子宮內(nèi)膜再生細(xì)胞通過(guò)表達(dá)PD-L1對(duì)大鼠腸道缺血再灌注損傷的抑制作用觀察

葉奎，彭秋鳳，史剛剛，曲鑫，王浩

1 天津市第四中心醫(yī)院血管外科，天津 300142；2 天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院肛腸外科；3 天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院普通外科；4 天津普通外科研究所

腸道缺血再灌注損傷（IRI）是指由于不同病因?qū)е履c道血供中斷，恢復(fù)血供后出現(xiàn)損傷加重甚至不可逆損傷的現(xiàn)象［1］。腸道IRI發(fā)生后，由于局部腸道組織氧化應(yīng)激加劇，局部炎癥反應(yīng)亢進(jìn)，腸道屏障被破壞，腸道細(xì)菌移位，繼而誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征［2］。近些年來(lái)，基于干細(xì)胞的治療方法對(duì)于缺血性疾病以及腸道IRI 的治療效果較好［3］。子宮內(nèi)膜再生細(xì)胞（ERC）作為一種來(lái)源于育齡期女性月經(jīng)血的新型類間充質(zhì)干細(xì)胞，具有減輕機(jī)體缺血損傷、促進(jìn)損傷修復(fù)、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡等作用，在再生醫(yī)學(xué)以及細(xì)胞治療領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛［4］。既往研究發(fā)現(xiàn)，程序性死亡配體1（PD-L1）能夠在ERC表面表達(dá)，且能夠作為發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的有效靶點(diǎn)［5］。但是，目前ERC 能否通過(guò)表達(dá)PD-L1 減輕腸道IRI 及其潛在機(jī)制均不明確。為此，我們于2021 年1 月—9 月進(jìn)行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Wistar 雄性大鼠50 只，7～8周齡，體質(zhì)量200～220 g，均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院［生產(chǎn)許可證為SYXK（京）2019-0001］。主要試劑：胎牛血清（FBS）和DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基均購(gòu)自美 國(guó)Hyclone 公 司；抗 大 鼠CD45、CD79、CD90、CD105、HLA-DR 及抗人PD-L1等流式抗體均購(gòu)自美國(guó)eBioscience 或Biolegend 公司，大鼠白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素6（IL-6）細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京達(dá)科為生物科技有限公司，二胺氧化酶（DAO）和D-乳酸（DLac）均購(gòu)自南京森倍伽生物科技有限公司；青—鏈霉素、HE染色試劑盒、淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll配制）均購(gòu)自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；重組人干擾素γ（IFN-γ）購(gòu)自美國(guó)Peprotech 公司，抗PD-L1 單克隆抗體（克隆號(hào)：M1H2）購(gòu)自賽默飛科技有限公司。

1.2 ERC的制備及鑒定

1.2.1 ERC 制備 本研究經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)（倫理審批文書(shū)批號(hào)：IRB2021-WZ-132）。將15 mL 淋巴細(xì)胞分離液置于50 mL 離心管中備用，利用月事杯收集2 位健康育齡期（25～35 周歲）女性志愿者的月經(jīng)血，用含青—鏈霉素的磷酸鹽緩沖液（PBS）和月經(jīng)血按照1∶1 的體積比進(jìn)行混合，緩慢滴加15 mL 混合液于淋巴細(xì)胞分離液上，2 000 r/min進(jìn)行密度梯度離心，取中間云霧層細(xì)胞。用10 mL PBS 重懸細(xì)胞，洗滌3 次，用含15%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)皿上。3 d后第一次更換一半培養(yǎng)基，之后每2～3 d更換全部培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度達(dá)90%時(shí)，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 ERC 鑒定 取傳代至第3 代的細(xì)胞，胰酶消化后觀察細(xì)胞形態(tài)并進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)鑒定。細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果顯示，月經(jīng)血來(lái)源的單核細(xì)胞分離后72 h呈現(xiàn)米粒樣，更換培養(yǎng)基后細(xì)胞逐漸變?yōu)樗笮危?～10 d 后細(xì)胞逐漸長(zhǎng)成類似于間充質(zhì)干細(xì)胞樣的巢狀集落（OSID 碼圖1A）；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，該ERC 能夠高表達(dá)CD90 和CD105，低表達(dá)或不表達(dá)CD79、HLA-DR、CD45（OSID 碼圖1B），符合間充質(zhì)干細(xì)胞的表面鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 IFN-γ 對(duì)ERC 表 面PD-L1 表 達(dá) 影 響 的 觀 察按照既往發(fā)表文獻(xiàn)［6］的方法，取傳代至第4 代的ERC，細(xì)胞貼壁后向培養(yǎng)體系中加入重組人IFN-γ 5 ng/mL，72 h 后收集細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)情況。結(jié)果顯示，IFN-γ刺激前后ERC 表面PD-L1 陽(yáng)性表達(dá)率分別為29.577% ±1.279%、62.823% ± 3.651%，二者比較P＜0.01；證實(shí)IFN-γ可以刺激ERC高表達(dá)PD-L1（OSID碼圖2）。

