補腎活血湯對子宮內膜異位癥大鼠Nrf2/Keap1通路的調節(jié)作用研究*

李振華，李姣，張健

（1．郴州市第一人民醫(yī)院中醫(yī)婦科，郴州 423000；2．湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中醫(yī)婦科，長沙 430000）

子宮內膜異位癥作為一種常見的婦科疾病，好發(fā)于育齡婦女，并會引發(fā)痛經及不孕等多種并發(fā)癥，臨床中使用孕激素類及卵巢功能抑制劑進行治療，但由于用藥療程過長且不良反應較多，所以在臨床應用中效果并不理想。同時，除根治性手術外，其余藥物治療及手術治療的方法均有較高的復發(fā)風險，所以對于子宮內膜異位癥藥物的研發(fā)亟待解決[1-3]。補腎活血湯作為一種傳統(tǒng)的中藥成方制劑，其被用于治療損傷后期肝腎虛弱之癥，因其具有通絡止痛活血之功效，現代醫(yī)學眾多學者開始探究其在子宮內膜異位癥治療中的作用，并隨著研究的深入，眾多學者報道了補腎活血湯在子宮內膜異位癥臨床應用中均表現出顯著療效[4-5]。Nrf2/Keap1通路是與炎癥損傷及氧化應激過程密切相關的重要通路，近年來研究證實Nrf2/Keap1通路相關蛋白水平異常，在子宮內膜異位癥的發(fā)病機制中的起到關鍵作用[6-7]。Marcelli等[8]研究發(fā)現，Nrf2水平的升高會導致子宮內膜異位癥的發(fā)生及進展；Kapoor等[9]研究表明，Nrf2水平的升高及Keap1水平降低均會導致子宮內膜異位癥的進一步加重。本文通過研究補腎活血湯對子宮內膜異位癥大鼠Nrf2/Keap1通路的調節(jié)作用，為補腎活血湯在子宮內膜異位癥中的藥理機制研究提供依據。

1 材料

1.1 實驗動物 SD大鼠90只，雌性，8周齡，體質量200～220 g，SPF級，購自蘭州大學實驗動物中心[許可證號：SCXK（甘）2018-0002]。

1.2 藥品與試劑 補腎活血湯（由熟地黃10 g，補骨脂10 g，菟絲子10 g，杜仲3 g，枸杞子3 g，當歸尾3 g，山萸肉 3 g，肉蓯蓉 3 g，沒藥 3 g，獨活 3 g，紅花2 g組成）藥材飲片購自北京同仁堂藥業(yè)，由藥材飲片制成生藥含量為1 g/mL的制劑。達那唑（批號：201812161）購自杭州民生藥業(yè)有限公司；大鼠雌二醇（E2）ELISA 檢測試劑盒（貨號：CSB-E05110r-1）購自上海恒斐生物公司；大鼠CA125ELISA試劑盒（貨號：ER0788）購自武漢菲恩生物科技有限公司；組織蛋白裂解液（貨號：ZY-14497）購自上海澤葉生物公司；Nrf2、Keap1兔多克隆抗體（貨號：PA5-27882、PA5-99434）購自賽默飛世爾科技公司；cDNA合成試劑盒（貨號：D7168）、總RNA提取試劑盒（貨號：R0016）、GAPDH 兔單克隆抗體（貨號：AF1186）、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體（貨號：A0208）購自碧云天生物科技有限公司；熒光定量PCR試劑盒（貨號：JKG039）購自上海經科化學科技有限公司；BCA蛋白法含量測試盒（貨號：BCAP-1-W）購自北京康佳宏原生物科技有限公司；大鼠白介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒（貨號：EK0412）購自美國Sciencell公司；大鼠白介素-8（IL-8）ELISA 試劑盒（貨號：YS03585B）購自美國GTX公司；前列腺素F-2α（PGF-2α）ELISA 試劑盒（貨號：GD-AW1766）購自上海古朵生物科技公司。

1.3 主要儀器 GIS-500凝膠成像儀（杭州米歐儀器公司）；Allegra X-15R臺式冷凍離心機（貝克曼庫爾特商貿有限公司）；IX71-F22FL/PH熒光倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；LUMIstar Omega酶標儀（德國BMG公司）；HM355S石蠟切片機（日本亞速旺公司）；BE6085電泳槽（柏奧易杰科技有限公司）。

2 方法

2.1 建立子宮內膜異位癥模型大鼠并給藥 90只大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為假手術組、模型組、補腎活血湯低、中、高劑量組及達那唑組，15只/組，參照文獻[10-12]方法采用自體子宮內膜移植法建立子宮內膜異位癥模型大鼠，先使用0．5 mg/kg的戊酸雌二醇使大鼠動情，然后將大鼠麻醉，開腹，分離左側部分子宮，并將子宮內膜縫合至右側腹壁，關腹縫合，術后使用青霉素預防感染，假手術組只開腹不進行子宮內膜移植等操作。補腎活血湯低、中、高劑量組按照 2．5、5、10 g/kg 灌胃給予補腎活血湯[13-14]，達那唑組給予達那唑（0．02 g/kg）[12]，假手術組及模型組給予生理鹽水；1次/日，連續(xù)干預4周[8]。

