蛋白精氨酸去甲基化酶活性的JMJD6(Jmjc domain-containing 6，JMJD6)表達量下調，這種變化增強了桑樹對干旱環(huán)境的適應性[18]。研究發(fā)現，在水分充足和干旱情況下西藏沙棘(Hippophaethibetana)2種新miRNA(novel_miR_24和novel_miR_87)的表達量發(fā)生了顯著變化[19]。這在一定程度上為完善miRNA參與的耐旱植物復雜調控網絡奠定了基礎。研究表明，低到中等程度表達miR156可以沉默花青素合成關鍵酶二氫黃酮醇-4-還原酶((dihydroflavonol 4-reductase,DFR)編碼基因的轉錄阻遏因子SPL13，增強紫花苜蓿的抗旱能力。

2.2 植物miRNA與溫度脅迫

2.2.1 植物miRNA與高溫脅迫 高溫脅迫能夠造成植物生物膜破壞，葉片出現死斑和萎蔫，光合速率和蒸騰速率下降，呼吸速率降低等多種不利影響。研究發(fā)現，在擬南芥中miR160可以對ARF17，ARF16和ARF10等靶基因的表達產生抑制作用，對增強熱脅迫的適應力產生消極影響[21]。在玉米中也發(fā)現了幾個關鍵的熱響應miRNA及其對應的靶標。高溫下miR172、miR164、miR396被抑制表達，導致靶向的AP2/ERF(APETALA2/ethylene-responsive factor)、NAC和生長調控因子(growth-regulating factor，GRF)下調，器官發(fā)育和信號轉導等過程均被影響[22]。為闡明miRNA介導的玉米對高溫脅迫的轉錄后調控提供了研究基礎。Ahmed等人[23]對38℃熱處理后的大白菜葉片組織RNA文庫進行測序，得出miR172在高溫脅迫下調控開花白菜中包括花期同源蛋白質AP2、乙烯響應轉錄因子在內的AP2-like轉錄因子表達的結論。棉花在產孢子的細胞增殖階段、減數分裂階段、小孢子釋放階段和花粉成熟階段分別由多種miRNA及其靶基因響應干旱脅迫[24]。例如miR172與其靶基因AP2在減數分裂時期發(fā)揮防御作用，花粉成熟的最后階段則由miR393-TIR1/AFB(transport inhibitor response 1/Auxin signaling F-box)積極響應。這些miRNA是棉花適應高溫環(huán)境的主要和重要調控因子，具有正向或負向調控模式。

2.2.2 植物miRNA與低溫脅迫 溫度是影響植物生長發(fā)育和果實采后生活質量的主要環(huán)境因子。為了研究miR528提高水稻抗寒性的潛在分子作用機制，Tang等人[25]檢測了脅迫相關MYB轉錄因子在miR528轉基因水稻細胞中的表達量。研究證明，miR528通過抑制脅迫應答相關轉錄因子MYB30基因的表達，從而增強BMY2、BMY6和BMY10基因表達量增加，進而增強細胞活性、活化抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)等提高水稻對低溫的耐受性。在香蕉中也發(fā)現，許多參與響應低溫脅迫的miRNA及靶標例如SPL、蛋白激酶2(casein kinase 2,CK2)等[26,27]。它們參與信號轉導，協調調控冷脅迫下機體的許多生化反應。也有研究發(fā)現，部分藥用植物黃芪響應冷脅迫的部分基因調控網絡，其中miR168通過靶向AGO基因在反饋調控中發(fā)揮重要作用。miR858、miR171、miR169等多個miRNA通過靶向多種轉錄因子例如SPL、MYB調控植物生長發(fā)育過程[28]。

