長江中下游區(qū)試水稻品種稻瘟病抗性評價及抗性基因檢測

陳晴晴 楊雪 張愛芳

摘要：【目的】探究長江中下游區(qū)試水稻品種稻瘟病抗性水平及抗性基因聚合對稻瘟病抗性的效應(yīng)，為新品種的審定及抗病品種的合理利用提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎捎萌斯婌F接種方法鑒定2018—2020年長江中下游區(qū)試252個水稻品種的稻瘟病抗性，并利用2組多重PCR體系（Pi1與Pikh、Pi9與Pik）檢測供試水稻品種攜帶抗性基因Pi9、Pik、Pi1和Pikh的情況，分析抗性基因聚合方式與稻瘟病抗病率的關(guān)系。【結(jié)果】2018—2020年供試材料的穗瘟抗病率分別為47.0%、38.3%和35.2%，穗瘟抗病率逐年下降。252份供試材料含有抗性基因數(shù)為0～4個，其中含0個抗性基因的材料有14份，占5.6%，穗瘟抗病率為14.3%;含1個抗性基因的材料有63份，占25.0%，穗瘟抗病率為11.1%;含2個抗性基因的材料有81份，占32.1%，穗瘟抗病率為42.0%;含3個抗性基因的材料有81份，占32.1%，穗瘟抗病率為65.4%;含4個抗性基因的材料有13份，占5.2%，穗瘟抗病率為53.8%?？傮w來看，供試材料的穗瘟抗病率隨攜帶的抗性基因數(shù)增加呈上升趨勢。抗性基因組合Pi9+Pikh、Pi9+Pik+Pikh和Pi9+Pik+Pi1+Pikh是適合安徽地區(qū)的抗性基因組合?！窘Y(jié)論】2018—2020年長江中下游區(qū)試水稻品種稻瘟病抗性一般。多基因聚合能提高水稻品種的稻瘟病抗性，但應(yīng)選擇合適的抗性基因組合，不能簡單疊加。

關(guān)鍵詞： 水稻;稻瘟病;基因檢測;抗性鑒定;長江中下游

中圖分類號： S435.111.41? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2022）01-0021-08

Evaluation of rice blast resistance and detection of resistance genes of rice varieties in regional trials in the middle and lower reaches of Yangtze River

CHEN Qing-qing， YANG Xue， ZHANG Ai-fang*

（Institute of Plant Protection and Agricultural Products Quality and Safety， Anhui Academy of

Agricultural Sciences， Hefei? 230001， China）

Abstract：【Objective】To explore the blast resistance level of rice varieties tested in the middle and lower reaches of the Yangtze River and the effect of resistance gene aggregation on the resistance of rice blast and provide a theoretical basis for the approval of new varieties and the rational use of disease-resistant varieties. 【Method】The artificial spray inoculation method was used to identify the rice blast resistance of the 252 varieties in regional trials in the middle and lower reaches of the Yangtze River from 2018 to 2020. Two sets of multiplex PCR systems （Pi1 and Pikh， Pi9 and Pik） were used to detect the resistance genes Pi9， Pik， Pi1 and Pikh in the tested rice varieties. The relationship between the aggregation mode of resistance genes and the resistance rate of rice blast was analyzed. 【Result】The spike blast resistance rates of the tested materials from 2018 to 2020 were 47.0%， 38.3% and 35.2%， respectively， which decreased year by year. 252 tested materials contained 0 to 4 tested resistance genes. There were 14 materials containing no tested resistance genes， accounting for 5.6%， and the spike blast resistance rate was 14.3%; 63 materials contained 1 resistance gene， accounting for 25.0%， and the spike blast resistance rate was 11.1%; 81 materials contained 2 resistance genes， accounting for 32.1%， and the spike blast resistance rate was 42.0%; 81 materials contained 3 resistance genes， accounting for 32.1%， and the spike blast resistance rate was 65.4%; 13 materials contained 4 resistance genes， accounting for 5.2%， and the spike blast resistance rate was 53.8%. In general， the spike blast resistance rate of the tested materials increased with the number of resistance genes， showing an upward trend. The rice blast resistance gene combinations Pi9+Pikh， Pi9+Pik+Pikh and Pi9+Pik+Pi1+Pikh were suitable resistance gene combinations in Anhui. 【Conclusion】The resistance to blast disease of rice varieties tested in the middle and lower reaches of the Yangtze River from 2018 to 2020 is average. Multi-gene aggregation can improve rice blast resistance， but the appropriate combination of resistance genes should be selected instead of simply superposition.06FB152F-66F4-4942-81C5-601FA2AEF053

