山稔子油敷劑修復(fù)小鼠缺血性壓瘡的效果及機制分析

靖林林，刁建新，徐一華，曾志云，邱婷婷，吳秀瓊，孫學剛，項小軍 南方醫(yī)科大學中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院手術(shù)室，廣州505； 南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院； 南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院醫(yī)院感染管理科

缺血性壓瘡是骨隆突部、骶尾部皮膚、皮下組織長期受壓而產(chǎn)生的難愈性潰瘍，是手術(shù)后患者常見的并發(fā)癥。缺血性壓瘡發(fā)生的主要原因是局部組織持續(xù)性缺血、缺氧，并最終引起局限性破壞和壞死，因此血液循環(huán)與組織修復(fù)障礙是缺血性壓瘡發(fā)生的核心機制［1-2］。2019 版《壓瘡/壓力性損傷的預(yù)防和治療：臨床實踐指南》中建議，臨床可以使用非藥物治療作為減輕壓力性損傷疼痛的首要方法，可見缺血性壓瘡沒有特效藥物，首選是對癥治療，即減輕疼痛。中藥山稔子具有收斂止血、活血解毒之功，可以治療皮膚出血、潰爛等［3］。2020 年9 月—2021 年5月，本研究觀察了山稔子油敷劑對缺血性壓瘡小鼠的治療作用，并探討其機制是否與抗炎、消腫、瘢痕修復(fù)等有關(guān)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：SPF 級雄性KM 小鼠70 只，8～12 周齡，體質(zhì)量23～25 g，由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供；實驗動物飼養(yǎng)于南方醫(yī)科大學動物中心SPF級環(huán)境中，溫度18～24 ℃，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。藥物制備：山稔子采摘于河源市龍川縣新田鎮(zhèn)羊山，由本單位鑒定教研室陳興興鑒定為桃金娘科植物桃金娘的果實，系山稔子正品；將其曬干后炒炭，研磨成粉末，200 目的過濾篩篩選，研磨后再用100 目的過濾篩過濾；稱取30 g 過濾好的山稔子粉末，加入30 g 山茶油調(diào)和，最終制成油敷劑，4 ℃冰箱保存。主要試劑：白細胞介素6（IL-6）和白細胞介素10（IL-10）ELISA 試劑盒均購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司；血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、Ⅰ型膠原蛋白（COL-Ⅰ）、Ⅲ型膠原蛋白（COL-Ⅲ）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，免疫組化試劑盒購自香港基因公司。

1.2 動物分組、建模及干預(yù)處理 取SPF 級雄性KM 小鼠60 只，參照KASUYA 等［4］的方法建立小鼠缺血性壓瘡模型，方法如下：小鼠實驗前24 h背部脫毛2 cm×2 cm，10%水合氯醛400 mg/kg 腹腔麻醉，75%乙醇消毒，將兩個直徑1.2 cm、厚度0.5 cm 的圓形磁鐵夾住小鼠背部的皮膚，持續(xù)16 h，取下磁鐵。將60只缺血性壓瘡小鼠隨機分別為模型組、山稔子油敷劑組、安爾碘組，每組20 只，另取SPF 級雄性KM小鼠10只作為正常對照組。山稔子油敷劑組建模后局部涂抹山稔子油敷劑，將等量油敷劑均勻擦涂于皮膚夾傷處，模型組與安爾碘組分別局部涂抹等量的生理鹽水與安爾碘Ⅱ型皮膚消毒劑，2 次/天。正常對照組不予特殊處理。各組用苦味酸標記，分籠飼養(yǎng)，實驗期間小鼠自由進食、飲水。

1.3 皮膚創(chuàng)面情況觀察 ①創(chuàng)面大體情況：觀察模型組、山稔子油敷劑組、安爾碘組分組處理14 d內(nèi)皮膚紅腫、滲出、水泡等創(chuàng)面大體情況。②創(chuàng)面愈合情況：三組分別于分組處理0、7、14 d，采用格子法測量創(chuàng)面面積。

