miRNA-21 靶向調(diào)控Wnt/β-catenin對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖與侵襲的影響

翁克貴 ，王穎，蔣勇

（重慶市腫瘤醫(yī)院腫瘤放射治療中心，重慶 400030）

肺癌是全世界范圍內(nèi)呼吸系統(tǒng)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，在中國(guó)其發(fā)病率和病死率高居所有惡性腫瘤之首，且存在逐年增高的趨勢(shì)，對(duì)人民群眾的生命健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[1,2]。雖然隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)進(jìn)步，針對(duì)肺癌的治療手段越來(lái)越多，如手術(shù)，化療、放療及生物靶向治療等個(gè)體化綜合治療方法，但是肺癌患者尤其是晚期肺癌患者的五年生存率仍然很低[3-5]。微小RNA（microRNA，miRNAs）是一類長(zhǎng)度在18～23個(gè)核苷酸的內(nèi)源性、高度保守的單鏈非編碼小RNA，可以通過(guò)與反義鏈靶基因mRNA的3’-非編碼區(qū)（3’-untranslated region，3’-UTR）結(jié)合，降解mRNA或在轉(zhuǎn)錄后水平抑制其翻譯[6]。通過(guò)在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮作用，miRNAs可以對(duì)反義鏈豐富的靶基因進(jìn)行調(diào)控，從而影響惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。miR-21異常高表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，miR-21在大部分惡性腫瘤如前列腺癌[8]、肝癌[9]、甲狀腺癌[10]、肺癌[11]等惡性腫瘤中異常激活。目前有關(guān)miR-21在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中表達(dá)情況的研究較少，并且作用機(jī)制尚不明確。本研究旨在研究miR-21在NSCLC組織及肺癌細(xì)胞株NCI-H1975細(xì)胞中的表達(dá)情況以及對(duì)肺癌細(xì)胞增殖與清晰能力的影響，并探討其可能的機(jī)制。

材料與方法

1 材料

NSCLC細(xì)胞株NCI-H1975購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢大學(xué)），RPMI-1640無(wú)酚紅細(xì)胞級(jí)培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，特優(yōu)級(jí)胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibico公司。miR-21和陰性對(duì)照（NC）的引物均由廣州銳博生物技術(shù)公司合成，miR-21 mimic序列：5’-GAAAAACGCCCCCUGGCUUGAAA-3’；陰性對(duì)照序列（mimic-NC）：5’- CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA -3’。mirVanaTM miRNA Isolation Kit 提取試劑購(gòu)自美國(guó)Qiagen公司，Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript R T reagent Kit( Perfect Real Time)和實(shí)時(shí)定量試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司，β-catenin靶向siRNA和陰性對(duì)照(NC) siRNA 均委托上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司化學(xué)合成，熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega 公司且熒光素酶報(bào)告基因真核表達(dá)載體質(zhì)粒pmiRGLO靶基因報(bào)告質(zhì)粒及3’-UTR端突變報(bào)告載體均委托美國(guó)Promega公司設(shè)計(jì)合成，Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于武漢潔洋盛生物科技公司，熒光素酶基因報(bào)告載體由Promega 公司合成，單克隆兔抗人β-catenin購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，GAPDH多克隆兔抗人抗體購(gòu)自于武漢博士德生物科技公司，HRP標(biāo)記的二抗購(gòu)于美國(guó)Affinity公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自武漢碧云天生物科技公司，24孔transwell小室（孔徑8 μm）購(gòu)自美國(guó)Beaver公司，人工基質(zhì)膠Matrigel購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。

2 臨床標(biāo)本收集與細(xì)胞培養(yǎng)

36例人NSCLC組織和同一病例癌旁正常肺部組織均取自重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院外科NSCLC患者行肺癌根治術(shù)的手術(shù)切除標(biāo)本。所有納入本項(xiàng)研究的患者均簽署知情同意書且本項(xiàng)目獲得重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)審批許可。從病人身上離體的新鮮組織立即放入液氮中凍存，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求分為兩部分：一部分用于提取組織RNA，另一部分用于提取組織蛋白。

3 雙熒光素酶報(bào)告基性檢測(cè)miR-21對(duì)β-catenin調(diào)控的靶位點(diǎn)

運(yùn)用Mirbase軟件對(duì)miR-21潛在的下游靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，篩選出β-catenin基因的一個(gè)非保守位點(diǎn)的 3’ UTR 端 5’-GAGACCACAUGGUCCUUCUUGAGUU-3’可能是miR-21的作用位點(diǎn)。野生型β-catenin 3’UTR-熒光素酶載體，命名為 β-catenin-Wt。突變型PRKCA 3’UTR-熒光素酶報(bào)告載體，命名為β-catenin-Mut。將熒光素酶報(bào)告載體與miR-21 mimics及對(duì)照mimics-NC序列依據(jù)LipofectamineTM2000的操作指南，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組情況對(duì)各組進(jìn)行共轉(zhuǎn)染NCI-H1975細(xì)胞。處理完畢48h之后，收獲細(xì)胞并參照Promega公司雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書的步驟檢測(cè)已處理細(xì)胞熒光素酶活性，并計(jì)算相對(duì)熒光素酶活性（螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值）。