Key words： rice; rice blast; gene detection; resistance identification; middle and lower reaches of Yangtze River

Foundation items： National Agricultural Financial Funding Project （2018-2020）

0 引言

【研究意義】水稻（Oryza sativa L.）種植區(qū)域分布于除南極洲外的世界大部分地方，全世界有一半的人口以稻米為主要糧食（楊德衛(wèi)等，2019）。水稻是我國主要糧食作物之一，超過半數(shù)的人口以大米為主食，種植面積和產(chǎn)量均居世界前列。長江中下游地區(qū)是我國重要的水稻生產(chǎn)區(qū)，水稻的穩(wěn)定、安全生產(chǎn)對保障國家糧食安全具有重要意義（李建等，2020）。稻瘟病是由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的對水稻危害最大的世界性真菌病害之一（Tan et al.，2021），其廣泛發(fā)生于我國不同水稻種植區(qū)，并且在水稻不同生長時期均可發(fā)生，嚴重影響稻米的產(chǎn)量和品質(zhì)（劉世江等，2020）。目前，培育和利用抗病品種仍是最經(jīng)濟、有效控制稻瘟病的方法（韓雪琴等，2021）。然而，由于稻瘟病菌經(jīng)抗病品種選擇后會發(fā)生變異，含有單一或少數(shù)抗稻瘟病基因的推廣品種在幾年種植后抗性會逐漸喪失（朱業(yè)寶等，2020），尤其在氣候不利的年份，病害容易暴發(fā)，導致嚴重減產(chǎn)。因此，鑒定長江中下游區(qū)試水稻品種的稻瘟病抗性，并分析抗性基因聚合對抗性水平的效應(yīng)，對篩選和利用新的抗病品種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，國內(nèi)外研究者已鑒定了183個水稻稻瘟病抗性相關(guān)基因（QTL），并克隆了37個抗性基因（國家水稻數(shù)據(jù)中心，2012）。隨著越來越多的抗稻瘟病基因被克隆，基于抗病基因功能序列開發(fā)的分子標記，促使人們能夠快速、準確地鑒定各種水稻種質(zhì)資源抗病基因的分布，進而指導水稻抗病分子育種（陳子強等，2016）。大量研究發(fā)現(xiàn)，利用多個抗性基因是培育廣譜、持久抗性品種的有效手段。謝倩鳳等（2015）在82份水稻種質(zhì)資源中發(fā)現(xiàn)寬抗譜和中等抗譜的材料分別有11份（13.4%）和55份（67.1%），以攜帶Pia基因的材料最多（78.0%）。潘爭艷等（2019）發(fā)現(xiàn)抗性基因Pi40、Pi9、Pigm和Pita在遼寧省粳稻品種選育和生產(chǎn)上具有重要的應(yīng)用潛力。張海珊等（2020）通過抗稻瘟病單基因系水稻品種與稻瘟病菌的互作研究，發(fā)現(xiàn)在安徽地區(qū)抗稻瘟病基因Pi9和Pik對水稻品種抗病性貢獻較大。張銀霞等（2020）針對寧夏地區(qū)水稻種質(zhì)資源的研究發(fā)現(xiàn)，其主要的抗稻瘟病基因有Pikm、Pi9、Pi2、Pi5和Pid2。王曉玲等（2021）對82份秈粳骨干親本抗稻瘟病基因進行分子檢測，明確了這些材料抗瘟基因的分布，為廣譜持久抗性秈粳材料創(chuàng)制骨干親本的選擇與配組指明了方向。在目前已克隆的抗性基因中，Pi9、Pik、Pi1和Pikh具有廣譜抗性，其中Pik基因?qū)ξ覈S多稻瘟病菌小種有較強的、穩(wěn)定的抗性（Zhai et al.，2011）;Pi1基因來自西非水稻品種LAC23，對來自我國8個稻區(qū)的稻瘟病菌株表現(xiàn)抗病，對華南稻區(qū)的稻瘟病菌株表現(xiàn)顯著抗性（李進斌等，2012）;Pikh基因是從越南水稻品種Tetep中鑒定獲得，對來自印度的稻瘟病菌株表現(xiàn)高抗（Zhai et al.，2014）;Pi9基因來自野生稻，對來自13個國家或地區(qū)的43個稻瘟病菌株具有抗性，對21個稻瘟病菌小種具有抗性，是一個稻瘟病廣譜抗性基因（曹妮等，2019）?！颈狙芯壳腥朦c】目前，對于稻瘟病抗性基因Pi9、Pik、Pi1和Pikh在安徽地區(qū)的聚合效應(yīng)尚不清楚，不利于抗性基因在育種中的應(yīng)用以及抗病品種的合理布局?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用人工噴霧接種法對2018—2020年長江中下游區(qū)試252個水稻品種進行稻瘟病抗性鑒定，并利用特異引物檢測供試品種攜帶抗性基因Pi9、Pik、Pi1和Pikh的情況，分析品種稻瘟病抗性與抗性基因聚合的關(guān)系，為新品種的審定及抗病品種的合理利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

