基于生物信息學(xué)方法構(gòu)建重度抑郁癥發(fā)病的miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

李果，張青萍，劉永輝，吳鵬，吳成挺，周嬌嬌

1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，南寧 530023；2 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病科

重度抑郁癥（MDD）是一種常見的精神類疾病，日益威脅著人類的健康，但其確切的發(fā)病機(jī)制仍未闡明，亦無極其有效的干預(yù)方案［1］。因此，探討MDD的潛在發(fā)病機(jī)制、研發(fā)MDD 的有效治療方法是全世界亟需解決的公共衛(wèi)生問題和社會問題。微小RNA（miRNA）是具有調(diào)控功能的非編碼短小RNA，通過調(diào)控下游靶基因參與細(xì)胞的生長發(fā)育過程。研究表明，MDD的發(fā)生發(fā)展與miRNA異常表達(dá)密切相關(guān)［2］，但尚未發(fā)現(xiàn)參與MDD 發(fā)生發(fā)展的特異性miRNA。生物信息學(xué)方法是聯(lián)合多學(xué)科領(lǐng)域信息的一種新興技術(shù)，通過整合分析疾病相關(guān)數(shù)據(jù)，可更高效、系統(tǒng)地揭示疾病的分子機(jī)制，并從宏觀層面揭示疾病發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜過程。2021年1月—6月，本研究通過生物信息學(xué)方法挖掘MDD 患者外周血中差異表達(dá)的miRNA 和基因，建立潛在的miRNAmRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并篩選出關(guān)鍵miRNA 和基因，為闡明MDD的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 miRNA 微陣列數(shù)據(jù)集選擇 通過國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（GEO 數(shù)據(jù)庫），以“major depression”“blood”“miRNA”作為關(guān)鍵詞，搜索出關(guān)于MDD 患者外周血的miRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)集，最終篩選出符合條件的數(shù)據(jù)集GSE81152。該數(shù)據(jù)集由GPL21814 平臺合成，包含19 例正常人和30 例MDD 患者的外周血（分別作為對照組和觀察組），正常人均無個(gè)人和家族精神病病史，MDD 患者來源于愛爾蘭科克市的精神衛(wèi)生服務(wù)機(jī)構(gòu)和圣帕特里克大學(xué)醫(yī)院，均未接受治療。

1.2 差異表達(dá)miRNA（DE-miRNA）篩選 下載GSE81152 數(shù)據(jù)集，并分出對照組和觀察組數(shù)據(jù)，采用R軟件的“l(fā)imma”軟件包，對兩組表達(dá)矩陣數(shù)據(jù)進(jìn)行常規(guī)背景校正和分位數(shù)歸一化；通過高級的t檢驗(yàn)方法比較兩組基因表達(dá)水平，以P＜0.05 和|logFC|＞0.15作為基本條件篩選DE-miRNA，最后使用R 軟件的“Gplot”軟件包對比較后的結(jié)果進(jìn)行可視化，即構(gòu)建差異分析的火山圖。

1.3 DE-miRNA 上游轉(zhuǎn)錄因子和下游靶基因預(yù)測 使用FunRich 軟件預(yù)測DE-miRNA 上游的潛在轉(zhuǎn)錄因子，并篩選出影響DE-miRNA 表達(dá)的主要上游轉(zhuǎn)錄因子，以P＜0.05 作為鑒定轉(zhuǎn)錄因子的闕值。使用miRWalk 和TargetScan 數(shù)據(jù)庫分別預(yù)測上、下調(diào)DE-miRNA 的下游靶基因，再篩選出兩個(gè)數(shù)據(jù)庫共同的上調(diào)DE-miRNA 的下游靶基因和下調(diào)DEmiRNA的下游靶基因。

1.4 DE-miRNA 下游目標(biāo)基因篩選 通過GEO 數(shù)據(jù)庫檢索并下載MDD 患者外周血的基因表達(dá)芯片GSE98793 和GSE76826，其中GSE98793 數(shù)據(jù)集包含64 例份健康對照人群和128 例份MDD 患者的全血樣本，GSE76826 數(shù)據(jù)集包含12 例份健康對照人群和10 例份MDD 患者的外周血樣本。采用R 軟件的“l(fā)imma”軟件包分別對下載整理好的兩個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行校正和歸一化，分別比較兩組外周血相關(guān)基因的表達(dá)水平，并篩選出同時(shí)滿足P＜0.05 和|logFC|＞0.15 的差異表達(dá)基因（DEG），并構(gòu)建火山圖。將上調(diào)DE-miRNA 的下游靶基因和下調(diào)的DEG 進(jìn)行交集，將下調(diào)DE-miRNA 的下游靶基因和上調(diào)的DEG進(jìn)行交集，最終獲得DE-miRNA下游目標(biāo)基因。