2.3 植物miRNA與鹽脅迫

鹽分對植物的生長有著至關重要的作用，但超過一定限度，過量的可溶性鹽對植物將產生毒害作用。過高的鹽分容易引發(fā)次生脅迫，例如氧化應激反應和營養(yǎng)代謝失調，導致細胞損傷、生長抑制和作物產量下降等諸多問題的發(fā)生。鐵超氧化物歧化酶(iron superoxide dismutase 1 ，FSD1)是棉花抵抗鹽脅迫的重要酶。過表達miR414c的棉花FSD1表達量下降，使棉花抵御鹽毒害的能力顯著下降[29]。miR408在植物中穩(wěn)定存在，核酸序列保守，過表達大麥miR408的煙草株系在磷饑餓和鹽脅迫條件下有明顯的表型變化，且miR408的靶基因磷酸轉運體(phosphate transporter，PT)基因NtPT2、編碼脫落酸受體和SnRK2蛋白質的基因NtPYL2和NtSAPK3轉錄豐度較野生型相比均有所上調，增強了大麥吸收磷的能力[30]。Ma等人[31]則通過研究驗證了miR156a靶向SPL13轉錄因子，SPL13進一步靶向參與多種植物鹽脅迫耐受生物通路的轉錄因子WRKY100的啟動子區(qū)域，闡明了蘋果miRNA響應鹽脅迫的網絡機制。另有研究分析了鹽生植物紅砂miRNA參與鹽脅迫環(huán)境下種子萌發(fā)的具體機制。研究數據顯示，miR4995和miR396分別靶向編碼脫落酸8’-羥化酶的關鍵基因CYP707A2和生長素通路中的重要基因HB33，參與紅砂種子的萌發(fā)[32]。

2.4 植物miRNA與重金屬脅迫

鐵、銅、鋅等重金屬在植物體內多種生理過程中發(fā)揮重要作用。然而重金屬在植物體內的過度積累會毒害植物，影響植物的生長和生產力。此外，重金屬的積累還會影響植物的生長和生產力，通過食物鏈富集對人和動物產生影響，引發(fā)疾病，誘導細胞損傷。銅元素是多種酶的輔因子，也是質體藍素的重要組成部分。銅積累會制約植物的光合作用和新陳代謝等過程，導致細胞膜破壞、活性氧基團增加。研究發(fā)現，miR393及靶標運輸抑制劑響應蛋白1 (transport inhibitor response 1,TIR1)、AFB1、AFB2和AFB3的相互作用，可能在葡萄維持銅離子穩(wěn)態(tài)中扮演著重要角色[33]。在山核桃中也發(fā)現，能夠靶向銅鋅超氧化物歧化酶和線粒體細胞色素C氧化酶5b亞基的miR398[34]。抑制miR398的表達可以使超氧化物歧化酶濃度增加，清除氧自由基，減輕銅的毒害影響。鎘元素也會對植物產生氧化毒害作用，鎘的積累會導致植物發(fā)育不良，植株枯黃甚至死亡。Jian等人[35]研究認為，玉米中miR166靶向bZIP轉錄因子(basic region-leucine zipper，bZIP)、miR156b靶向Squamosa啟動子結合蛋白(squamosa promoter binding protein,SBP)，并且可能是通過負調控來維系玉米根系中Cd2+的穩(wěn)態(tài)。在鎘處理后的水稻中也發(fā)現，miR268的靶基因自然抵抗相關巨噬細胞蛋白3表達顯著下降的現象[36]。

Fig.2 The miRNA-mediated pathway under abiotic stress Various miRAs are involved in response to abiotic stress by targeting different transcription factors in plants. These transcription factors play a positive or negative role in enhancing plant stress tolerance. “—| ”means negative regulation. “→”means positive regulation