以中國水稻研究所提供的長江中下游區(qū)試水稻品種為研究材料，2018—2020年分別有100、81和71份，共計252份。對照品種單18（含Pi9）、特特普（含Pi1和Pikh）、關(guān)東51（含Pik）（陸展華等，2020b）和麗江新團黑谷（感病對照品種）均由本課題組提供。供試稻瘟病菌由安徽省優(yōu)勢種群（ZB群）和強致病種群（ZA群）的不同菌株組成，由本課題組分離鑒定并保存。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 稻瘟病菌接種鑒定 供試菌株在馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）上26 ℃恒溫培養(yǎng);1周后轉(zhuǎn)移至大麥粒培養(yǎng)基，待大麥粒上布滿菌絲后，置于26 ℃恒溫保濕培養(yǎng);培養(yǎng)1 d后，將附著稻瘟病菌孢子的大麥粒經(jīng)無菌水清洗、過濾、離心，收集孢子液，加入0.05%吐溫，配制成2×105個孢子/mL的孢子懸浮液（陳晴晴等，2020）。

供試材料經(jīng)過浸種、催芽后，按順序分別播種在帶孔、裝有細土、穴間隔3 cm的塑料盤中，每個品種播10～15粒。澆水蓋土，保證正常出苗生長。秧苗移栽，每個品種2行，每行3穴，每穴2～4棵基本苗，株行距14 cm×20 cm，品種按順序排列。試驗品種四周種植感病品種，每20個品種設(shè)置感病對照。鑒定圃施肥量較高，治蟲不治病。在水稻孕穗期至破口期，用混合菌株孢子懸浮液噴霧接種20個穗子，接種后將水稻捆扎成束，并定時噴霧降溫保濕。在水稻黃熟初期（80%稻穗尖端谷粒成熟時）調(diào)查穗瘟，調(diào)查和評價參照NY/T 2646—2014《水稻品種試驗稻瘟病抗性鑒定與評價技術(shù)規(guī)程》進行，詳見表1。

1. 2. 2 抗性基因的分子檢測 用DNAsecure Plant Kit （TIANGEN DP320）提取水稻葉片DNA。用于PCR擴增的引物相關(guān)信息見表2，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。06FB152F-66F4-4942-81C5-601FA2AEF053

為簡化檢測過程，分別設(shè)置Pi1與Pikh（李忠楠等，2018）、Pi9與Pik雙基因的2組多重PCR體系，PCR擴增體系20.0 μL：2×Taq PCR SuperMix（北京金普頓生物科技有限公司）10.0 μL，2組10 μmol/L的上、下游引物各0.5 μL，20～100 ng/μL的基因組DNA 1.0 μL，ddH2O 7.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性3 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進行35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳分離，4S Red Plus核酸染料染色，凝膠成像系統(tǒng)下拍照。依據(jù)分子標記對應(yīng)的基因片段大小，參照Marker賦值，判斷每份材料4個抗性基因的有無。