1.4 動(dòng)物模型構(gòu)建與分組處理 所有大鼠飼養(yǎng)以及動(dòng)物操作均在天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院普通外科研究所完成，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)過(guò)天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)：IRB2021-DW-31）。50只Wistar大鼠提前12 h禁食，自由飲水，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、PD-L1 過(guò)表達(dá)ERC 組、ERC 治療組、PD-L1 低表達(dá)ERC 組，每組10 只。除假手術(shù)組外，均利用腸系膜上動(dòng)脈結(jié)扎30 min 后恢復(fù)血供的方法［7］建立腸道IRI大鼠模型，假手術(shù)組開(kāi)腹后分離腸系膜上動(dòng)脈但不結(jié)扎。建模后，PD-L1 過(guò)表達(dá)ERC 組、ERC 治療組和PD-L1 低表達(dá)ERC 組分別通過(guò)尾靜脈注射的方法，給予5 ng/mL IFN-γ 預(yù)刺激72 h 后的ERC、普通ERC、10 μg/mL 抗人PD-L1 抗體作用72 h后的ERC各5×106個(gè)。

1.5 腸道組織損傷情況觀察 采用HE 染色。各組分組處理72 h后處死，收集腸道組織，10%甲醛固定48 h，進(jìn)行脫水、包埋、切片、染色，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照HE 染色試劑盒說(shuō)明書(shū)。按照Chiu's 評(píng)分評(píng)價(jià)腸道組織損傷情況，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：正常腸絨毛結(jié)構(gòu)為0分，絨毛頂端黏膜下出現(xiàn)間隙、毛細(xì)血管充血為1分，黏膜下間隙擴(kuò)大、腸黏膜與黏膜下層分離為2分，黏膜與黏膜下層分離延伸到腸絨毛兩側(cè)為3分，絨毛變鈍、固有層及其血管暴露、炎癥組織浸潤(rùn)為4分，固有層消化崩解、出血或形成潰瘍?yōu)?分。

1.6 血清腸道屏障功能相關(guān)指標(biāo)及炎癥因子水平檢測(cè) 各組分組處理72 h處死前，收集外周血，分離獲得血清，采用ELISA 法檢測(cè)血清腸道屏障功能相關(guān)指標(biāo)D-Lac、DAO 及炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料采用夏皮羅—威爾克正態(tài)性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布以-x±s表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組腸道組織損傷評(píng)分比較 假手術(shù)組、PD-L1 過(guò)表達(dá)ERC 組、ERC 治療組、PD-L1 低表達(dá)ERC 組、模型組腸道組織損傷評(píng)分分別為（0.500 ±0.534）、（2.000±0.535）、（2.875±0.641）、（3.750±0.463）、（4.125 ± 0.641）分，組 間 兩 兩 比 較P均＜0.05。

2.2 各組血清D-Lac、DAO、TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較 假手術(shù)組、PD-L1 過(guò)表達(dá)ERC 組、ERC 治療組、PD-L1 低表達(dá)ERC 組、模型組血清D-Lac、DAO、TNF-α、IL-6、IL-1β 水平均依次升高，組間兩兩比較P均＜0.05。見(jiàn)表1。

表1 各組血清D-Lac、DAO、TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較（±s）

表1 各組血清D-Lac、DAO、TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與PD-L1過(guò)表達(dá)ERC組比較，△P＜0.05；與ERC治療組比較，▲P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組PD-L1過(guò)表達(dá)ERC組ERC治療組PD-L1低表達(dá)ERC組n 10 10 10 10 10 D-Lac（μg/L）512.945± 58.930 1 699.428±170.430*1 480.424±106.753*#1 416.698±123.726*#△1 197.025±131.792*#△▲DAO（pg/mL）30.434± 6.097 137.755±10.937*119.193± 8.364*#101.065±12.319*#△77.121± 7.856*#△▲TNF-α（pg/mL）182.871±39.517 588.089±65.933*354.059±72.029*#458.745±80.550*#△561.144±70.905*#△▲IL-6（pg/mL）240.701±67.557 821.415±99.461*419.478±90.166*#545.165±63.249*#△660.323±62.866*#△▲IL-1β（pg/mL）76.513±14.347 158.104±18.850*84.120±10.982*#104.021± 7.653*#△124.383±12.512*#△▲

