雞卵泡膜細(xì)胞中膜聯(lián)蛋白A2互作細(xì)胞蛋白的篩選及其功能分析

高洪波 王燕碧 張福平 趙采芹 唐宏 周磊 韓一帆 段志強(qiáng)

摘要：【目的】從雞卵泡膜細(xì)胞蛋白中篩選和鑒定與膜聯(lián)蛋白A2（ANXA2）相互作用的細(xì)胞蛋白并進(jìn)行功能分析，為深入研究ANXA2調(diào)控雞卵泡發(fā)育的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。【方法】制備開產(chǎn)后30周齡貴州黃雞的卵泡膜細(xì)胞，提取卵泡膜總蛋白后利用His Pull-Down聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)（LC-MS/MS）從卵泡膜細(xì)胞中篩選出與雞ANXA2互作的細(xì)胞蛋白，然后通過GO數(shù)據(jù)庫和KEEG數(shù)據(jù)庫分別進(jìn)行GO功能富集分析及KEEG信號通路注釋分析，并利用STRING Version 11.0繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。【結(jié)果】通過His Pull-Down聯(lián)合LC-MS/MS共鑒定獲得41個雞ANXA2互作細(xì)胞蛋白，GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)這些互作細(xì)胞蛋白在分子功能、生物學(xué)進(jìn)程和細(xì)胞組成均發(fā)揮作用。其中，在分子功能方面主要涉及蛋白結(jié)合（占58.06%）、催化活性（占19.35%）、核糖體結(jié)構(gòu)（占16.13%）及細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)組成（占6.45%），在生物學(xué)進(jìn)程方面主要參與細(xì)胞骨架（占19.35%）、刺激反應(yīng)（占19.35%）、翻譯（占16.13%）、代謝過程（占12.90%）、細(xì)胞遷移（占12.90%）、蛋白折疊（占9.68%）和蛋白運(yùn)輸（占9.68%），而細(xì)胞組分顯示以定位于細(xì)胞膜的蛋白為主（占32.26%）。雞ANXA2蛋白互作細(xì)胞蛋白參與的KEEG信號通路主要有應(yīng)激反應(yīng)、代謝、翻譯、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫系統(tǒng)和蛋白定位等。雞ANXA2互作細(xì)胞蛋白互作網(wǎng)絡(luò)可分為3條，即CNN2-FN1-MYH9-MYH10-ACTN1-CSRP1、ANXA1-ANXA2-ENO1-PRDX4-GPI-ATP5B-PRDX3-HSPA8-TUBB2A和CCT7-CCT4-GNB2L1-ATP5A1-RPS3-RPS3A-RPL23A-RPL22-RPS7;互作細(xì)胞蛋白間存在復(fù)雜的互作關(guān)系，其中又以膜聯(lián)蛋白A1（ANXA1）與烯醇化酶-1（ENO1）及ANXA2的互作關(guān)系最明顯?！窘Y(jié)論】雞ANXA2互作細(xì)胞蛋白主要參與細(xì)胞骨架形成、應(yīng)對刺激和翻譯等生物學(xué)過程，涉及應(yīng)激反應(yīng)、代謝、翻譯、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫及蛋白定位等信號通路。其中，PRDX3、PRDX4、MYH9和TCSC可能通過與ANXA2蛋白相互作用而參與雞卵巢相關(guān)疾病的發(fā)生，而ANXA1與ANXA2相互作用可能在雞卵泡的發(fā)育及排卵過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。

關(guān)鍵詞： 雞;卵泡膜細(xì)胞;膜聯(lián)蛋白A2（ANXA2）;互作細(xì)胞蛋白;卵泡發(fā)育

中圖分類號： S831.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2022）01-0210-09

Screening and functional analysis of cellular proteins

interacting with annexin A2 in chicken theca cells

GAO Hong-bo， WANG Yan-bi， ZHANG Fu-ping， ZHAO Cai-qin，

TANG Hong， ZHOU Lei， HAN Yi-fan， DUAN Zhi-qiang*

（College of Animal Sciences，Guizhou University/Key Laboratory of Animal Genetics，Breeding and Reproduction

in the Plateau Mountains Region， Ministry of Education/Key Laboratory of Animal Genetics，