1.5 京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析 通過4個(gè)不同的數(shù)據(jù)庫（Enrichr數(shù)據(jù)庫、DAVID數(shù)據(jù)庫、Metascape 數(shù)據(jù)庫和GlueGO 數(shù)據(jù)庫），對DE-miRNA 下游目標(biāo)基因分別進(jìn)行KEGG 富集分析，篩選出主要的信號通路，設(shè)置條件為P＜0.05。

1.6 miRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用String 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建目標(biāo)基因的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置網(wǎng)絡(luò)最低要求互作得分為0.15。通過miRNA 預(yù)測的靶基因結(jié)果找到目標(biāo)基因?qū)?yīng)的miRNA，使用cytoscape3.6.1 軟件構(gòu)建miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖；最后用插件“cytohubba”進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯鶕?jù)MCC、MNC 和Degree 三種不同的計(jì)算方法篩選出核心miRNA和核心基因。

2 結(jié)果

2.1 DE-miRNA 篩選結(jié)果 在獲得的DE-miRNA中，上調(diào)的DE-miRNA 有8 個(gè)（hsa-miR-3129-3p、hsamiR-4428、hsa-miR-3122、hsa-miR-4783-5p、hsa-miR-186-5p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-3156-5p），下調(diào)的DE-miRNA 有10 個(gè)（hsa-miR-668、hsa-miR-496、hsa-miR-655、hsa-miR-3664-3p、hsamiR-1208、hsa-miR-129-5p、hsa-miR-214-5p、hsamiR-1275、hsa-miR-539-5p、hsa-miR-1185-2-3p）。見OSID碼圖1、2。

2.2 DE-miRNA 上游轉(zhuǎn)錄因子和下游靶基因預(yù)測結(jié)果 在FunRich 軟件篩選出的DE-miRNA 主要上游轉(zhuǎn)錄因子有5個(gè)，分別是特異性蛋白1（Sp1）、特異性蛋白4（Sp4）、早期生長反應(yīng)1（EGR1）、鋅指蛋白143（ZNF143）和鋅指蛋白161（ZFP161），見OSID 碼圖3。miRWalk 和TargetScan 數(shù)據(jù)庫共同的上調(diào)DE-miRNA 和下調(diào)DE-miRNA 的下游靶基因分別有13 351和15 549個(gè)。

2.3 DE-miRNA 下游目標(biāo)基因篩選結(jié)果 在GSE98793 數(shù)據(jù)集中上、下調(diào)的DEG 分別有231、241個(gè)（OSID 碼圖4A），在GSE76826 數(shù)據(jù)集中上、下調(diào)的DEG分別有3 290、3 377個(gè)（OSID碼圖4B）。上調(diào)DE-miRNA 的下游靶基因與下調(diào)DEG 的交集得到47 個(gè)基因、下調(diào)DE-miRNA 的下游靶基因與上調(diào)DEG 的交集得到48 個(gè)基因，最終共得到95 個(gè)下游目標(biāo)基因（OSID碼圖5）。

2.4 下游目標(biāo)基因的KEGG 富集分析結(jié)果 下游目標(biāo)基因在造血細(xì)胞系、Th17細(xì)胞分化、人類T細(xì)胞白血病病毒1感染、mTOR信號通路中顯著富集。見OSID碼圖6。

2.5 miRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 PPI 網(wǎng)絡(luò)的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)為95、邊數(shù)為205、平均節(jié)點(diǎn)度為4.32、平均局部聚類系數(shù)為0.325。miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，見OSID 碼圖7。網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龊蠛Y選出3 個(gè)核心miRNA（hsa-miR-4428、hsa-miR-3664-3p 和hsamiR-539-5p）和5 個(gè)核心基因（IL-7R、IKZF3、CD3D、CD3G和MS4A1）。見表1。