1.4 皮膚創(chuàng)面病理改變觀察 正常對照組分組處理當天收集正常皮膚組織，模型組、山稔子油敷劑組、安爾碘組分組處理0、7、14 d測定創(chuàng)面面積后收集創(chuàng)面皮膚組織，10%甲醛固定，順次進行包埋、切片，切片厚度為4μm，行常規(guī)HE染色。應(yīng)用倒置顯微鏡隨機選取5個視野，觀察各組皮膚組織炎癥細胞浸潤情況及組織汗腺、毛囊結(jié)構(gòu)、表皮細胞結(jié)構(gòu)變化。

1.5 血清IL-10、IL-6 水平檢測 采用ELISA 法。各組分組處理7、14 d，采集眼球血800～1 200 μL，4 ℃條件下3 000 r/min 離心15 min，取 上層血清，-80 ℃超低溫冰箱保存。采用ELISA 法檢測血清IL-10、IL-6水平，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.6 皮膚創(chuàng)面組織VEGF、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、bFGF、TGF-β 蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。各組分組處理7、14 d，采集眼球血后取皮膚創(chuàng)面組織，液氮組織研磨法提取皮膚組織總蛋白。BCA 蛋白定量，取50 μg 蛋白行SDS 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉后順次加入一抗、二抗，超敏ECL 化學發(fā)光。應(yīng)用Kodak 2000MM 圖像工作站成像分析條帶灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料采用偏度—峰度正態(tài)性檢驗方法，呈正態(tài)分布以±s表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠皮膚創(chuàng)面大體情況比較 分組處理后，三組小鼠皮膚創(chuàng)面均呈現(xiàn)急性炎癥狀態(tài)，主要表現(xiàn)為皮膚顯著紅腫、創(chuàng)面持續(xù)滲出，有不同大小水泡形成。分組處理7～14 d，與模型組相比，山稔子油敷劑組與安爾碘組紅腫、滲出顯著減輕，局部水泡數(shù)量與大小均減輕，但山稔子油敷劑減輕更明顯；山稔子油敷劑組創(chuàng)面逐步結(jié)痂，創(chuàng)面面積顯著縮小后完全脫痂，創(chuàng)面邊緣開始有新生毛發(fā)覆蓋，安爾碘組有個別小鼠未完全脫痂。

2.2 各組小鼠皮膚創(chuàng)面面積比較 見表1。

表1 各組小鼠分組處理后皮膚創(chuàng)面面積比較（mm2，±s）

表1 各組小鼠分組處理后皮膚創(chuàng)面面積比較（mm2，±s）

注：與模型比較，*P＜0.05；與安爾碘組比較，#P＜0.05。

組別模型組山稔子油敷劑組安爾碘組n 20 20 20 0 d 226.1± 8.2 226.4±11.5 223.5± 9.2 7 d 159.5±12.5 76.8±15.8*96.6±12.6*#14 d 65.7±16.5 24.3±11.3*54.5±16.7*#

2.3 各組小鼠皮膚創(chuàng)面病理改變比較 分組處理0 天，正常對照組表皮、真皮組織結(jié)構(gòu)清晰可見。分組處理7 d，模型組皮膚表皮、毛囊結(jié)構(gòu)缺失，真皮層充血、水腫，膠原纖維腫脹融合、斷裂，纖維中有大量炎癥細胞浸潤；山稔子油敷劑組和安爾碘組皮膚炎癥改變較模型組減輕。分組處理14 d，模型組真皮層內(nèi)形成肉芽腫，輕度角化過度，伴有棘層肥厚；山稔子油敷劑組表皮增生，角質(zhì)分化，形成假性角囊腫，毛囊結(jié)構(gòu)逐漸形成；安爾碘組表皮增生，伴有輕度角化過度及棘層肥厚。見OSID 碼圖1。