Breeding and Reproduction in Guizhou， Guiyang? 550025， China）

Abstract：【Objective】The aim of this study was to screen， identify and analyze the functions of cellular proteins interacting with annexin A2 （ANXA2） in chicken theca cells， which provided theoretical basis for further studying the mechanism of ANXA2 regulating chicken follicular development. 【Method】The chicken theca cells of 30-week-old Guizhou yellow laying hens were prepared and then used to extract the total proteins. The chicken ANXA2 recombinant protein His-ANXA2 and His tag protein were used as bait proteins， respectively， to screen the cellular proteins interacting with His-ANXA2 and His by His Pull-Down combined with mass-spectrometric technique （LC-MS/MS） method. The GO function annotation， KEGG signaling pathway and protein-protein interaction network analysis of the identified proteins was performed using the bioinformatics online software. Protein interaction networks were drawn using STRING Version 11.0. 【Result】A total of 41 cellular proteins that interacted with chicken ANXA2 were identified by His Pull-Down combined with LC-MS/MS. GO annotation analysis showed that these interacting cellular proteins played roles in molecular function， biological processes， and cell composition. As for the molecular function analysis， these proteins were involved in protein binding （58.06%）， catalytic activity （19.35%）， structural consituent of ribosome （16.13%）， and structural constitute of cytoskeleton （6.45%）. The results of biological processes analysis revealed that these proteins mainly participated in cytoskeleton organization （19.35%）， to stimulus response （19.35%）， translation （16.13%）， metabolic process（12.90%）， cell migration （12.90%）， protein folding （9.68%）， and protein transport （9.68%）. However， the distribution of cell membrane （32.26%） was the main localization pattern in cell composition analysis. Meanwhile， KEGG signaling pathway analysis showed that these proteins were related to stress response， metabolism， translation， signal transduction， immune system， and protein localization. The protein-protein interaction networks were divided into three ways， including CNN2-FN1-MYH9-MYH10-ACTN1-CSRP1，ANXA1-ANXA2-ENO1-PRDX4-GPI-ATP5B-PRDX3-HSPA8-TUBB2A，CCT7-CCT4-GNB2L1-ATP5A1-RPS3-RPS3A-RPL23A-RPL22-RPS7， which showed the complex interactions among them. Of which annexin A1 （ANXA1） and enolase -1 （ENO1） had the most obvious interactions with ANXA2. 【Conclusion】The identified cellular proteins interacting with chicken ANXA2 are mainly involved in the biological processes of cytoskeleton formation， response to stimulationand translation， and the signaling pathways of stress response， metabolism， translation， signal transduction， immunity and protein localization. PRDX3， PRDX4， MYH9， and TCSC possibly participate in the occurrence of chicken ovaries related diseases by interacting with ANXA2， while ANXA1 interacting with ANXA2 might regulate the follicular development and ovulation in chickens.

Key words： chicken; theca cells; annexin A2（ANXA2）; interacting cellular protein; follicular development

Foundation items： National Natural Science Foundation of China （31960698，31760732，31502074）;Joint Project of Local Poultry Industry in Guizhou （Qiancainong〔2020〕175）