3 討論

腸道IRI 是一種繼發(fā)于腸系膜上動(dòng)脈栓塞、失血性休克、小腸移植等疾病的嚴(yán)重并發(fā)癥，該過(guò)程有多種因素共同參與；腸道在缺血階段組織細(xì)胞代謝水平下降，大量損傷相關(guān)模式分子和促炎因子釋放，在恢復(fù)血供時(shí)大量含氧血流灌注加重?fù)p傷，從而促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子釋放，局部組織炎癥反應(yīng)劇烈，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致腸道屏障破壞，腸道細(xì)菌移位至外周血，造成全身系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)［8-11］。近年來(lái)，以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療策略有望成為預(yù)防或抑制IRI的有效措施［3，5，12］。間充質(zhì)干細(xì)胞作為一種成體干細(xì)胞，一方面能夠抑制局部炎癥反應(yīng)，另一方面能夠釋放大量促血管生成因子以及營(yíng)養(yǎng)因子，從而促進(jìn)局部損傷組織的修復(fù)。ERC 是一種新型的類間充質(zhì)干細(xì)胞，來(lái)源于育齡期女性的月經(jīng)血。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ERC 能夠有效抑制小鼠肢體缺血，促進(jìn)腎臟缺血再灌注損傷的修復(fù)，抑制刀豆蛋白A 誘導(dǎo)的急性肝損傷，治療小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎以及誘導(dǎo)小鼠異位心臟移植術(shù)后的免疫耐受等，為IRI 的治療提供了廣闊的應(yīng)用前景［13-16］。PD-L1 是程序性死亡受體的配體，能夠與PD-1 結(jié)合，從而抑制免疫排斥反應(yīng)［17］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ERC 能夠通過(guò)表達(dá)PD-L1 來(lái)誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）生成，促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化，從而抑制局部炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)免疫，最終誘導(dǎo)小鼠心臟移植后的免疫耐受［9，18］。在缺血性疾病中，ERC 可能釋放大量的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），有助于促進(jìn)局部組織損傷修復(fù)和微循環(huán)形成。

本研究首先利用IFN-γ 刺激ERC，從而使其高表達(dá)PD-L1，這一結(jié)果也得到既往發(fā)表文獻(xiàn)的支持［19］。在正常的生理狀態(tài)下，人體內(nèi)血液中D-Lac水平較低，而當(dāng)腸道細(xì)菌大量增殖酵解，導(dǎo)致腸道屏障功能紊亂時(shí)，大量D-Lac 釋放入血，使得外周血中D-Lac 水平升高。DAO 是哺乳動(dòng)物腸道黏膜上層絨毛細(xì)胞中具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶分子，外周血DAO 升高提示腸道屏障功能被破壞。同時(shí)，外周血細(xì)胞因子水平能夠反映機(jī)體的炎癥狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組、PD-L1 過(guò)表達(dá)ERC 組、ERC 治療組、PD-L1低表達(dá)ERC組、模型組腸道組織損傷評(píng)分及血清D-Lac、DAO、TNF-α、IL-6、IL-1β 水平均依次升高；提示高表達(dá)PD-L1 的ERC 相較于未處理的ERC 或低表達(dá)PD-L1 的ERC 能夠?qū)δc道IRI 發(fā)揮更好的治療效果，同時(shí)可以減輕腸道屏障功能損傷、降低促炎細(xì)胞因子表達(dá)，也證實(shí)了ERC 表面表達(dá)PDL1是其發(fā)揮治療效果的重要靶點(diǎn)。本研究阻斷PDL1 后的ERC 相較于模型組仍然具有良好的治療效果，這說(shuō)明了PD-L1 不是ERC 發(fā)揮功能的惟一效應(yīng)分子，ERC 可能還存在其他發(fā)揮效應(yīng)功能的分子，仍有待進(jìn)一步研究［19］。

綜上所述，ERC 能夠通過(guò)表達(dá)PD-L1 而減輕大鼠腸道IRI 損傷，其機(jī)制可能與降低腸道屏障功能損傷及炎癥反應(yīng)有關(guān)，但是其具體的調(diào)控通路及調(diào)控因子仍需深入研究。在未來(lái)的工作中，我們可以通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)來(lái)促進(jìn)ERC 表面PD-L1 過(guò)表達(dá)，以獲得治療級(jí)別的種子細(xì)胞，甚至可以進(jìn)一步獲取高表達(dá)PD-L1的ERC細(xì)胞外泌體，從而進(jìn)行腸道IRI的治療。