表1 核心miRNA和基因在3種計(jì)算方法中的得分（分）

3 討論

研究顯示，miRNA 通過調(diào)節(jié)基因的表達(dá)在神經(jīng)精神疾病中起著重要作用，其失調(diào)導(dǎo)致下游基因表達(dá)水平的改變也是MDD 的發(fā)病原因之一［2-3］。但是目前關(guān)于MDD 患者比較全面的miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)相關(guān)研究報(bào)道較少。因此本研究先對GEO 數(shù)據(jù)庫中MDD 患者的miRNA 數(shù)據(jù)芯片進(jìn)行差異分析，最終得到8 個(gè)上調(diào)的DE-miRNA 和10 個(gè)下調(diào)的DE-miRNA，其部分分析結(jié)果也有相關(guān)的研究報(bào)道。miR-24-3p在MDD 患者的腦組織（腹側(cè)前額葉皮層）中表達(dá)上調(diào)，予抗抑郁治療后血液中miR-24-3p 表達(dá)則明顯下降［4］；MDD 患者血清中miR-185 表達(dá)明顯高于健康對照人群［5］；另外，miR-185-5p 在雙相情感障礙患者（含有MDD 患者）中的表達(dá)也明顯上調(diào)［6］。有研究表明，miR-185可通過抑制額葉皮質(zhì)中TrkB-T1 的表達(dá)，導(dǎo)致精神類疾病發(fā)生［7］。miR-129-5p在MDD小鼠腦內(nèi)合成顯著降低，其表達(dá)改變可能與TRPC3/6 和TREK1 活性變化導(dǎo)致神經(jīng)元離子失衡有關(guān)［8］。雖然目前暫未找到miR-214-5p 在MDD中的相關(guān)研究，但DENG 等［9］通過動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在抑郁小鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮層中miR-214-3p 表達(dá)明顯增高，且認(rèn)為該miRNA 是通過抑制了β-catenin 表達(dá)而導(dǎo)致了小鼠的抑郁行為，有效降低miR-214-3p 表達(dá)可達(dá)到治療MDD 的效果。這與本研究篩選的結(jié)果有所不同，這種差異可能與所取的樣本、種類或?qū)嶒?yàn)室方法不同有關(guān)，后期仍需更多實(shí)驗(yàn)研究來探討。

先前有研究表明，miRNA 的表達(dá)可受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，并進(jìn)一步共同調(diào)節(jié)下游mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯，是細(xì)胞代謝的主要調(diào)節(jié)劑［3］。因此本研究利用Fun-Rich 軟件預(yù)測了調(diào)節(jié)DE-miRNA 并可能在MDD 中發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄因子。Sp1 和Sp4 屬于轉(zhuǎn)錄因子家族的知名成員，均參與多種基本生物學(xué)過程，如細(xì)胞生長、分化、凋亡等，在多種精神疾病中的調(diào)節(jié)作用也已得到充分證明［10］，但其在MDD 中的影響尚不明確。EGR1 被定義為鋅指轉(zhuǎn)錄因子，可通過參與大腦中神經(jīng)元活動的關(guān)鍵過程而影響神經(jīng)精神疾病的發(fā)展，包括MDD。COVINGTON 等［11］發(fā)現(xiàn)，EGR1 在MDD 患者大腦前額皮質(zhì)中呈低表達(dá)，因此上調(diào)EGR1 表達(dá)可能是抗抑郁治療的一種有效手段。但ZHANG 等［12］卻發(fā)現(xiàn)，EGR1 在大腦海馬中的表達(dá)是上調(diào)的，且通過抑制EGR1 表達(dá)可快速發(fā)揮抗抑郁效果。這可能是實(shí)驗(yàn)方法及所取樣本不同而導(dǎo)致的，有關(guān)這些的轉(zhuǎn)錄因子在MDD 中的作用尚有爭議，有待于將來進(jìn)一步研究。