0 引言

【研究意義】膜聯(lián)蛋白（Annexin，ANX）是一類由鈣離子調(diào)控且具有磷脂結(jié)合特性的細(xì)胞膜關(guān)聯(lián)蛋白，在不同生物體內(nèi)高度保守，主要參與細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)及膜表面一系列依賴于鈣離子的膜性生物學(xué)活動（He et al.，2020）。由于每個ANX成員均具備高度可變的氨基末端結(jié)構(gòu)域，因此具有獨(dú)特的生物學(xué)功能。膜聯(lián)蛋白A2（ANXA2）是ANX家族成員之一，其N-末端結(jié)構(gòu)域由纖溶酶原、P11蛋白（S100A10）和纖溶酶原激活物（t-PA）結(jié)合位點(diǎn)所組成（Flood and Hajjar，2011）。在卵巢中，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）重塑、卵泡破裂及排卵均由纖溶酶調(diào)節(jié)（MacDonald et al.，2019），其中t-PA在雞卵巢卵泡的發(fā)育和排卵過程中已得到廣泛研究（Wang et al.，1993）。據(jù)報(bào)道，在卵泡中ANXA2依賴的纖溶酶原激活物可調(diào)節(jié)纖溶酶的產(chǎn)生（Su et al.，2018），且ANXA2在多種卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)異常升高（Cardoso et al.，2019）。因此，加強(qiáng)ANXA2研究對揭示卵泡成熟及卵巢癌發(fā)生機(jī)制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】ANXA2具有保守的N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域，N端序列包括磷酸化位點(diǎn)、乙?；稽c(diǎn)及F-acting結(jié)合位點(diǎn)，可調(diào)整ANXA2在細(xì)胞中的定位，進(jìn)而調(diào)控ANXA2基因發(fā)揮不同功能（Chen et al.，2020）;C端區(qū)域包含F(xiàn)-肌動蛋白、肝素和纖溶酶原結(jié)合位點(diǎn)，介導(dǎo)ANXA2與其他蛋白相互作用，且在細(xì)胞生命活動及病毒增殖過程中發(fā)揮作用（Grindheim et al.，2017）。早期針對ANXA2的研究主要集中在ANXA2與人類疾病的關(guān)聯(lián)性，已證實(shí)ANXA2的表達(dá)、特性或定位改變可引起心血管疾病、神經(jīng)內(nèi)分泌疾病及腫瘤等發(fā)生（Ca?as et al.，2015）。近年來，越來越多的研究表明ANXA2與病毒的復(fù)制和感染存在密切聯(lián)系。如ANXA2可作為人免疫缺陷病毒I型（Human immunodeficiency virus 1，HIV-1）感染的輔助因子，協(xié)助HIV-1進(jìn)入巨噬細(xì)胞（Woodham et al.，2014）;人類乳頭狀瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）感染細(xì)胞后以鈣離子依賴的方式與異源四聚體A2t中的ANXA2相互作用，參與細(xì)胞內(nèi)囊泡和細(xì)胞外的相互作用，在病毒內(nèi)化過程中發(fā)揮重要作用（Taylor et al.，2018）。有關(guān)ANXA2與動物病毒感染方面，Chen等（2015）研究證實(shí)ANXA2與牛流行病病毒（Bovine ephemeral fever virus，BEFV）M蛋白存在相互作用，且這種相互作用有助于促進(jìn)BEFV病毒的組裝與釋放;Koga等（2018）研究表明ANXA2與麻疹病毒（Measles virus，MeV）M蛋白相互作用而影響MeV顆粒的細(xì)胞外釋放。因此，ANXA2可作為病毒感染細(xì)胞的受體，或通過與病毒蛋白相互作用而促進(jìn)病毒的復(fù)制。此外，ANXA2在動物生殖方面的作用也逐漸引起人們關(guān)注。ANXA2對動物精子的頂體反應(yīng)、獲能及卵母細(xì)胞的成熟、受精及卵裂等生理過程均有重要影響（Woodham et al.，2014;Zhu et al.，2015;Ma et al.，2017）。Cui等（2005）研究發(fā)現(xiàn)，豬和大鼠的ANXA2基因均隨卵母細(xì)胞的成熟及早期胚胎的發(fā)育呈現(xiàn)高表達(dá)，尤其是在減數(shù)分裂的分發(fā)泡期;陳欣（2015）研究表明，隨著卵巢和卵泡的發(fā)育成熟，ANXA2 基因在發(fā)育卵泡中的表達(dá)顯著增加，且以F1代卵泡中的表達(dá)量最高;Zhu等（2015）研究證實(shí)，ANXA2基因在產(chǎn)蛋高的雞卵巢中呈上調(diào)表達(dá)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】卵泡膜細(xì)胞是卵泡的重要組成部分，為卵泡發(fā)育提供必要的性激素，參與形成血管系統(tǒng)并為卵泡發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)，還介導(dǎo)卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞間的相互作用，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞凋亡及卵泡發(fā)育過程（孟金柱等，2020），但至今鮮見針對雞卵泡膜細(xì)胞ANXA2及其互作細(xì)胞蛋白的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于ANXA2可能在雞卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，通過制備雞卵泡膜細(xì)胞，利用His Pull-Down聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)從雞卵泡膜細(xì)胞蛋白中篩選出與ANXA2相互作用的細(xì)胞蛋白并進(jìn)行功能分析，以期為深入研究ANXA2調(diào)控雞卵泡發(fā)育的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