1. 3 數(shù)據(jù)分析

為分析抗性基因聚合方式與稻瘟病抗性之間的關(guān)系，參考朱業(yè)寶等（2020）的方法，將高抗—中抗均統(tǒng)計為抗病，中感—高感均統(tǒng)計為感病。以抗病率分析數(shù)據(jù)，抗病率（%）=抗病材料數(shù)/供試材料數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2. 1 長江中下游區(qū)試水稻品種的穗瘟抗性鑒定結(jié)果

由表3可知，2018—2020年供試材料中均未鑒定出高抗材料;僅2019年鑒定出表現(xiàn)為抗的材料;2018年中抗材料占比高于2019和2020年;2018—2020年表現(xiàn)為中感材料占比逐年升高;2019年感病材料占比低于2018和2020年;2018年未鑒定到高感材料，但2019和2020年均鑒定到高感材料?？傮w來看，2018—2020年供試材料的穗瘟抗病率逐年下降，抗性水平一般。

對照品種按照穗瘟發(fā)病率分級標準評價，單18和特特普的抗感類型為中抗，關(guān)東51的抗感類型為感，麗江新團黑谷為高感。

2. 2 抗性基因的分布情況分析

利用4個抗性基因（Pi9、Pik、Pi1和Pikh）的分子標記，并運用Pi1與Pikh、Pi9與Pik的2組多重PCR體系，對252份供試材料進行檢測，對照品種和部分供試材料的PCR產(chǎn)物電泳圖見圖1。檢測到163份材料出現(xiàn)800 bp抗病的特征條帶;150份材料出現(xiàn)102 bp抗病的特征條帶;25份材料出現(xiàn)460 bp抗病的特征條帶;182份材料出現(xiàn)216 bp抗病的特征條帶，表明Pi9、Pik、Pi1和Pikh的檢出率分別為64.7%、59.5%、9.9%和72.2%，另外結(jié)合穗瘟抗性表現(xiàn)，其抗病率分別為52.1%、51.3%、44.0%和48.9%。

由圖2可知，含抗性基因Pi9、Pik、Pi1和Pikh的供試材料占比在2018—2020年發(fā)生變化，2018年分別為65.0%、61.0%、12.0%和69.0%，2019年分別為54.3%、58.0%、2.5%和75.3%，2020年分別為76.1%、59.2%、15.5%和73.2%?？梢姡L江中下游區(qū)試水稻品種中Pi9、Pik和Pikh基因頻率高于Pi1。

2. 3 抗性基因數(shù)量與抗性水平分析

252份供試材料含有抗性基因數(shù)為0～4個，含0個抗性基因的材料有14份，占5.6%，穗瘟抗病率為14.3%;含1個抗性基因的材料有63份，占25.0%，穗瘟抗病率為11.1%;含2個抗性基因的材料有81份，占32.1%，穗瘟抗病率為42.0%;含3個抗性基因的材料有81份，占32.1%，穗瘟抗病率為65.4%;含4個抗性基因的材料有13份，占5.2%，穗瘟抗病率為53.8%。由此可見，當供試材料所含抗性基因數(shù)由1個增加到3個時，其材料數(shù)、占比和穗瘟抗病率均明顯增加;而當抗性基因數(shù)增加到4個時，其材料數(shù)和占比最少，穗瘟抗病率略低于含3個抗性基因的材料。以抗性基因數(shù)與穗瘟抗病率作折線圖，供試材料從含有1個抗性基因上升到3個抗性基因時，穗瘟抗病率明顯升高（圖3）?？傮w來看，供試材料的穗瘟抗病率隨抗性基因數(shù)的增加呈上升趨勢。

2. 4 抗性基因組合與抗性水平

為進一步分析2個和3個抗性基因組合與抗性水平間的關(guān)系，將檢測到含有相同基因組合的材料歸為1個基因組合，列于表4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗病率較高且占比較高的2個抗性基因組合為Pi9+Pikh;3個抗性基因組合為Pi9+Pik+Pikh。另外，4個抗性基因組合Pi9+Pik+Pi1+Pikh的抗病率為53.8%，也是較好的抗性基因組合。