4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

NCI-H446細(xì)胞培養(yǎng)條件：含10% 胎牛血清的RPMI-1640無(wú)酚紅細(xì)胞級(jí)培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，本研究所有實(shí)驗(yàn)均使用第2～3代且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NSCLC細(xì)胞株NCI-H1975細(xì)胞，依據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書將miR-21-mimic和陰性對(duì)照（NC）轉(zhuǎn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后采用qPCR檢測(cè)miR-21的表達(dá)水平。

5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）

MiR-21及U6的引物由廣州銳博生物科技公司設(shè)計(jì)與合成，β-catenin和GAPDH的引物均由武漢擎科生物技術(shù)公司合成。MiR-21正義鏈序列：5′-TGCGGAGGCGGGGCGCCGCGGG-3′, 反義鏈序列5′- CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；β-catenin：正義鏈 5′- CGCCGCTTCAAGTAATTCAGGAT-3′, 反義鏈5′- GTGCAGGGTCCGAGGTGTCCTA-3′；U6： 正義鏈 5′- GGCTGGTAAGGATGAAGG-3′, 反義鏈 5′-TGGAAGGAGGTCATACGG-3′；GAPDH：正義鏈5′-AGTCCACTGGCGTCTTCA-3′, 反義鏈 5′- GAGTC CTTCCACGATACCAA-3′。各組細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染處理48 h 后，使用mirVanaTM miRNA 提取試劑盒提取miRNA 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用以檢測(cè)microRNA表達(dá)水平；使用Trizol提取細(xì)胞的總RNA，并用TaKaRa公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA 備用，用以檢測(cè)β-catenin和GAPDH基因的表達(dá)水平。實(shí)時(shí)定量PCR上機(jī)程序?yàn)椋?95℃ 預(yù)變性20s；95℃變性10s，55℃延伸20s，70℃退火20s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)qRT-PCR的擴(kuò)增曲線和融解曲線，并根據(jù)2ΔΔCT計(jì)算各組基因 mRNA 表達(dá)量。相對(duì)總RNA的表達(dá)采用GAPDH作為內(nèi)參，相對(duì)miRNA表達(dá)采用U6 snRNA作為內(nèi)參。

6 Western blot檢測(cè)

將已處理好的NCI-H1975細(xì)胞用PBS洗滌3次，隨后加入RIPA裂解液并用細(xì)胞刮刀刮下來(lái)放入1.5ml EP管中冰上裂解30min。隨后于12000r/min離心10min并將蛋白上清液凍存于-20℃。使用5×蛋白上樣緩沖液混勻蛋白上清后于95℃中加熱10min，待其充分變性。12%濃度的SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜并置于5%脫脂牛奶中封閉1 h。封閉結(jié)束后使用TBST洗膜5min×3次，隨后將膜置于多克隆兔抗人β-catenin（濃度1∶1000）和多克隆兔抗人GAPDH（濃度1∶3000）中4℃孵育過(guò)夜。次日，洗膜5min×3次后，置于辣根酶標(biāo)記的羊抗兔IgG中室溫孵育2h。TBST洗膜5min×3次后，采用ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影。應(yīng)用Quantity One軟件分析條帶光密度并作統(tǒng)計(jì)分析。

7 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

取生長(zhǎng)狀態(tài)較好的第3代人NSCLC細(xì)胞株NCI-H1975進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿達(dá)95%以上，使用胰酶消化后，依照6×103/ml的密度均勻種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞處理完成之后，將10μl CCK-8溶液加入到各孔中，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱避光孵育2～4h。隨后使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)條件下檢測(cè)其吸光值(A)，以時(shí)間(d)為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

8 Tranwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

將Matrigel膠 （Matrigel原液與無(wú)血清培養(yǎng)基之比為1∶3）鋪在小室上面，置于37℃培養(yǎng)箱中待用。將人NSCLC細(xì)胞株NCI-H1975在無(wú)血清RMPI-1640含酚紅培養(yǎng)基中饑餓處理4h后，將其消化、重懸。上室加入無(wú)血清細(xì)胞懸液200μl（細(xì)胞量4×105/ml），下室加入含10%FBS的RMPI-1640含酚紅培養(yǎng)基，每孔600μl，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。處理完成后取出小室，用PBS洗滌3次，并用濕棉簽輕柔擦除上室面的細(xì)胞，隨后置于4%多聚甲醛中固定20min。取出室溫下風(fēng)干3～5min，隨后置于結(jié)晶紫染料中染色15min。最后用PBS洗滌3次，并置于倒置顯微鏡下觀察穿過(guò)微孔膜的細(xì)胞數(shù)量，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析均采用Graphpad Prism 6.0軟件完成，計(jì)量數(shù)據(jù)用±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較行單因素方差分析。以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 非小細(xì)胞肺癌患者肺癌組織miR-21表達(dá)增高