產(chǎn)蛋期的貴州黃雞由貴州大學(xué)種雞場提供，用于制備雞卵泡膜細(xì)胞。His-ANXA2重組蛋白由高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備并保存提供（高洪波等，2020）。His Pur Ni-NTA Magnetic Beads購自ThermoFisher公司;胎牛血清購自Gibco公司;PBS、青霉素、鏈霉素、RIPA裂解液（弱）、PMSF及EDTA-3Na購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 雞卵泡膜細(xì)胞制備 在無菌條件下取開產(chǎn)后30周齡貴州黃雞的整個卵巢，分離出多個直徑大于7 mm的卵泡，以PBS漂洗2次后，剝凈血管及結(jié)締組織，將卵泡膜剪碎，置于30 mL離心管中并加入10 mL的0.1%Ⅱ膠原酶與無血清M199培養(yǎng)基，37 ℃恒溫水浴鍋中消化45 min，采用高壓滅菌的200目不銹鋼細(xì)胞過濾篩過濾，收集濾液，向?yàn)V液中加入等體積的完全培養(yǎng)基終止消化，1500 r/min離心5 min，棄上清液，加入適量培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)卵泡細(xì)胞中顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞的貼壁時(shí)間差異在第1次培養(yǎng)12 h后更換培養(yǎng)基，之后每24 h更換1次培養(yǎng)基。

1. 2. 2 雞卵泡膜細(xì)胞蛋白提取 培養(yǎng)卵泡膜細(xì)胞，棄上清液，加入預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次，將細(xì)胞瓶水平置于冰上，加入適量預(yù)冷的RIPA裂解液（弱）及PMSF，冰浴15～20 min，使用細(xì)胞刮刀將卵泡膜細(xì)胞從細(xì)胞瓶上刮下，冰浴10 min，轉(zhuǎn)移懸液至離心管中，4 ℃下12000 r/min離心15 min，上清液即為膜蛋白，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 3 His Pull-Down篩選互作蛋白 向制備好的雞卵泡膜細(xì)胞蛋白中加入50 μL His Pur Ni-NTA Magnetic Beads純化重組蛋白His-ANXA2和少量PMSF，對照組加入50 μL His Pur Ni-NTA Magnetic Beads純化的His標(biāo)簽蛋白，試驗(yàn)組和對照組各設(shè)3個重復(fù)，在4 ℃搖床振蕩4 h，將充分反應(yīng)的樣品在4 ℃下12000 r/min瞬時(shí)離心，棄上清液，以預(yù)冷PBS吹打混勻，4 ℃下12000 r/min瞬時(shí)離心，棄上清液，重復(fù)3次，加入30 μL Elution Buffer洗脫，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 4 SDS-PAGE電泳及銀染鑒定 取10 μL His Pull-Down樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將凝膠轉(zhuǎn)入固定液中固定12 h;乙醇洗滌20 min;蒸餾水清洗2次，每次20 min;AgNO3溶液反應(yīng)2 min;蒸餾水清洗2次，每次不超過5 min;1% AgNO3溶液反應(yīng)10 min;蒸餾水清洗1 min;1%對苯二酚溶液顯色2 min;EDTA-3Na溶液反應(yīng)10 min;蒸餾水清洗3 min，銀染后拍照，用于判斷樣品的完整性。

1. 2. 5 質(zhì)譜分析 取20 μL His Pull-Down樣品，加入二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAM）和胰蛋白酶，過夜酶解產(chǎn)生的多肽以C18柱進(jìn)行除鹽處理，抽干后用Loading Buffer溶解多肽，多肽上LC-MS/MS儀器進(jìn)行質(zhì)譜分析。搜索參數(shù)設(shè)置如下：（1）樣本類型：識別鑒定;（2）消化：胰蛋白酶;（3）Cys烷基化：IAM;（4）儀器：Triple-TOF5600;（5）數(shù)據(jù)庫：Uniprot。