3 討論

水稻是世界上主要糧食作物之一，稻瘟病是廣泛分布在所有水稻種植區(qū)的重要病害之一（Chen et al.，2015;鄧云等，2020）。我國幾乎所有水稻栽培地區(qū)均會發(fā)生稻瘟病。由于水稻種植區(qū)之間的差異，導致不同區(qū)域稻瘟病菌生理小種繁多、優(yōu)勢小種構(gòu)成不同，且高度變異，不同年份的病原菌優(yōu)勢小種組成常發(fā)生動態(tài)變化（江川等，2019;劉艷等，2019）。因此，我國在審定水稻品種時需在不同區(qū)域開展水稻品種的稻瘟抗性鑒定。針對2018—2020年長江中下游區(qū)試水稻品種，在安徽地區(qū)進行稻瘟病抗性鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2018—2020年供試材料的抗性水平一般，穗瘟抗病率分別為47.0%、38.3%和35.2%，逐年略有下降。

抗稻瘟病基因的發(fā)掘與利用是抗病育種的基礎(chǔ)和核心（何奕霏等，2021），只有了解品種的抗性基因，才能有針對性地改良及利用品種抗性。何海燕等（2019）研究發(fā)現(xiàn)5個抗性基因在浙江省水稻品種中分布頻率不同，其中Pib基因分布最廣，但僅有15個品種的抗性頻率在70%以上，大部分品種攜帶1～2個抗性基因，聚合多個抗性基因的品種抗性水平相對較高。陸展華等（2020a）對廣東省主栽水稻品種的稻瘟病主效抗性基因及自然抗性進行鑒定，發(fā)現(xiàn)Pib和Pita的檢出率高，但抗性較弱，未檢出Pi1和Pi9，而Pi2表現(xiàn)抗性較好。Manojkumar等（2020）對印度卡納塔卡邦納姆佩特和曼迪亞地區(qū)水稻品種進行稻瘟病抗性評價，發(fā)現(xiàn)20個主要抗稻瘟病基因的個體基因頻率在10.34%～100.00%，Pi9和Pizt基因分布頻率分別較少和較多。這些研究表明不同地區(qū)水稻品種中抗性基因分布不同，分布頻率較少或較多說明抗性基因在品種中分別少量或大量存在，抗性表現(xiàn)也存在差異。本研究利用抗性基因Pi9、Pik、Pi1和Pikh的分子標記，設(shè)置2組多重PCR檢測體系，可經(jīng)濟、快速、準確地判斷供試水稻材料的抗性基因類型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長江中下游區(qū)試水稻品種中Pi9、Pik、Pi1和Pikh的基因頻率在9.9%～72.2%，抗病率在44.0%～52.1%，說明供試材料中Pi1與Pikh分別少量和大量存在，每個抗性基因表現(xiàn)出的抗性水平差異不大。06FB152F-66F4-4942-81C5-601FA2AEF053

本研究發(fā)現(xiàn)，含有單個抗性基因的供試材料抗性水平不高，隨著聚合基因數(shù)從1個增加到3個，穗瘟抗病率從11.1%上升到65.4%，供試材料的稻瘟病抗性水平呈上升趨勢，與孫立亭等（2019）、宛柏杰等（2020）的研究結(jié)果一致;但供試材料含有4個抗性基因，即抗性基因組合為Pi9+Pik+Pi1+Pikh時，穗瘟抗病率略下降到53.8%。進一步研究2個和3個抗性基因組合與抗性水平間的關(guān)系，獲得抗病率較高且占比較高的2個抗性基因組合為Pi9+Pikh，3個抗性基因組合為Pi9+Pik+Pikh?？梢?，抗性基因組合Pi9+Pikh、Pi9+Pik+Pikh和Pi9+Pik+Pi1+Pikh是安徽地區(qū)較合適的基因組合。此外，本研究中有2份水稻材料未檢測到4個待測抗性基因，但抗病性表現(xiàn)較好，推測其可能含有其他抗性基因，值得進一步探究。

4 結(jié)論

2018—2020年長江中下游區(qū)試水稻品種稻瘟病抗性一般。含有單個抗性基因的水稻品種抗性水平不高，隨著聚合基因數(shù)增加，稻瘟病抗性水平呈上升趨勢。多基因聚合能提高水稻品種的稻瘟病抗性，但抗性強弱取決于抗性基因間的互作效應(yīng)，并不是簡單的累加效應(yīng)。水稻育種時應(yīng)選擇聚合在品種推廣地區(qū)抗性較好的基因組合。

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（責任編輯 麻小燕）06FB152F-66F4-4942-81C5-601FA2AEF053