2.2 血清E2、CA125的測定 大鼠取血清，使用E2、CA125 ELISA試劑盒測定各組大鼠血清E2、CA125水平。

2.3 腹腔灌洗液IL-6、IL-8、PGF-2α的測定 末次給藥24 h后將大鼠麻醉，開腹，使用蒸餾水灌洗并收集腹腔液，采用 IL-6、IL-8、PGF-2α ELISA 試劑盒測定大鼠腹腔灌洗液IL-6、IL-8、PGF-2α水平。

2.4 HE染色 取大鼠異位子宮組織（假手術組取在位子宮組織）在中性甲醛中固定后石蠟包埋，切成4 μm厚的切片，行HE染色，在200倍顯微鏡下采用盲法觀察子宮內膜組織病理學特征。

2.5 實時PCR檢測Nrf2、Keap1mRNA 大鼠處死并分離異位子宮組織（對照組取在位子宮組織）200 mg，使用試劑盒提取RNA，使用逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA，按照試劑盒方法檢測Nrf2、Keap1 mRNA 水平，以 GAPDH 為內參，采用 2-ΔΔCt法計算表達量，引物序列為Nrf2：Forward：GGTGCCTATG TCTCAGCCTCTT，Reverse：GCCATAGAACTGATGA GAGGGAG；Keap1：Forward：GGCATTTGGAGAAA GCAGTAGTC，Reverse：AGTGGAACGCATCCAAGTC GGC；GAPDH：Forward：GACTACAGGCATTGTGGAG ACC，Reverse：GGTCGTAATCACTGAGAGCCAC。

2.6 Westrn blot取大鼠異位子宮組織（對照組取在位子宮組織）加入裂解液研磨，離心取上清液，水浴煮沸變性并進行總蛋白定量，取適量蛋白進行電泳分離、轉膜、封閉，使用1∶500倍稀釋后的Nrf2、Keap1抗體孵育，再使用山羊抗兔IgG抗體孵育，最后使用凝膠成像系統(tǒng)，以GAPDH為內參，使用Image J軟件對組織內Nrf2、Keap1水平定量分析。

2.7 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 20．0進行統(tǒng)計學分析，數據以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 補腎活血湯對子宮內膜異位癥大鼠血清E2、CA125的影響 補腎活血湯對子宮內膜異位癥大鼠血清E2、CA125的影響見表1。結果表明，與假手術組大鼠相比，模型組大鼠血清E2、CA125水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；與模型組子宮內膜異位癥大鼠相比，補腎活血湯低、中、高劑量組及達那唑組大鼠血清E2、CA125水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），且大鼠血清 E2、CA125 水平隨著補腎活血湯劑量的增加而降低。

表1 大鼠血清E2、CA125水平（±s）Tab.1 Serum E2 and CA125 levels of rats（±s）

表1 大鼠血清E2、CA125水平（±s）Tab.1 Serum E2 and CA125 levels of rats（±s）

注：與假手術組相比，*P＜0．05；與模型組相比，#P＜0．05；與補腎活血湯低劑量組相比，△P＜0．05；與補腎活血湯中劑量組相比，▲P＜0．05。

組別 E2（pg/mL） CA125（U/mL）假手術組 43．91±2．15 7．08±0．31模型組 92．91±1．64* 15．96±0．43*補腎活血湯低劑量組 73．01±2．72# 10．82±0．35#補腎活血湯中劑量組 66．55±1．33#△ 8．77±0．23#△補腎活血湯高劑量組 52．77±1．86#△▲ 7．67±0．30#△▲達那唑組 48．17±1．98# 7．36±0．27#

3.2 補腎活血湯對子宮內膜異位癥大鼠腹腔IL-6、IL-8、PGF-2α的影響 補腎活血湯對子宮內膜異位癥大鼠腹腔IL-6、IL-8、PGF-2α的影響見表2。結果表明，與假手術組大鼠相比，模型組大鼠腹腔IL-6、IL-8、PGF-2α 水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；與模型組子宮內膜異位癥大鼠相比，補腎活血湯低、中、高劑量組及達那唑組大鼠腹腔IL-6、IL-8、PGF-2α 水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），隨著補腎活血湯劑量的增加，大鼠腹腔IL-6、IL-8、PGF-2α水平逐漸降低。