1. 2. 6 生物信息學(xué)分析 通過GO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ebi.ac.uk/QuickGO/）和KEEG數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）分別對篩選獲得的ANXA2互作細(xì)胞蛋白進(jìn)行GO功能富集分析及KEEG信號通路注釋分析（Kanehisa et al.，2019），并通過STRING Version 11.0（https：//string-db.org/）繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 雞卵泡膜細(xì)胞分離培養(yǎng)結(jié)果

于顯微鏡下觀察雞卵泡膜細(xì)胞不同階段的生長特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，剛分離時(shí)雞卵泡膜細(xì)胞呈大小不一的圓形（圖1-A）;培養(yǎng)24 h后卵泡膜細(xì)胞基本貼壁且部分細(xì)胞有偽足伸出（圖1-B）;培養(yǎng)48 h后卵泡膜細(xì)胞生長占細(xì)胞瓶的面積80%，其形態(tài)呈長梭形（圖1-C）;卵泡膜細(xì)胞生長迅速，培養(yǎng)3 d后基本長滿細(xì)胞瓶，呈緊密排列狀態(tài)（圖1-D）。

2. 2 SDS-PAGE電泳及銀染結(jié)果

經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將PAGE膠進(jìn)行銀染分析。如圖2所示，第1條泳道（重組蛋白His-ANXA2與雞卵泡膜細(xì)胞蛋白互作）和第2條泳道（His標(biāo)簽蛋白與雞卵泡膜細(xì)胞蛋白互作）均明顯可見多條蛋白條帶，且存在蛋白條帶差異，表明雞卵泡膜細(xì)胞蛋白中存在與重組蛋白His-ANXA2和His標(biāo)簽蛋白互作的細(xì)胞蛋白，可進(jìn)行后續(xù)的質(zhì)譜鑒定分析。

2. 3 質(zhì)譜鑒定分析結(jié)果

His Pull-Down樣品質(zhì)譜分析獲得的二級譜圖數(shù)分別為19345和18780張，解析的二級譜圖數(shù)分別為575和1676張，鑒定得到的肽段和蛋白總數(shù)如表1所示。共鑒定獲得細(xì)胞蛋白總數(shù)為 87個，其中，與重組蛋白His-ANXA2互作的細(xì)胞蛋白有73個，與His標(biāo)簽蛋白互作的細(xì)胞蛋白有46個，與重組蛋白His-ANXA2和His標(biāo)簽蛋白均互作的蛋白有32個（圖3）。去除His-ANXA2和His共同互作的細(xì)胞蛋白，與雞ANXA2蛋白互作的細(xì)胞蛋白有41個（表2）。

2. 4 雞ANXA2互作細(xì)胞蛋白GO功能富集分析結(jié)果

對篩選出的41個雞ANXA2互作細(xì)胞蛋白進(jìn)行GO功能富集分析，得知這些細(xì)胞蛋白在分子功能（Molecular function）、生物學(xué)進(jìn)程（Biological process）和細(xì)胞組成（Celluar component）均發(fā)揮作用。其中，41個細(xì)胞蛋白中有8個為未鑒定蛋白，2個是重復(fù)蛋白。與雞ANXA2蛋白互作的細(xì)胞蛋白主要涉及蛋白結(jié)合（Binding，58.06%）、催化活性（Catalytic activity，19.35%）、核糖體結(jié)構(gòu)（Structural constituent of ribosome，16.13%）及細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)組成（Structu-ral constituent of cytoskeleton，6.45%）等分子功能（圖4-A）;從生物學(xué)進(jìn)程（圖4-B）角度來看，主要參與細(xì)胞骨架（Cytoskeleton orgarization，19.35%）、刺激反應(yīng)（Response to stimulus，19.35%）、翻譯（Translation，16.13%）、代謝過程（Metabolic process，12.90%）、細(xì)胞遷移（Metabolic process，12.90%）、蛋白折疊（Protein folding，9.68%）和蛋白運(yùn)輸（Protein transport，9.68%）;而細(xì)胞組分（圖4-C）顯示以定位于細(xì)胞膜（Plasma membrane）的蛋白為主，占32.26%。