采用qRT-PCR對(duì)72例NSCLC患者肺癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁正常肺組織中miR-21表達(dá)水平檢測(cè)顯示，與正常肺組織相比，在NSCLC組織中miR-21的表達(dá)量顯著升高（圖1）。

圖1 正常肺組織和NSCLC組織中miR-21表達(dá)水平qRT-PCR檢測(cè)。**，與正常肺組織比較，P＜0.01Fig.1 qRT-PCR detection for expression level of miR-21 in NSCLC tissue and adjacent normal lung tissue. **, P＜0.01, compared with the normal lung tissue

2 miR-21靶向調(diào)控β-catenin 表達(dá)

通過(guò)使用miRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)miRBase進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)β-catenin可作為miR-21的靶基因。為了驗(yàn)證在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的β-catenin是否為miR-21的目標(biāo)靶基因以及能否和β-catenin的3’UTR端結(jié)合，我們進(jìn)一步將miR-21 mimics或mimics-NC與β-catenin-Wt和β-catenin-Mut螢光素酶載體共轉(zhuǎn)染到人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H1975中，在48h后檢測(cè)雙熒光酶活性。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-21 mimics的NCI-H1975細(xì)胞中，野生型β-catenin-Wt報(bào)告載體的熒光素酶活性顯著升高，與轉(zhuǎn)染mimics-NC組相比上調(diào)64%（P＜0.05）；而miR-21 mimics對(duì)突變型β-catenin-Mut載體的熒光素酶活性無(wú)明顯促進(jìn)作用（圖2）。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析結(jié)果一致，miR-21能和β-catenin的3’UTR 端結(jié)合。

圖2 miR-21作用于β-catenin mRNA 3’ UTR的熒光素酶活性分析。**，與對(duì)照比較，P＜0.01Fig.2 Analysis of luciferase activity for the effect of miR-21 on 3’ UTR of β-catenin mRNA. **, P＜0.01, compared with the control

Western blot和qRT-PCR檢測(cè)顯示：與空白組和mimics-NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-21 mimics后的NCIH1975細(xì)胞的β-catenin mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著增加（圖3）。

圖3 轉(zhuǎn)染miR-21 mimics后對(duì)NCI-H1975細(xì)胞β-catenin mRNA（A）和蛋白（B和C）表達(dá)的影響。**，P＜0.01，與空白對(duì)照和陰性對(duì)照比較Fig.3 Effect of transfecting miR-21 mimics on expression level of β-catenin mRNA (A) and protein (B and C) in NCI-H1975 cells. **, P＜0.01, compared with blank control and negative control

3 上調(diào)miR-21 表達(dá)促進(jìn)NCI-H1975細(xì)胞增殖

CCK-8法分析顯示：miR-21 mimics組NCIH1975細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h的吸光度顯著高于空白對(duì)照組和mimics-NC組細(xì)胞，表明上調(diào)miR-21表達(dá)能夠顯著促進(jìn)NCI-H1975細(xì)胞的增殖能力（圖4）。

4 上調(diào)miR-21表達(dá)促進(jìn)NCI-H1975細(xì)胞的侵襲能力

Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和mimics NC組比較，miR-21 mimics組的細(xì)胞侵襲能力顯著增強(qiáng)（圖5）。

圖4 上調(diào)miR-21 mimic后對(duì)NCI-H1975細(xì)胞增殖能力的影響。*，P＜0.01，與同時(shí)間點(diǎn)的空白對(duì)照和陰性對(duì)照比較Fig.4 Effect of up-regulation of miR-21 mimic on proliferation ability in NCI-H1975 cells. *, P＜0.01, compared with blank control and negative control at the same time point

討 論

肺癌在全球惡性腫瘤中的發(fā)病率和致死率均位居前列，在罹患肺癌的病人中80%為NSCLC，對(duì)人類的生命健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[12,13]。在過(guò)去20年中，我國(guó)NSCLC的發(fā)病率也逐年攀升，肺癌已經(jīng)成為我國(guó)發(fā)病率最高的惡性腫瘤[14]。盡管針對(duì)NSCLC不斷有新的治療方法提出，但仍未改變NSCLC患者術(shù)后5年生存率低于40%的現(xiàn)狀[15,16]。因此，深入研究NSCLC發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制進(jìn)而尋找關(guān)鍵有效的治療靶點(diǎn)，成為目前NSCLC治療的突破點(diǎn)。雖然目前在調(diào)控肺癌相關(guān)基因的研究中已取得一定的進(jìn)展，但這些異常基因的病理生理功能和潛在機(jī)制尚不清楚。

