鼠疫耶爾森菌重組酶聚合酶核酸擴增熒光檢測方法的建立

裴美娟，李淑磊，李夢藍，劉朝陽，宋 娜，王玉飛

鼠疫是由鼠疫耶爾森菌引起的烈性傳染病，又稱為黑死病，曾發(fā)生幾次歷史大流行，對人類的健康造成巨大的危害。近年來我國時有鼠疫發(fā)生的報道，對人民的健康造成威脅。鼠疫起病急、病程短、病死率高，臨床癥狀常表現(xiàn)為發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大、出血、咳嗽，呼吸困難等癥狀，因此進行鼠疫的早期診斷和檢測至關(guān)重要。目前，鼠疫耶爾森菌常用的實驗室檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)、細菌分離培養(yǎng)等。但這些常用的實驗室檢測方法存在耗時長、操作復(fù)雜、檢測效率低等缺陷，難以滿足現(xiàn)場快速檢測的要求。重組酶聚合酶核酸擴增(recombinase polymerase amplification，RPA)是一種等溫核酸檢測技術(shù)，簡單快速，配合一個便攜式檢測設(shè)備即可實現(xiàn)現(xiàn)場的檢測和判定，這使得在低資源流行環(huán)境下的即時檢測成為可能。因此本試驗建立了一種檢測鼠疫耶爾森菌的熒光RPA方法，可特異靈敏地對鼠疫耶爾森菌進行檢測，為鼠疫的現(xiàn)場早期檢測提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料 核酸擴增試劑盒(recombinase aided amplification，RAA)(熒光型)購自杭州眾測生物科技有限公司；小提質(zhì)粒試劑盒，感受態(tài)DH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pUC57購自北京華越洋生物科技有限公司。金黃色葡萄球菌、草綠色鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、單核李斯特菌、紅斑丹毒絲菌、大腸桿菌、沙門氏菌、布魯氏菌、巴氏桿菌、流感嗜血桿菌等常見細菌的DNA由遼寧省沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院人獸共患病預(yù)防實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 從Genebank中下載鼠疫耶爾森菌的參考序列(CP045258.1)，在BLAST上查找其特異性區(qū)域及保守區(qū)，依據(jù)RPA引物設(shè)計指導(dǎo)，用Primer Premier 6軟件設(shè)計特異性的引物和探針，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 DNA模板的制備 BLAST比對后選擇特異性的鼠疫耶爾森菌序列，交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成后插入pUC57克隆載體，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌后構(gòu)建克隆菌株。將克隆菌株培養(yǎng)后采用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，使用紫外分光光度計測定質(zhì)粒濃度，根據(jù)質(zhì)粒片段大小計算出拷貝數(shù)，作為RPA試驗?zāi)０濉?/p>

1.2.3 鼠疫耶爾森菌熒光RPA反應(yīng)溫度優(yōu)化 參照RAA核酸擴增試劑(熒光型)試劑盒的說明，將25 μl A Buffer、2.0 μl上游引物(10 μm)、2.0 μl下游引物(10 μm)、0.6 μl探針(10 μm)、1 μl DNA模板、16.9 μl水的混合物加入到裝有反應(yīng)干粉的檢測管中，再向檢測管蓋上加入2.5 μl的B Buffer，蓋上管蓋，上下顛倒充分混勻5～6次，低速離心10 s。然后放入RPA恒溫擴增熒光檢測儀T8(英國TwistDx公司)中，其中鼠疫耶爾森菌DNA為陽性對照，無菌水為陰性對照，同時設(shè)置3個復(fù)孔，在不同溫度反應(yīng)20 min，實驗重復(fù)3次后判定結(jié)果。