2.4 各組小鼠血清IL-6、IL-10水平比較 見表2。

表2 各組小鼠血清IL-6、IL-10水平比較（pg/mL，±s）

表2 各組小鼠血清IL-6、IL-10水平比較（pg/mL，±s）

注：與正常對照組同時間點比較，*P＜0.05；與模型組同時間點比較，#P＜0.05；與安爾碘組同時間點比較，△P＜0.05。

組別正常對照組分組處理7 d分組處理14 d模型組分組處理7 d分組處理14 d山稔子油敷劑組分組處理7 d分組處理14 d安爾碘組分組處理7 d分組處理14 d n 10 20 20 20 IL-6 20.14± 3.13 19.49± 2.56 198.83±12.11*77.83± 9.86*109.74± 9.73*#53.58±11.47*#129.64± 8.93*#△63.56± 9.75*#△IL-10 148.54± 9.14 149.49± 9.55 74.04± 8.84*69.19± 7.37*93.58±14.8*#89.38± 6.15*#81.54± 9.23*#△73.39± 7.85*#

2.5 各組小鼠皮膚創(chuàng)面組織VEGF、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、bFGF、TGF-β蛋白表達比較 見表3、OSID碼圖2。

表3 各組小鼠皮膚創(chuàng)面組織VEGF、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、bFGF、TGF-β蛋白表達比較（±s）

表3 各組小鼠皮膚創(chuàng)面組織VEGF、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、bFGF、TGF-β蛋白表達比較（±s）

注：與正常對照組同時間點比較，*P＜0.05；與模型組同時間點比較，#P＜0.05；與山稔子油敷劑組同時間點比較，△P＜0.05。

組別正常對照組分組處理7 d分組處理14 d模型組分組處理7 d分組處理14 d山稔子油敷劑組分組處理7 d分組處理14 d安爾碘組分組處理7 d分組處理14 d n 10 20 20 20 VEGF 0.449±0.010 0.404±0.008 0.055±0.011*0.329±0.011*0.456±0.018#0.476±0.015*#0.404±0.008#△0.409±0.014#△COL-Ⅰ0.339±0.016 0.395±0.015 0.215±0.004*0.447±0.014*0.254±0.002*#0.436±0.015*0.395±0.015#△0.425±0.009 COL-Ⅲ0.963±0.016 1.011±0.011 0.073±0.004*0.898±0.014*0.526±0.009*#1.063±0.012*#1.011±0.011△0.968±0.018*#△bFGF 0.308±0.010 0.308±0.010 0.103±0.008*0.243±0.020*0.272±0.008*#0.297±0.015#0.308±0.010 0.267±0.010*TGF-β 0.902±0.017 0.947±0.020 0.290±0.013*0.565±0.018*0.547±0.027*#0.773±0.005*#0.947±0.020 0.797±0.016*#

3 討論

血脈瘀滯、痰凝毒聚是缺血性壓瘡的核心病機，因此對壓瘡的治療策略應(yīng)以清熱解毒、活血化瘀為主［5］。山稔子又稱崗稔，為藥用植物桃金娘的果實，盛產(chǎn)嶺南地區(qū)［6］。《本草綱目遺失》記載山稔子具有收斂止血的作用，主治咳血、皮膚出血、潰爛等。廣東省山區(qū)常用山稔子外敷治療燒傷，具有良好的療效。本研究結(jié)果顯示，山稔子油敷劑可有效縮小缺血性壓瘡小鼠的皮膚創(chuàng)面面積，加快皮膚脫痂，促進皮膚修復(fù)；病理結(jié)果顯示其能夠增加肌纖維覆蓋，減少淋巴細胞以及單核細胞浸潤，對缺血性壓瘡小鼠的治療效果較好。