2. 5 雞ANXA2互作細(xì)胞蛋白KEGG信號通路注釋分析結(jié)果

通過KEGG數(shù)據(jù)庫對篩選出的41個雞ANXA2互作細(xì)胞蛋白進(jìn)行信號通路注釋分析，結(jié)果（圖5）顯示，雞ANXA2互作細(xì)胞蛋白參與的信號通路主要有應(yīng)激反應(yīng)（Responses to stress）、代謝（Metabolism）、翻譯（Translation）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（Signal transduction）、免疫系統(tǒng)（Immune system）和蛋白定位（Protein localization）等。

2. 6 雞ANXA2互作細(xì)胞蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

通過STRING Version 11.0繪制雞ANXA2互作細(xì)胞蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果（圖6）顯示，雞ANXA2互作細(xì)胞蛋白互作網(wǎng)絡(luò)可分為3條，包括CNN2-FN1-MYH9-MYH10-ACTN1-CSRP1、ANXA1-ANXA2-ENO1-PRDX4-GPI-ATP5B-PRDX3-HSPA8-TUBB-2A和CCT7-CCT4-GNB2L1-ATP5A1-RPS3-RPS3A-RPL23A-RPL22-RPS7。根據(jù)不同方式聚類分析發(fā)現(xiàn)，生物學(xué)進(jìn)程主要參與生物運(yùn)輸、翻譯、ATP合成及有機(jī)物分解等，細(xì)胞組成主要由細(xì)胞骨架、囊泡、質(zhì)膜、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核糖體及細(xì)胞器膜等構(gòu)成，分子功能主要涉及酶活性、蛋白結(jié)合、RNA結(jié)合、微管結(jié)合及陰離子結(jié)合等。在以上互作細(xì)胞蛋白中，膜聯(lián)蛋白A1（ANXA1）與烯醇化酶-1（ENO1）及ANXA2相互作用的相關(guān)系數(shù)最大。

3 討論

ANX通過與其他細(xì)胞蛋白相互作用形成復(fù)雜的蛋白復(fù)合物而參與多種生物學(xué)過程，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡/增殖、細(xì)胞骨架重組及腫瘤發(fā)生等（Rescher et al.，2020）。ANXA2存在于上皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、生殖細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中，其異常表達(dá)參與各種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展（Ca?as et al.，2015）。已有研究表明，在卵巢癌細(xì)胞中，ANXA2功能喪失，β-catenin表達(dá)受抑制，從而抑制上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并減弱癌細(xì)胞的增殖和侵襲（Liu et al.，2017）;ANXA2在卵巢惡性及交界性腫瘤中呈下調(diào)表達(dá)或缺失，表達(dá)水平與卵巢癌手術(shù)病理分期有關(guān)，即ANXA2與卵巢癌發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（Cardoso et al.，2019）。此外，在培養(yǎng)的雞膜細(xì)胞中過表達(dá)ANXA2可誘導(dǎo)血管生成因子VEGFA及其受體在卵泡膜細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)，表明ANXA2參與卵泡血管生成，且有助于卵泡發(fā)育和排卵（陳欣，2015）。隨著雞卵巢和卵泡的發(fā)育成熟，ANXA2基因呈顯著上調(diào)表達(dá)，排卵后其表達(dá)呈顯著下調(diào)趨勢（朱桂玉，2014），故推測ANXA2在促進(jìn)卵泡血管發(fā)育、激發(fā)卵母細(xì)胞成熟及卵母細(xì)胞增殖等過程中發(fā)揮重要作用。