1.2.4 鼠疫耶爾森菌熒光RPA特異性檢測 為了確定鼠疫耶爾森菌熒光RPA的特異性，將金黃色葡萄球菌、草綠色鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、單核李斯特菌、紅斑丹毒絲菌的細菌DNA混合為革蘭陽性菌樣品作為對照組1，將大腸桿菌、沙門氏菌、布魯氏菌、巴氏桿菌、流感嗜血桿菌的DNA混合為革蘭陰性菌的樣品作為對照組2，將無菌ddHO設(shè)置3個復(fù)孔，然后作為樣品進行熒光RPA檢測，實驗重復(fù)3次后判定所建立的熒光RPA的特異性。

1.2.5 鼠疫耶爾森菌熒光RPA靈敏性檢測 將質(zhì)粒模板進行10倍梯度稀釋，分別稀釋為10～1000 copies/μl的濃度，然后分別吸取1 μl作為模板配成反應(yīng)體系，將無菌水作為模板設(shè)置陰性對照，同時設(shè)置3個復(fù)孔，放入T8中進行檢測，實驗重復(fù)3次后判定所建立的熒光RPA的靈敏性。

1.2.6 模擬樣品的檢測 采用雙盲法，以鼠疫耶爾森菌的質(zhì)粒和大腸桿菌的DNA為材料，人為配制成50份含有不同濃度質(zhì)粒的人工模擬樣品，將質(zhì)粒模板進行10倍梯度稀釋，分別稀釋為1000、100、10 copies/μl的濃度，使用所建立的熒光RPA進行檢測，檢測時設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次，將檢測結(jié)果與質(zhì)?；旌锨闆r進行比對，判定檢測的準確性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 定量數(shù)據(jù)的顯著性分析采用單因素方差分析，以<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用GraphPad Prism 6.0進行數(shù)據(jù)處理、圖片制作。

2 結(jié) 果

2.1 鼠疫耶爾森菌的上下游引物設(shè)計及探針序列 通過BLAST比對發(fā)現(xiàn)，鼠疫耶爾森氏菌的DNA腺嘌呤甲基化酶基因1994590-1994804區(qū)間序列(圖1)特異性強，與其它菌或其它種的耶爾森氏菌存在很大的序列差異，因此將其選擇為RPA檢測的目的基因。依據(jù)熒光RPA引物和探針的設(shè)計規(guī)則，在DNA腺嘌呤甲基化酶基因上設(shè)計了引物和探針(表1、圖1)，并對其特異性進行了BLAST比對分析。

圖1 鼠疫耶爾森菌特異性序列及RPA引物和探針位置

表1 試驗使用的RPA引物和探針

2.2 鼠疫耶爾森菌熒光RPA反應(yīng)溫度的優(yōu)化 以鼠疫耶爾森菌DNA質(zhì)粒為模板，以上述RPA反應(yīng)體系進行了不同溫度下的RPA反應(yīng)，以獲得最優(yōu)的反應(yīng)溫度。結(jié)果表明反應(yīng)溫度為35 ℃時效果最佳，陽性管(紅色曲線)出現(xiàn)明顯的熒光強度，而陰性管(紫色曲線)只發(fā)生了輕微的熒光強度改變；其他溫度下陰性管出現(xiàn)了較大的熒光強度變化，發(fā)生了假陽性反應(yīng)，同時在39 ℃時陽性的熒光強度也很低，只有1200，反應(yīng)效果差(圖2)。因此，在后面的試驗中均采用35 ℃的反應(yīng)溫度。

圖2 重組酶聚合酶核酸擴增反應(yīng)溫度的優(yōu)化

2.3 鼠疫耶爾森菌熒光RPA試驗特異性 為判定RPA反應(yīng)的特異性，分別以鼠疫耶爾森陽性質(zhì)粒、革蘭陽性菌DNA、革蘭陰性菌DNA為模板，在T8 RPA熒光檢測儀中35 ℃反應(yīng)20 min。結(jié)果表明只有含鼠疫耶爾森基因的質(zhì)粒樣品有明顯的擴增曲線產(chǎn)生，而陰性對照與其他菌株混合組成的革蘭陰性和陽性樣品均無熒光強度變化(圖3)，表明所建立的鼠疫耶爾森菌熒光RPA具有很好的特異性。

