大蒜素對丙泊酚麻醉所致老年大鼠認知功能障礙的影響*

魏紅芳，王飛，楊曉彬，苑進革，王瑞，李斐，陳永學

（邯鄲市中心醫(yī)院，邯鄲 056000）

認知功能障礙是老年患者較為常見的術(shù)后并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為記憶力減退、學習能力下降、注意力不集中等，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，麻醉藥抑制中樞膽堿能系統(tǒng)所致海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷是其主要病理機制[1-2]。丙泊酚具有起效快、誘導期短、蘇醒快的特點，是臨床上常用的靜脈麻醉藥，但研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚能夠引發(fā)氧化應激、炎癥反應及海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡而影響認知功能障礙[3-6]。

大蒜素（Allicin）是由大蒜鱗莖中提取的一種有機硫化合物，化學名為二烯丙基三硫化物，具有廣泛的生物活性，有研究發(fā)現(xiàn)大蒜素能夠通過抑制細胞凋亡、炎癥和氧化應激損傷對感染性休克、腦缺血再灌注及鉛中毒大鼠海馬神經(jīng)元起到保護作用[7-9]；并且大蒜素能夠通過抑制氧化應激和炎癥反應改善阿爾茨海默病小鼠模型、血管性癡呆大鼠模型認知功能[10-11]，但大蒜素是否對丙泊酚麻醉所致認知功能障礙具有改善作用尚未見文獻報道。本實驗旨在研究大蒜素對丙泊酚麻醉所致老年大鼠認知功能障礙的影響及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 120只無特定病源體級老年雄性SD大鼠，20月齡，體質(zhì)量550～610 g，購自河北省實驗動物中心[SYXK（冀）2018-004]；清潔環(huán)境分籠飼養(yǎng)1周后開展實驗[12 h光照黑暗交替、室溫（25±1）℃、相對濕度（60±5）%]，自由飲水進食。按照隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常對照組、模型組、吡拉西坦組（500 mg/kg）[12]和大蒜素低、中、高劑量組（5、10、20 mg/kg），每組 20 只。

1.2 實驗藥物與試劑 大蒜素注射液購自上海禾風制藥有限公司（批號：4E38011）；吡拉西坦注射液購自徐州萊恩藥業(yè)有限公司（批號：2001014）；丙泊酚購自西安力邦制藥有限公司（批號：201908006）。原位末端標記法（TUNEL）試劑盒和超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號：200113、191207、191125、200108）；酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司（批號：SEKR-0009、SEKR-0002、SEKR-0005）；核因子 E2 相關因子 2（Nrf2）、抗血紅素加氧酶-1（HO-1）、核因子-κB（NF-κB）、β-actin抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司（批號：bs-1074R、bs-23667R、bs-20355R、bs-0061R）；ECL超敏化學發(fā)光液購自美國Thermo Fisher Scientific公司（批號：EB191104）。

1.3 主要儀器 DMS-2型Morris水迷宮及視頻分析系統(tǒng)（中國醫(yī)學科學院藥物研究所）；RM2125型石蠟切片機（德國Leica公司）；SZ-1型組織勻漿器（江蘇金壇市晶玻實驗儀器廠）；UV2100型紫外-可見分光光度計（北京瑞利分析儀器有限公司）；CS-15R型低溫離心機（美國Beckman公司）；Model 680型酶標儀（美國Bio-Rad公司）；CKX41型倒置光學顯微鏡（日本Olympus公司）；SE300型電泳儀、TE22型轉(zhuǎn)膜儀（美國Hoefer公司）；Chem Doc XRS型凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 模型制備與給藥 正常對照組大鼠腹腔注射生理鹽水，其余各組大鼠均100 mg/kg腹腔注射丙泊酚實施麻醉造模[13]；待麻醉后各組大鼠分別腹腔注射給予相應藥物（正常對照組和模型組給予生理鹽水），每日1次，共7 d。