3 次生代謝與非生物脅迫的聯系

當植物受到外環(huán)境不利因素影響時，miRNA及次生代謝產物會發(fā)生相應變化以響應壓力刺激，減輕活性氧基團對機體的毒害作用。

木質素、花青素等多種次生代謝產物被認為在植物應對生長和發(fā)育過程中對生物和非生物脅迫具有重要作用[37]。亞麻中次生代謝產物木質素的形成與miR397b、miR397及各自的靶基因表達相關。miR319靶向轉錄因子MYB，預測其調控植物木質素生物合成過程[38]。也有研究發(fā)現，甘薯參與花青素合成代謝的miRNA例如miR156、miR159大多數靶向參與響應非生物脅迫的轉錄因子例如MYB、SPL等，推測這些miRNA通過調控靶基因的表達量參與甘薯花青素的合成代謝，從而響應逆境脅迫[39]。在應激條件下，miR156-SPL9可能通過花青素著色產物因子PAP1(productionofanthocyaninpigment1 )和DFR途徑直接影響花青素的生物合成，進而阻斷花青素的生物合成，提高了植物對鹽脅迫和干旱脅迫的敏感性[40]。HY5(elongated hypocotyl 5)轉錄因子能調節(jié)花青素生物合成途徑中參與低溫響應的關鍵成分查爾酮合成酶、查爾酮異構酶的積累。低溫誘導下甜瓜miR319c表達量下降，從而促進HY5的增加[41]。

此外，某些非生物脅迫也會調控植物次生代謝產物的合成與降解。鹽和干旱脅迫均可增強丹參miR396b的表達。過表達mR396b抑制丹酚酸的合成，促進了丹參酮的積累[42]。植物激素例如脫落酸、乙烯等也能通過調控信號傳導過程參與植物響應逆境的生理過程。Sun等人[43]在鹽脅迫處理的蘿卜轉錄組中發(fā)現miR160b表達上調，其靶基因ARF16和ARF17在調節(jié)生長素表達過程中發(fā)揮作用。在甘薯、黃芪[44]和浮萍[45]中，也發(fā)現類似的miRNA靶向ARF，響應非生物脅迫的現象。這在一定程度上說明，miR160及其靶基因生長素響應因子ARF在響應非生物脅迫、調節(jié)生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。綜上所述，植物次生代謝與非生物脅迫具有密切聯系。環(huán)境壓力例如鹽、溫度會影響植物的代謝過程，調控次生代謝產物的表達。次生代謝產物合成后通過信號轉導、氧化還原等機制緩解或清除活性氧基團等的毒害作用，提高機體的生存率。

4 問題與展望

miRNA作為基因調控網絡中重要的調控因子，在協調次生代謝產物的生物合成和抵御環(huán)境壓力的過程中扮演了重要角色。保守miRNA例如miR160在多種植物，例如甘薯、黃芪和蘿卜中都靶向相似的基因家族，在非生物脅迫下發(fā)揮類似的作用[39,43,44]。非保守miRNA在不同植物中選擇性表達，調控不同生理過程。隨著生物技術的不斷發(fā)展以及多領域交叉新興學科的誕生，多種參與次生代謝產物合成的植物miRNA及其靶基因被鑒定和預測出來，為完善miRNA調控次生代謝網絡，研究miRNA具體作用的分子機制提供了新方法和新思路。近年來，在不同種類的植物中也發(fā)現了大量參與響應非生物脅迫的miRNA。這些miRNA與目標基因的相互作用構成監(jiān)管機體穩(wěn)態(tài)網絡的一個重要組成部分，控制各種生化反應以響應壓力，增強自身適應環(huán)境的能力。目前，關于miRNA在參與合成次生代謝產物，以及次生代謝產物與非生物脅迫的聯系方面的研究性文獻較少，可供參考的數據不多，仍有較多植物尚未得到更深層次的探索。雖然已經發(fā)現了許多與響應環(huán)境壓力和調控次生代謝過程有關的miRNA，但對于miRNA在不同植物中調控非生物脅迫和次生代謝產物生物合成的具體機制尚未得到全面的研究，且大多集中在藥用植物和農作物中。次生代謝產物在植物清除氧自由基，緩解惡劣環(huán)境毒害作用的分子機制也未見統一的結論，需要更多可靠的證據來證明它們的真正作用。研究者們較熱衷于挖掘與植物抵御惡劣環(huán)境的優(yōu)良特性相關miRNA及其作用基因，以期改良植物特性，培育優(yōu)勢作物，增加作物產量。由于miRNA發(fā)現較晚，在植物代謝、脅迫響應通路中的研究較少，要想深入闡釋其分子機制，還有待于我們進一步探索和發(fā)現。相信在生物技術更加先進的未來，植物miRNA的作用機制及調控網絡能得到進一步的解讀和完善，為培育優(yōu)良品種做出貢獻。