為進(jìn)一步了解雞ANXA2在調(diào)控卵泡發(fā)育中的作用機(jī)制，本研究分別以雞ANXA2重組蛋白His-ANXA2和His標(biāo)簽蛋白為誘餌蛋白，利用His Pull-Down聯(lián)合LC/MS-MS的方法共篩選獲得41個雞ANXA2互作細(xì)胞蛋白。經(jīng)GO功能富集分析及KEGG信號通路注釋分析，發(fā)現(xiàn)在篩選獲得的41個雞ANXA2互作細(xì)胞蛋白中，參與細(xì)胞骨架的蛋白有ANXA1、CNN2和TUBA1A，參與胞內(nèi)物質(zhì)代謝的蛋白有ATP5A1、ABSB、GPI、RPS3和ALYREF，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白有MYH10、CTSC、RPS7和GNB2L1，與卵巢癌相關(guān)的蛋白有PRDX3、PRDX4、MYH9和TCSC。Ahn等（2010）研究證實(shí)，CTSC基因在雞卵巢癌細(xì)胞中呈上調(diào)表達(dá)，表明CTSC在雞卵巢癌的發(fā)生過程中具有潛在的重要作用;Duan等（2013）研究表明，PRDX3基因沉默觸發(fā)了順鉑介導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞凋亡，可能是通過NF-κB信號通路發(fā)揮調(diào)控作用;Liu等（2019）在多變量模型中發(fā)現(xiàn)，MYH9基因過表達(dá)是上皮性卵巢癌發(fā)生率低的獨(dú)立預(yù)測因子，是上皮性卵巢癌的候選基因之一;Liang等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，PRDX4通過氧化損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑促進(jìn)Prdx4-/-小鼠卵巢衰老，提示PRDX4是一種保護(hù)劑。由此推測PRDX3、PRDX4、MYH9和TCSC與ANXA2蛋白相互作用而參與雞卵巢相關(guān)疾病的發(fā)生。

蛋白與蛋白間的互作網(wǎng)絡(luò)是構(gòu)成細(xì)胞生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，對調(diào)控細(xì)胞及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有重要意義。STRING預(yù)測結(jié)果顯示，ANXA1與ENO1及ANXA2的互作關(guān)系最明顯。ANXA1也是ANX家族中的一員，作為一種鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞增殖/凋亡及腫瘤的發(fā)生發(fā)展（Xiao et al.，2017;Xia et al.，2020）。Manai等（2020）研究報(bào)道，ANXA1過表達(dá)是上皮性卵巢癌總生存期延長的獨(dú)立預(yù)測因子，故推測ANXA1是卵巢癌的早期診斷因子及潛在治療靶點(diǎn)。ANXA2基因在卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲及EMT生物學(xué)行為中發(fā)揮正向作用（劉琰，2017）。鑒于ANXA1和ANXA2與卵巢癌發(fā)生的密切關(guān)系，故推測ANXA1與ANXA2相互作用在雞卵泡的發(fā)育和排卵過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。計(jì)紅等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，干擾ENO1基因表達(dá)可使仔鵝卵泡顆粒細(xì)胞周期發(fā)生G2/M期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。Notch信號通路是一種高度進(jìn)化保守的信號通路，在調(diào)控細(xì)胞通信和細(xì)胞周期方面發(fā)揮重要作用（Zhang et al.，2019）。最近的研究表明，C1EIP通過Notch信號通路與ENO1相互作用以調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞分化的相關(guān)基因（Jin et al.，2020）。此外，F(xiàn)GC代謝物可通過阻斷ENO1調(diào)節(jié)而為成纖維細(xì)胞的生長和發(fā)育創(chuàng)造適宜的微環(huán)境（Ji et al.，2020），即ENO1是改善卵泡質(zhì)量的潛在靶分子。

4 結(jié)論

雞ANXA2互作細(xì)胞蛋白主要參與細(xì)胞骨架形成、應(yīng)對刺激和翻譯等生物學(xué)過程，涉及應(yīng)激反應(yīng)、代謝、翻譯、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫及蛋白定位等信號通路。其中，PRDX3、PRDX4、MYH9和TCSC可能通過與ANXA2蛋白相互作用而參與雞卵巢相關(guān)疾病的發(fā)生，而ANXA1與ANXA2相互作用可能在雞卵泡的發(fā)育及排卵過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）