1.4.2 Morris水迷宮實驗評測學習記憶能力 Morris水迷宮平臺固定于第3象限，水溫設置為（25±1）℃。給藥治療完成后，各組隨機選取10只大鼠，充分適應游泳環(huán)境以減少應激反應，并誘導大鼠找到位于第3象限的平臺。1）定位航行實驗：于治療完成后第2 d開始連續(xù)檢測4 d。每日將每只大鼠分別從第1、2、4象限固定入水點頭朝器壁方向放入水中，記錄每只大鼠找到平臺的時間（若120 s時間內(nèi)未能找到平臺則按120 s計算），各組大鼠取平均值，即逃避潛伏期；2）空間探索實驗：待定位航行實驗完成后，撤除第3象限平臺，每只大鼠于第1象限固定點頭朝器壁方向放入水中，記錄120 s時間內(nèi)穿越平臺次數(shù)。逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)能夠分別代表認知能力中的學習能力和記憶能力。

1.4.3 蘇木精-尹紅（HE）染色法行海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病理學檢查 給藥治療完成后，各組隨機選取10只大鼠，頸椎脫臼處死后取腦組織，去除小腦、腦干后置4%多聚甲醛溶液中固定72 h，浸石蠟包埋、切片（厚度約5 μm）和展片后，二甲苯脫蠟、梯度乙醇水洗后行HE染色（蘇木精染色10 min、水洗后0.5%鹽酸乙醇分化3 s、0.5%尹紅乙醇染色1 min、80%乙醇分化3 s），梯度乙醇脫水、二甲苯透明后中性樹膠封片，通過光學顯微鏡觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病理學變化。

1.4.4 TUNEL染色法行神經(jīng)元凋亡檢查 取腦組織石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水洗后，按照TUNEL試劑盒操作說明行TUNEL染色，經(jīng)脫水處理后50%甘油封片，然后通過倒置光學顯微鏡觀察，細胞核黃褐色為陽性著色（凋亡細胞）。凋亡指數(shù)（AI）的計算：每只大鼠腦組織TUNEL染色切片均選取5張，每張切片隨機取5個不重疊視野，計數(shù)視野內(nèi)凋亡細胞數(shù)和細胞總數(shù)，AI（%）=（凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)）×100%。

1.4.5 海馬組織SOD、CAT活性和MDA含量檢測 分別取各組剩余的10只大鼠，頸椎脫臼處死后取大腦、冰上剝離海馬組織，剪碎、加入適量4℃冷裂解液后勻漿處理，4℃離心（離心半徑10 cm、轉(zhuǎn)速3 500 rpm、時間10 min）取上清液，采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性、高錳酸鉀滴定法測定CAT活性、硫代巴比妥酸法測定MDA含量。

1.4.6 海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量檢測 取“1.4.5”制備的組織勻漿液，4℃離心（離心半徑10cm、轉(zhuǎn)速3 500 rpm、時間10 min）取上清液，按照ELISA試劑盒操作方法處理，通過酶標儀檢測TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

1.4.7 海馬組織Nrf2、HO-1、NF-κB蛋白表達檢測取“1.4.5”制備的組織勻漿液，經(jīng)4℃離心（離心半徑10 cm、轉(zhuǎn)速 12 000 rpm，時間 20 min）取沉淀，采用BCA法檢測總蛋白濃度，10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白、濕法轉(zhuǎn)PVDF膜、5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，滴加一抗（Nrf2、HO-1、NF-κB、β-actin）后4℃孵育過夜，洗膜后滴加二抗37℃孵育1 h，洗膜后滴加ECL顯色，然后以β-actin為內(nèi)參半定量Nrf2、HO-1、NF-κB蛋白表達。

1.5 統(tǒng)計學處理 運用SPSS 20．0軟件進行統(tǒng)計處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠學習記憶能力比較 與正常對照組比較，給藥結(jié)束后第2～5天模型組大鼠逃逸潛伏期延長且穿越平臺次數(shù)減少（P＜0．01）；與模型組比較，給藥結(jié)束后第2～5天吡拉西坦組和大蒜素中、高劑量組逃逸潛伏期縮短、穿越平臺次數(shù)增加（P＜0．05或P＜0．01）；與吡拉西坦組比較，給藥結(jié)束后第 3～5 天大蒜素高劑量組逃逸潛伏期縮短、穿越平臺次數(shù)增加（P＜0．05）。見圖1和表1。

圖1 各組大鼠定位巡航實驗軌跡Fig.1 Locate cruise experimental track of rats in each group

表1 各組大鼠學習記憶能力評測結(jié)果（±s）Tab.1 Evaluation results of learning and memory ability of rats in each group（±s）