本研究通過對DE-miRNA 靶基因與DEG 的整合，共篩選出95 個(gè)目標(biāo)基因并進(jìn)行了KEGG 富集分析，其結(jié)果顯示其在造血細(xì)胞系、Th17 細(xì)胞分化、人類T 細(xì)胞白血病病毒1 感染和mTOR 信號通路中顯著富集。造血細(xì)胞系、Th17 細(xì)胞分化和人類T 細(xì)胞白血病病毒1 感染途徑均與體內(nèi)免疫應(yīng)答過程相關(guān)，體內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)與MDD 有密切聯(lián)系，而神經(jīng)炎癥是導(dǎo)致情緒障礙（包括MDD）的原因之一，且抑制炎癥反應(yīng)在抗抑郁治療中也有不錯(cuò)的效果，但免疫反應(yīng)與MDD 的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系還有待更深入研究［13-14］。mTOR 信號通路是由含有mTOR 的復(fù)合物引起下游反應(yīng)的一個(gè)途徑，因mTOR 可與多種蛋白質(zhì)結(jié)合形成兩種不同的復(fù)合體（mTORC1 和mTORC2），可將mTOR 信號通路分為mTORC1 途徑和mTORC2 途徑。mTORC1 途徑通過控制蛋白質(zhì)的磷酸化調(diào)節(jié)多種生物過程，且mTORC1 通路失調(diào)可涉及到多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如MDD、精神分裂癥［15］。因此，激活mTORC1 信號引起下游反應(yīng)能夠抑制抑郁樣行為［16］。而mTORC2 途徑則主要調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、細(xì)胞代謝和細(xì)胞骨架組織，但其可通過影響下游AKT/GSK3β 途徑導(dǎo)致MDD 的發(fā)生［17］。研究發(fā)現(xiàn)，抗抑郁藥可先通過促進(jìn)大腦海馬及前額葉皮層內(nèi)AKT 和ERK1/2 因子的磷酸化，激活MAPK/ERK 和PI3K/AKT途徑而誘導(dǎo)下游的mTOR信號通路，最后介導(dǎo)腦組織中的突觸途徑發(fā)揮抗抑郁的作用［18］。

本研究最后通過構(gòu)建miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，篩選出核心miRNA（hsa-miR-4428、hsa-miR-3664-3p和hsa-miR-539-5p）和 核 心 基 因（IL-7R、IKZF3、CD3D、CD3G 和MS4A1）。目前關(guān)于miRNA 的研究越來越多，但miR-4428 和miR-3664-3p 在MDD 中的研究相對甚少。CIUCULETE 等［19］認(rèn)為，miR-3664-5p 表達(dá)改變是導(dǎo)致MDD 發(fā)生的重要因素，而miR-3664-3p是否有相同的作用尚無定論。miRNA（包括miR-539）可通過靶向調(diào)節(jié)HTR2A 基因多態(tài)性導(dǎo)致MDD 的發(fā)生［20］。研究表明，大腦組織中miR-539-3p在精神類疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用［21］。IL-7R 基因編碼的蛋白質(zhì)是白細(xì)胞介素7（IL-7）的受體，參與體內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)，而免疫炎癥反應(yīng)與MDD 的發(fā)生密切相關(guān)［13］。另外，IKZF3 表達(dá)對CD4+T 淋巴細(xì)胞中抗炎細(xì)胞因子IL-10 的表達(dá)有影響，CD3D 和CD3G 基因在T 淋巴細(xì)胞的增殖發(fā)育過程中發(fā)揮作用，而MDD 又與IL-10、T 淋巴細(xì)胞比例改變有關(guān)［22-24］。此外，MS4A1（即CD20）在B 淋巴細(xì)胞增殖和分化中具有重要的調(diào)節(jié)作用，可通過影響B(tài) 淋巴細(xì)胞數(shù)量導(dǎo)致MDD 的發(fā)生［25］。這些重要的基因主要在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用，而免疫反應(yīng)又是導(dǎo)致MDD 的重要途徑，因此針對這些基因通過免疫系統(tǒng)來參與MDD 的發(fā)生可能是研究其機(jī)制的相關(guān)切入點(diǎn)。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了MDD 患者的

miRNA-mRNA 調(diào) 控 網(wǎng) 絡(luò)，其 中hsa-miR-4428、hsamiR-3664-3p 和hsa-miR-539-5p 等 核 心miRNA 通 過影響IL-7R、IKZF3和CD3D等核心基因表達(dá)，并進(jìn)一步調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，在MDD 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究通過生物信息學(xué)方法構(gòu)建了涉及MDD發(fā)病機(jī)理的miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，有利于更全面地闡明其潛在機(jī)制，也為MDD 的診斷及開發(fā)新的治療藥物提供了一個(gè)新思路。但是本文是根據(jù)大數(shù)據(jù)預(yù)測出其可能存在的分子機(jī)制，部分預(yù)測結(jié)果仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。