表2 大鼠腹腔 IL-6、IL-8、PGF-2α 水平（±s）Tab.2 Levels of IL-6，IL-8 and PGF-2α in the abdominal cavity of rats（±s）

表2 大鼠腹腔 IL-6、IL-8、PGF-2α 水平（±s）Tab.2 Levels of IL-6，IL-8 and PGF-2α in the abdominal cavity of rats（±s）

注：與假手術組相比，*P＜0．05；與模型組相比，#P＜0．05；與補腎活血湯低劑量組相比，△P＜0．05；與補腎活血湯中劑量組相比，▲P＜0．05。

組別 IL-6（pg/mL） IL-8（pg/mL） PGF-2α（mg/mL）假手術組 51．75±3．43 128．01±3．71 418．25±21．81模型組 167．48±4．01* 258．54±2．74* 689．12±38．24*補腎活血湯低劑量組 102．11±2．81# 203．95±2．69# 592．79±34．51#補腎活血湯中劑量組 78．76±2．28#△ 181．36±3．35#△ 501．84±24．54#△補腎活血湯高劑量組 62．17±3．23#△▲ 146．51±3．75#△▲ 434．19±27．36#△▲達那唑組 64．71±2．51# 139．20±2．81# 466．29±29．94#

3.3 補腎活血湯對子宮內膜異位癥大鼠病理學的影響 大鼠子宮內膜組織病理學檢查結果如圖1所示，結果表明，假手術組大鼠在位內膜上皮細胞呈柱狀，無明顯病理性改變；模型組子宮內膜異位癥大鼠異位內膜增厚，腺上皮和淺上皮形成高柱，可見明顯的增生；補腎活血湯各劑量組及達那唑組大鼠異位內膜增厚減輕，柱狀結構接近正常，腺體和腺上皮細胞數量接近正常。

圖1 大鼠子宮內膜病理學檢查（HE，×200）Fig.1 Pathological examination of rat endometrium（HE，×200）

3.4 補腎活血湯對子宮內膜異位癥大鼠Nrf2、Keap1mRNA水平的影響 補腎活血湯對子宮內膜異位癥大鼠Nrf2、Keap1mRNA的影響見表3。結果表明，與假手術組相比，模型組大鼠異位子宮內膜組織Nrf2 mRNA水平升高，Keap1mRNA水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；與模型組子宮內膜異位癥大鼠相比，補腎活血湯低、中、高劑量組大鼠子宮內膜組織Nrf2 mRNA水平降低，Keap1 mRNA水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。

表3 大鼠 Nrf2、Keap1 mRNA 水平（±s）Tab.3 Nrf2 and Keap1 mRNA levels in rats（±s）

表3 大鼠 Nrf2、Keap1 mRNA 水平（±s）Tab.3 Nrf2 and Keap1 mRNA levels in rats（±s）

注：與假手術組相比，*P＜0．05；與模型組相比，#P＜0．05；與補腎活血湯低劑量組相比，△P＜0．05；與補腎活血湯中劑量組相比，▲P＜0．05。

組別 Nrf2 mRNA Keap1 mRNA假手術組 1．31±0．06 5．54±0．12模型組 7．86±0．12* 0．61±0．08*補腎活血湯低劑量組 4．93±0．26# 1．33±0．05#補腎活血湯中劑量組 3．36±0．09#△ 2．41±0．26#△補腎活血湯高劑量組 1．79±0．15#△▲ 4．72±0．17#△▲達那唑組 2．04±0．13# 3．79±0．32#

3.5 補腎活血湯對子宮內膜異位癥大鼠Nrf2、Keap1水平的影響 補腎活血湯對子宮內膜異位癥大鼠Nrf2、Keap1水平的影響見圖2。結果表明，與假手術組大鼠相比，模型組大鼠異位子宮內膜Nrf2水平升高，Keap1 水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；與模型組子宮內膜異位癥大鼠相比，補腎活血湯低、中、高劑量組大鼠子宮內膜組織Nrf2水平降低，Keap1 水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。

圖2 補腎活血湯對子宮內膜異位癥大鼠Nrf2、Keap1水平的影響Fig.2 Effects of Bushen Huoxue decoction on Nrf2 and Keap1 levels in endometriosis rats

4 討論

子宮內膜異位癥是臨床中常見的女性婦科疾病，臨床表現為痛經、月經異常、不孕等癥狀，其發(fā)病機制與女性經血逆流、性激素及炎癥刺激、免疫缺陷、遺傳等因素有關[15]。中醫(yī)學認為子宮內膜異位癥與女性經絡氣血壅滯不通，臟腑氣血運行失常，聚集與盆腔留滯胞絡；又由于外邪內生，正氣耗損，邪氣藏于體內，久聚不散，若遇到情志失調、勞思傷神，則邪氣伺機而出；此外，正氣不足加之衛(wèi)外不固，外感風寒、血液黏滯、痰濕氣短等病癥均為誘因。所以，對于子宮內膜異位癥的治療中醫(yī)學強調活血化瘀、補正益氣、通絡止痛是關鍵。