表1 各組大鼠學習記憶能力評測結(jié)果（±s）Tab.1 Evaluation results of learning and memory ability of rats in each group（±s）

注：與正常對照組比較，**P＜0．01；與模型組比較，△P＜0．05，△△P＜0．01；與吡拉西坦組比較，▲P＜0．05。

組別正常對照組模型組吡拉西坦組大蒜素低劑量組大蒜素中劑量組大蒜素高劑量組動物數(shù)10 10 10 10 10 10逃逸潛伏期（s） 穿越平臺次數(shù)（次）第2天 第3天 第4天 第5天53．64±5．80 42．37±5．05 34．96±4．01 25．69±2．74 6．78±1．12 61．75±5．94** 54．06±5．23** 45．28±4．35** 36．11±4．20** 4．09±0．73**56．19±5．62△ 49．37±5．04△ 36．43±3．70△△ 30．85±3．16△△ 5．02±0．84△59．64±6．03 51．28±5．13 41．95±4．08 34．72±4．01 4．76±0．82 55．87±5．40△ 48．16±4．95△ 37．29±3．83△△ 29．68±3．75△△ 4．93±0．87△51．36±5．27△△ 43．69±4．71△△▲ 32．42±3．15△△▲ 27．34±2．86△△▲ 5．85±0．91△△▲

2.2 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病變比較 正常對照組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)未見異常；模型組呈現(xiàn)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量減少、排列疏松無序，胞膜、核膜邊界不清，胞核固縮深染等病理學改變；與模型組比較，吡拉西坦組和大蒜素中、高劑量組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)病理性改變明顯改善，其中大蒜素高劑量組效果優(yōu)于其他組。見圖2。

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病變（HE，×400）Fig.2 Neuronal pathological changes in hippocampal CA1 area of rats in each group(HE，×400)

2.3 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡狀況比較 正常對照組大鼠海馬CA1區(qū)僅可見極少量凋亡神經(jīng)元；與正常對照組比較，模型組海馬CA1區(qū)凋亡神經(jīng)元數(shù)量明顯增多，AI顯著升高（P＜0．01）；與模型組比較，吡拉西坦組和大蒜素低、中、高劑量組海馬CA1區(qū)凋亡神經(jīng)元數(shù)量不同程度減少，吡拉西坦組和大蒜素中、高劑量組AI顯著降低（P＜0．05或P＜0．01）；與吡拉西坦組比較，大蒜素高劑量組AI顯著降低（P＜0．01）。見圖3和表2。

圖3 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡狀況（TUNEL，×400）Fig.3 Neuronal apoptosis in CA1 area of hippocampus of rats in each group(TUNEL，×400)

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元AI（±s）Tab.2 The AI of neurons in hippocampal CA1 area of rats in each（±s）

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元AI（±s）Tab.2 The AI of neurons in hippocampal CA1 area of rats in each（±s）

注：與正常對照組比較，**P＜0．01；與模型組比較，△P＜0．05，△△P＜0．01；與吡拉西坦組比較，▲▲P＜0．01

組別動物數(shù)AI（%）正常對照組 10 1．97±0．36模型組 10 35．92±5．14**吡拉西坦組 10 17．58±3．26△△大蒜素低劑量組 10 31．42±4．58大蒜素中劑量組 10 29．76±4．55△大蒜素高劑量組 10 13．61±2．57△△▲▲

2.4 各組大鼠海馬組織SOD、CAT活性和MDA含量比較 與正常對照組比較，模型組大鼠海馬組織SOD、CAT 活性降低而 MDA 含量升高（P＜0．01）；與模型組比較，吡拉西坦組和大蒜素中、高劑量組SOD、CAT 活性升高且 MDA 含量降低（P＜0．01）；與吡拉西坦組比較，大蒜素高劑量組SOD活性升高、MDA 含量降低（P＜0．05 或 P＜0．01）。見表3。

表3 各組大鼠海馬組織SOD、CAT活性和MDA含量（±s）Tab.3 The activity SOD，CAT and content of MDA in hippocampus of rats in each group（±s）

表3 各組大鼠海馬組織SOD、CAT活性和MDA含量（±s）Tab.3 The activity SOD，CAT and content of MDA in hippocampus of rats in each group（±s）