缺血性壓瘡的主要治療措施是創(chuàng)面處理和早期修復(fù)，而創(chuàng)面處理主要是清除異物、抗炎、促創(chuàng)面修復(fù)。血管生成是創(chuàng)面修復(fù)的基礎(chǔ)，VEGF 是最強的促血管內(nèi)皮細胞有絲分裂原，是血管生成的一個重要調(diào)節(jié)因素［7-8］。缺血性壓瘡的修復(fù)一定程度上是肉芽組織中各種修復(fù)細胞增殖、成纖維細胞產(chǎn)生大量膠原，從而修補創(chuàng)面的過程［9］。膠原是創(chuàng)面組織中的主要基質(zhì)成分，其作為細胞生長的依附和支撐物，能誘導(dǎo)上皮細胞增殖、分化和移行［10］。皮膚中的膠原蛋白主要有Ⅰ型和Ⅲ型，COL-Ⅰ纖維粗大，位于真皮淺層，是燒傷創(chuàng)面瘢痕組織纖維化的物質(zhì)基礎(chǔ)；COL-Ⅲ纖維細小，主要位于真皮深層，含量比較高［11-12］。COL-Ⅰ和COL-Ⅲ膠原纖維含量比與燒傷創(chuàng)面無瘢痕愈合呈負相關(guān)關(guān)系［13］。本研究結(jié)果顯示，山稔子油敷劑能顯著促進缺血性壓瘡小鼠皮膚創(chuàng)面組織VEGF、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白表達，提高VEGF 表達可促進血管生成，有利于膠原蛋白的重構(gòu)，COL-Ⅲ表達升高可促進細小纖維蛋白生成，從而達到減少疤痕形成、改善缺血性壓瘡的作用。IL-6 與IL-10 在控制傷口炎癥和瘢痕形成中具有關(guān)鍵作用［14］。研究顯示，IL-6 可導(dǎo)致小鼠傷口愈合延遲［15］。IL-10 可抑制炎癥和瘢痕組織的形成，IL-10 表達升高可以加速傷口再上皮化，促進傷口肉芽組織覆蓋，改善傷口血運重建［16］。本研究顯示，山稔子油敷劑作用7 d 即可通過降低血清IL-6、升高IL-10 而減輕缺血性壓瘡小鼠的炎癥反應(yīng)。

bFGF具有促進創(chuàng)面愈合的作用，不僅可以釋放生長因子，同時可以釋放膠原酶等有關(guān)基質(zhì)蛋白酶，分解、清除損傷創(chuàng)面變性壞死的細胞及細胞外基質(zhì)成分，為新生上皮的爬行、細胞增殖創(chuàng)造環(huán)境［17］。本研究結(jié)果顯示，山稔子油敷劑可顯著增加缺血性壓瘡小鼠皮膚創(chuàng)面組織bFGF 蛋白表達。因此，山稔子油敷劑促進創(chuàng)面愈合的機制可能是增加bFGF 及膠原酶等有關(guān)基質(zhì)蛋白酶表達，從而分解、清除缺血性壓瘡導(dǎo)致的創(chuàng)面變性壞死細胞及其基質(zhì)成分，為新生上皮爬行、細胞增殖創(chuàng)造環(huán)境，最終促進創(chuàng)面的修復(fù)。TGF-β 與傷口修復(fù)愈合密切相關(guān)，可以促進成纖維細胞遷移、增殖，并促進細胞外基質(zhì)的分泌，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞形成毛細血管，減少傷口處細胞外基質(zhì)的酶解，是促進傷口肉芽組織形成和膠原沉積的重要因素之一。同時，TGF-β 可以誘導(dǎo)單核細胞趨化、活化、產(chǎn)生其他活化因子，清除細菌和壞死組織，并促進上皮細胞再生、分化、連接。本研究結(jié)果顯示，山稔子油敷劑可顯著增加缺血性壓瘡小鼠皮膚創(chuàng)面組織TGF-β 蛋白表達，其可能通過TGF-β促進成纖維細胞遷移、增殖，并促進其合成、分泌細胞外基質(zhì)，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞形成毛細血管，從而促進傷口肉芽組織形成和膠原沉積。

綜上所述，山稔子油敷劑可提高缺血性壓瘡小鼠皮膚組織VEGF、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、bFGF、TGF-β蛋白表達，其可能通過促進血管生成及膠原蛋白合成、降低炎癥反應(yīng)等機制促進缺血性壓瘡小鼠的皮膚創(chuàng)面愈合。