補腎活血湯出自中國古代醫(yī)學著作《傷科大成》，由熟地黃、菟絲子、杜仲等藥材組成，有活血止痛之功效，用于治療肝腎虛弱等病癥。中醫(yī)理論認為，肝腎虧損則導致筋骨失養(yǎng)，進而引起血行瘀滯，經脈不暢，使用補益肝腎之藥材，則起到活血通絡止痛的功效。補腎活血湯中熟地黃、杜仲、補骨脂等藥材起到滋陰補血，補精益腎，陰陽調和之功效，當歸尾來源于中藥材當歸尾部，有活血祛瘀之功效，對經閉不通有奇效，沒藥散瘀消腫，去痛生肌，獨活通痹止痛，除風祛濕，紅花活血通經，散瘀止痛的作用，對于閉經、通經等癥狀有顯著療效，諸藥合用，標本兼治，驅邪扶正，起到通絡活血的功效。現代醫(yī)學研究表明[16-17]，補腎活血湯對于子宮內膜異位癥有一定的治療作用，補腎活血湯在治療子宮內膜異位癥的臨床應用中，劉凱麗等[18]研究發(fā)現補腎活血湯能夠調節(jié)子宮內膜厚度，改善子宮動脈血流動力學參數及子宮內膜的容受性；湯麗婷[19]通過臨床回顧性研究報道，補腎活血湯對子宮內膜異位癥引起的不孕癥患者最大卵泡直徑、內膜囊腫體積等均有明顯改善作用，可見補腎活血湯對于子宮內膜異位癥的治療表現出巨大潛力。

研究發(fā)現[20-21]，在子宮內膜異位癥患者體內，E2及CA125水平顯著升高，并提示E2及CA125能夠促進子宮內膜異位癥的疾病進展，影響預后；IL-6及IL-8是體內重要的炎癥因子，機體細胞受到各種刺激信號時，體內IL-6及IL-8水平明顯升高并促進體內炎癥水平的進展加重[22]，PGF-2α則能夠起到放大疼痛信號并誘導炎癥進一步加劇[21]，在子宮內膜異位癥患者及動物模型腹腔液中均提示IL-6、IL-8及PGF-2α水平的升高。本實驗結果表明，與模型組大鼠相比，補腎活血湯各劑量組大鼠血清E2、CA125水平及腹腔灌洗液IL-6、IL-8及PGF-2α水平隨著補腎活血湯劑量的增加而逐漸降低，這提示補腎活血湯能夠呈劑量依賴性的降低子宮內膜異位癥大鼠腹腔炎癥水平并抑制子宮內膜異位癥進一步惡化進展。

Nrf2能夠通過調節(jié)抗氧化蛋白和II相解毒酶的表達，進而參與細胞氧化應激反應，Keap1與肌動蛋白結合存在細胞漿中，并能夠與Nrf2在細胞質中的結合以復合物的形式存在[23]。在氧化應激條件下，Keap1被氧化，進而使Keap1-Nrf2復合物的穩(wěn)定狀態(tài)被破壞，促進細胞Nrf2水平的升高，激活下游與細胞周期、增殖等生理活動相關的蛋白通路，促進細胞的存活[24]。有研究表明[25-28]，Nrf2能夠參與細胞中嘌呤合成的合成過程，誘導葡萄糖和谷氨酰胺進入合成代謝途徑，進而促進細胞增殖，同時Nrf2水平的升高能夠保護細胞免受氧化應激損傷，進而加速了子宮內膜異位癥的疾病進展。本實驗結果表明，給予子宮內膜異位癥大鼠不同劑量的補腎活血湯后，與模型組大鼠相比較，補腎活血湯各劑量組大鼠異位子宮組織內Nrf2 mRNA及蛋白水平降低，而Keap1mRNA及蛋白水平升高，且與補腎活血湯的劑量表現出依賴性，提示補腎活血湯能夠通過調節(jié)子宮內膜異位癥大鼠體內Nrf2/Keap1通路相關蛋白水平，進而發(fā)揮對子宮內膜異位癥大鼠體內炎癥水平的抑制作用及病理改變的修復作用。同時，由于時間及實驗條件的限制，本實驗未能進一步研究補腎活血湯對子宮內膜異位癥大鼠Nrf2/Keap1通路下游相關通路的調節(jié)作用，本課題擬在今后研究中對上述問題做深入探討。

綜上所述，補腎活血湯能夠降低大鼠血清雌二醇及CA125水平，緩解子宮內膜異位癥大鼠腹腔炎癥水平，其機制可能與調節(jié)Nrf2/Keap1通路有關。