注：與正常對照組比較，**P＜0．01；與模型組比較，△△P＜0．01；與吡拉西坦組比較，▲P＜0．05，▲▲P＜0．01。

組別正常對照組模型組吡拉西坦組大蒜素低劑量組大蒜素中劑量組大蒜素高劑量組動物數(shù)10 10 10 10 10 10 SOD（U/mg） CAT（U/mg） MDA（nmol/mg）2．71±0．33 54．79±6．56 7．18±1．34 1．39±0．17** 41．80±4．58** 27．64±3．72**1．76±0．21△△ 51．07±5．81△△ 16．27±3．15△△1．53±0．20 46．12±5．30 25．26±3．68 1．87±0．24△△ 49．35±5．63△△ 19．79±3．22△△2．09±0．26△△▲▲ 52．11±6．17△△ 13．51±2．70△△▲

2.5 各組大鼠海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較 與正常對照組比較，模型組大鼠海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-6 含量升高（P＜0．01）；與模型組比較，吡拉西坦組和大蒜素中、高劑量組TNF-α、IL-1β、IL-6 含量降低（P＜0．01）；與吡拉西坦組比較，大蒜素高劑量組 TNF-α 含量降低（P＜0．01）。見表4。

表4 各組大鼠海馬組織 TNF-α、IL-1β、IL-6 含量（±s）Tab.4 The content of TNF-α，IL-1β，IL-6 in hippocampus of rats in each group（±s） （pg/mL）

表4 各組大鼠海馬組織 TNF-α、IL-1β、IL-6 含量（±s）Tab.4 The content of TNF-α，IL-1β，IL-6 in hippocampus of rats in each group（±s） （pg/mL）

注：與正常對照組比較，**P＜0．01；與模型組比較，△△P＜0．01；與吡拉西坦組比較，▲▲P＜0．01。

正常對照組模型組吡拉西坦組大蒜素低劑量組大蒜素中劑量組大蒜素高劑量組10 10 10 10 10 10 495．12± 54．17 29．10±3．74 42．87±5．32 1 116．03±132．16** 50．24±6．28** 97．65±9．91**672．71± 85．04△△ 36．70±4．31△△ 59．04±5．71△△1 019．75±130．24 45．62±5．53 89．51±9．20 766．41± 98．73△△ 39．74±4．79△△ 68．25±7．38△△493．82± 56．25△△▲▲ 34．83±4．12△△ 51．37±4．92△△▲▲

2.6 各組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、NF-κB蛋白表達比較 與正常對照組比較，模型組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1 表達下調(diào)而 NF-κB 表達上調(diào)（P＜0．01）；與模型組比較，吡拉西坦組和大蒜素中、高劑量組Nrf2、HO-1 表達上調(diào)且 NF-κB 表達下調(diào)（P＜0．01）；與吡拉西坦組比較，大蒜素高劑量組Nrf2、HO-1表達上調(diào)且 NF-κB 表達下調(diào)（P＜0．05 或 P＜0．01）。見圖4和表5。

圖4 各組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、NF-κB蛋白表達Fig.4 Expression of Nrf2，HO-1，NF-κB protein in hippocampus of rats in each group

表5 各組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、NF-κB蛋白相對表達量（±s）Tab.5 The relative expression of Nrf2，HO-1，NF-κB protein in hippocampus of rats in each group（±s）

表5 各組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1、NF-κB蛋白相對表達量（±s）Tab.5 The relative expression of Nrf2，HO-1，NF-κB protein in hippocampus of rats in each group（±s）

注：與正常對照組比較，**P＜0．01；與模型組比較，△△P＜0．01；與吡拉西坦組比較，▲P＜0．05，▲▲P＜0．01。

組別正常對照組模型組吡拉西坦組大蒜素低劑量組大蒜素中劑量組大蒜素高劑量組動物數(shù)10 10 10 10 10 10 Nrf2/β-actin HO-1/β-actin NF-κB/β-actin 0．83±0．17 0．47±0．11 0．25±0．04 0．19±0．04** 0．11±0．03** 0．58±0．16**0．37±0．08△△ 0．35±0．07△△ 0．29±0．05△△0．21±0．05 0．14±0．04 0．56±0．16 0．46±0．10△△ 0．28±0．05△△ 0．40±0．11△△0．74±0．15△△▲▲ 0．43±0．08△△▲ 0．18±0．04△△▲▲