已知在腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的內(nèi)源性非編碼小RNA 分子。miR-21是一個(gè)定位于17p23. 2染色體區(qū)域的且高度保守的單基因編碼miRNA[17-19]。既往研究發(fā)現(xiàn)miR-21 的異常高表達(dá)廣泛存在于各種人類惡性腫瘤當(dāng)中：如胃癌、膀胱癌、口腔癌、腎細(xì)胞癌、肺癌等[20-23]。miR-21與上述惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展緊密關(guān)聯(lián)，可通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、新生血管生成以及遠(yuǎn)處的侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)揮作用。Yanaihara等[24]利用基因芯片篩選人肺小細(xì)胞癌組織的miRNA的差異表達(dá)譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-21呈異常高表達(dá)狀態(tài)。Jiang 等[25]也發(fā)現(xiàn)在不吸煙的肺癌患者中miR-21 表達(dá)量明顯升高。Li等[26]的研究也表明，miR-21 在NSCLC組織中高表達(dá)水平與NSCLC患者TNM 分期以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)。

圖5 上調(diào)miR-21 mimic后對(duì)NCI-H1975細(xì)胞侵襲能力的影響（結(jié)晶紫染色）。A，空白對(duì)照組；B，陰性對(duì)照組；C，miR-21 mimics組；D，侵襲能力統(tǒng)計(jì)分析；**，P＜0.01，與空白對(duì)照和陰性對(duì)照比較Fig.5 Effect of upregulation of miR-21 on invasion ability in NCI-H1975 cells(crystal violet staining). A, blank control; B, negative control; C, miR-21 mimics group; D, statistical analysis for invasion ability; **, P＜0.01, compared with blank control and negative control

在機(jī)體的生命信息網(wǎng)絡(luò)中，一個(gè)miRNA并不是孤立存在的，作為上游因素miRNA可以廣泛調(diào)控下游多個(gè)靶基因，同時(shí)相同靶基因也可收到上游多個(gè)不同miRNA的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)[27]。單一miRNA主要通過(guò)調(diào)控其下游靶基因從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，進(jìn)而影響腫瘤發(fā)展進(jìn)程。Luo等[28]發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，miR-21可通過(guò)激活SOX2和β-catenin信號(hào)通路，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。在APC突變型結(jié)腸癌細(xì)胞中，研究者發(fā)現(xiàn)miR-21能夠促進(jìn)β-catenin基因入核，從而促進(jìn)結(jié)腸癌的惡化以及引起不良預(yù)后[29]。此外，Kawakita等[30]發(fā)現(xiàn)miR-21通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin/ DKK2軸從而促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的遠(yuǎn)處侵襲。但是在人類非小細(xì)胞肺癌中miR-21的作用機(jī)制目前鮮有報(bào)道。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們首先在人NSCLC組織和癌旁臨近正常肺部組織中驗(yàn)證miR-21的表達(dá)水平，結(jié)果表明，與鄰近癌旁組織相比，miR-21在NSCLC組織中呈現(xiàn)異常高表達(dá)。基于我們前期在miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)miRBase中的數(shù)據(jù)分析結(jié)果，接下來(lái)我們驗(yàn)證在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)的β-catenin是否為miR-21的目標(biāo)靶基因，其是否能與β-catenin的3’UTR端結(jié)合。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果證實(shí)miR-21能與β-catenin的3'UTR區(qū)特異性結(jié)合，使熒光蛋白表達(dá)水平顯著升高。為了證實(shí)β-catenin是否為miR-21的下游靶基因，我們進(jìn)一步應(yīng)用qRT PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)β-catenin的mRNA和蛋白表達(dá)的水平在上調(diào)miR-21后也顯著升高。結(jié)合上面雙熒光素酶報(bào)告基因的檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)了β-catenin作為miR-21的下游靶基因，受到其正性調(diào)控。接下來(lái)，人工合成miR-21 mimics 并成功轉(zhuǎn)染NCI-H1975細(xì)胞后能增強(qiáng)細(xì)胞中miR-21 的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-21之后，NCI-H1975細(xì)胞的增殖與侵襲能力均顯著增強(qiáng)。

綜上所述，本項(xiàng)研究初步證實(shí)在人NSCLC組織中存在miR-21的異常高表達(dá)，且在NCI-H1975細(xì)胞中上調(diào)miR-21能夠通過(guò)激活其下游靶基因Wnt/β-catenin并促進(jìn)細(xì)胞的增殖于侵襲能力。這一研究發(fā)現(xiàn)表明miR-21有望作為NSCLC的潛在治療靶點(diǎn)，這將為人類NSCLC的特異性靶向治療的提供新的思路和依據(jù)。