圖3 鼠疫耶爾森菌重組酶聚合酶核酸擴增特異性

2.4 鼠疫耶爾森菌熒光RPA靈敏性 分別以1 μl 10～1000 copies/μl濃度的鼠疫耶爾森菌質(zhì)粒為模板配成反應(yīng)體系放入T8檢測儀中進行檢測，結(jié)果顯示鼠疫耶爾森菌質(zhì)粒模板濃度為1000 copies/μl的反應(yīng)管中出現(xiàn)明顯的熒光強度改變，而100 copies/μl的反應(yīng)管中僅出現(xiàn)輕微的熒光強度改變，10 copies/μl以及陰性對照的反應(yīng)管中幾乎沒有熒光強度改變(圖4)，表明所建立的鼠疫耶爾森菌RPA檢測方法具有較好的靈敏性，可檢測到低至100 copies/μl的基因。

圖4 鼠疫耶爾森菌重組酶聚合酶核酸擴增靈敏性

2.5 模擬樣品的檢測 對50份人工模擬樣品的檢測結(jié)果表明，所建立的鼠疫耶爾森菌熒光RPA檢測方法可以從30份摻雜質(zhì)粒的人工模擬樣品中檢出29份陽性，從20份未摻雜質(zhì)粒的樣品中檢出20份陰性，總檢測符合率為98.0%，表現(xiàn)出很好的檢測準確性。對檢測失敗模擬樣品的分析發(fā)現(xiàn)，其原因是質(zhì)粒摻雜量太少，低于100 copies/μl。

3 討 論

鼠疫是由鼠疫耶爾森菌引起的一種烈性傳染病，其傳染源主要是嚙齒動物，傳播媒介主要是鼠蚤，在我國屬于甲類傳染病之首。同時鼠疫菌也是生物戰(zhàn)最有可能使用的生物劑之一。雖然當前該病流行不嚴重，但仍時有發(fā)生，2020-07還曾發(fā)生鼠疫病例。鼠疫具有起病急、病程短、傳染性強、病死率高的特點，傳統(tǒng)的鼠疫菌“四步檢驗法”及血球凝集試驗在鼠疫的確診中起著重要的作用，但是存在著操作復(fù)雜、耗時長、安全防護要求高等缺點。早期診斷可給該病的預(yù)防及治療提供寶貴的時間，因此需要建立敏感快速的診斷方法。然而，以前常用的實驗室檢測方法存在要求高、耗時長、操作復(fù)雜、檢測效率低等缺陷，不適合基層疾控單位和現(xiàn)場，因此，亟需建立一種可現(xiàn)場進行的簡便檢測方法。

RPA是一種恒溫核酸擴增技術(shù)，它依賴于特定的酶和蛋白組合(重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶)，在常溫下即可發(fā)生反應(yīng)，5～20 min即可獲得結(jié)果，可簡單快速地進行病原基因的擴增，這使得在低資源流行環(huán)境下進行即時診斷成為可能。現(xiàn)在已有RPA應(yīng)用于多種傳染性疾病檢測的報道，然而，尚無RPA應(yīng)用于鼠疫耶爾森菌檢測的報道。

為建立鼠疫耶爾森菌的熒光RPA檢測方法，首先對鼠疫耶爾森菌的基因序列進行了BLAST分析，找到特異性的DNA腺嘌呤甲基化酶基因序列。隨后進行了擴增溫度的優(yōu)化，獲得了最佳的擴增溫度。在此溫度下進行了靈敏性、特異性和模擬樣品的檢測試驗，表明所建立的熒光RPA方法可檢出低至100個拷貝的基因，且在模擬樣本中檢出率高，與常見細菌核酸不發(fā)生交叉反應(yīng)，快速準確。雖然本實驗是建立在模擬樣本的基礎(chǔ)上進行的驗證，但由于其便捷性以及高特異性和靈敏性，在鼠疫菌快速檢測方面展現(xiàn)出了很好的應(yīng)用前景，為現(xiàn)場檢測提供新思路。