3 討論

術(shù)后認知功能障礙是丙泊酚麻醉的重要并發(fā)癥，其中以老年患者居多，發(fā)病率高達6%，給患者帶來沉重的心理和經(jīng)濟負擔。海馬CA1區(qū)是與認知功能關系最為密切的腦區(qū)，病理生理學研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后認知功能障礙與麻醉藥抑制中樞膽堿能系統(tǒng)所致海馬CA1區(qū)氧化應激、炎癥反應及海馬神經(jīng)元凋亡相關[14-16]，這也為藥物開發(fā)提供了靶點。

大蒜素是天然存在于百合科蔥屬植物大蒜鱗莖中的一種二烯丙基三硫化物，具有良好的抗炎、抗氧化、抗凋亡等生理活性。本研究通過制備丙泊酚麻醉所致老年大鼠認知功能障礙模型，Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示，經(jīng)大蒜素治療能夠有效提高認知功能障礙大鼠的學習記憶能力，改善海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病變并降低CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡，提示大蒜素對丙泊酚麻醉所致老年大鼠認知功能障礙具有改善作用，其機制可能與降低海馬CA1區(qū)神經(jīng)元病變有關。

生理狀態(tài)下，活性氧簇（ROS）能夠被抗氧化酶催化還原而維持動態(tài)平衡，但麻醉藥阻斷膽堿能系統(tǒng)導致ROS大量生成與釋放，過度消耗SOD和CAT，導致ROS過剩而引發(fā)氧化應激反應[17]。過剩的ROS能夠破壞蛋白質(zhì)、染色體以及生物膜等生成具有生物毒性的MDA。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大蒜素治療能夠有效提高海馬組織SOD、CAT活性并降低MDA含量，提示大蒜素對丙泊酚麻醉所致老年大鼠認知功能障礙的改善作用可能與抑制氧化應激反應進而降低海馬CA1區(qū)神經(jīng)元有關。

麻醉藥阻斷膽堿能系統(tǒng)導致炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6大量合成與釋放而引發(fā)炎癥反應[18]。此外，TNF-α、IL-1β 做為趨化因子能夠進一步促進自身及其他炎癥因子表達，進而形成炎癥級聯(lián)反應而加重炎癥損傷[19]；IL-6則能夠刺激ROS合成與釋放而加重氧化應激損傷[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大蒜素治療能夠有效降低海馬組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量，提示大蒜素對丙泊酚麻醉所致老年大鼠認知功能障礙的改善作用可能與抑制炎癥反應進而降低海馬CA1區(qū)神經(jīng)元有關。

Nrf2是真核細胞中普遍存在的一種核轉(zhuǎn)錄因子，生理狀態(tài)下，Nrf2通過泛素連接酶與Kelch樣環(huán)氧氯丙胺相關蛋白1（Keap1）結(jié)合而被降解，但ROS能夠刺激Nrf2與Keap1解離，游離Nrf2轉(zhuǎn)移至細胞核后與靶基因結(jié)合，誘導抗氧化酶（包括SOD、CAT）和HO-1轉(zhuǎn)錄表達；HO-1具有催化降解血紅素、清除CO等生理學作用，在機體抗氧化應激和抗炎過程中發(fā)揮著重要作用[20-21]。NF-κB是細胞內(nèi)調(diào)控炎癥因子表達的重要信號通路，NF-κB被ROS激活后能夠與p65結(jié)合并轉(zhuǎn)移至細胞核，進而誘導TNF-α、IL-1β、IL-6大量表達而加重炎癥反應[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大蒜素治療能夠有效上調(diào)海馬組織Nrf2、HO-1表達并下調(diào)NF-κB表達，這可能是大蒜素抑制丙泊酚麻醉所致老年大鼠海馬神經(jīng)元氧化應激和炎癥反應的重要分子機制。

綜上所述，大蒜素對丙泊酚麻醉所致老年大鼠認知功能障礙具有改善作用，其作用機制可能與激活Nrf2/HO-1通路、抑制NF-κB蛋白表達，抑制神經(jīng)元凋亡、氧化應激和炎癥反應進而降低海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷有關。