五味子多糖的分離、純化及結(jié)構(gòu)表征*

張紅梅，李方懌，趙春霞，王春華，顏曉暉，余河水，李正

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥制藥工程學(xué)院，天津 301617；2.省部共建組分中藥國家重點實驗室，天津 301617）

五味子為木蘭科植物五味子[Schisandrachinensis（Turcz.）Baill.]的干燥成熟果實。最早列于《神農(nóng)本草經(jīng)》上品中藥，具有抗氧化、抗腫瘤、保肝、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[1-3]。子味子作為一種傳統(tǒng)中藥，也是經(jīng)典方劑生脈散和現(xiàn)代制劑生脈注射液的主要組成藥物，其主要化學(xué)成分包括木脂素類[4]、揮發(fā)油[5]、多糖及有機酸類[6-7]等。

多糖是五味子的重要組成成分，與其生物活性密切相關(guān)。現(xiàn)代藥理研究表明，五味子多糖具有調(diào)節(jié)免疫、抗癌、抗氧化等多種藥理活性[8]，且對機體幾乎無毒副作用，具有高效低毒的特點[9]。因此，本實驗對五味子多糖進行分離純化，綜合運用現(xiàn)代儀器分析技術(shù)系統(tǒng)和全面的研究五味子多糖的分子量、單糖組成等結(jié)構(gòu)特征，以期為五味子多糖的進一步研究及開發(fā)利用提供一定借鑒與參考。

1 材料

1.1 藥材 五味子（批號：17110604）由蘇中藥業(yè)集團股份有限公司提供，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)王春華副研究員鑒定為木蘭科植物五味子[Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.]的干燥成熟果實。

1.2 試劑 D-甘露糖（批號：C16J8H28561，含量≥98%）、鼠李糖（批號：SA0411GA13，含量≥98%）、D-半乳糖（批號：Z22J9H64187，含量≥98%）、D-無水葡萄糖（批號：S10S9I69833，含量≥98%）、L-阿拉伯糖（批號：T05J6C1，含量≥98%）、D-木糖（批號：B02M6W1，含量≥99%）、D-葡萄糖醛酸（批號：K14J7S9017，含量≥98%）、D-半乳糖醛酸（批號：K02A9B66077，含量≥98%）購于上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）購于美國Fisher公司；葡聚糖凝膠G-150、乙酸銨購于北京索萊寶科技有限公司；乙酸鈉購于上海阿拉丁生化科技有限公司；重蒸酚購于北京鼎國昌盛生物科技有限責(zé)任公司；溴化鉀（KBr）購于國際晶體實驗室；氘代水（D2O）購于青島艾弗斯特科貿(mào)有限公司；氫氧化鈉（NaOH）購于天津市津科精細化工研究所；鹽酸（HCl）購于天津市大茂化學(xué)試劑廠；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）購于上海源葉生物科技有限公司。

1.3 儀器 LC-20AD型高效液相色譜儀、RID-20A示差檢測器、傅里葉變換紅外光譜儀（日本島津公司）；DAWN 8型多角度激光光散射儀（美國懷雅特技術(shù)公司）；ACQUITY Arc液相色譜儀、2998型二極管陣列檢測器（美國Waters公司）；FDU-2110型冷凍干燥機（東京理化EYELA公司）；AB135-S型電子分析天平[十萬分之一，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；KQ2200DB型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；AVANCE III 400 MHz全數(shù)字化核磁共振譜儀（瑞士Bruker公司）。

2 方法

2.1 粗多糖的提取及分級醇沉 稱取130 g脫脂后的干燥的五味子，加入10倍量的純水，提取3次，每次3 h，合并提取液，減壓濃縮。采用Sevage法脫蛋白，直到在260 nm和280 nm波長下沒有紫外吸收峰后，加入3倍體積的95%乙醇，置于4℃靜置過夜，離心得到多糖沉淀，冷凍干燥得五味子粗多糖。

稱取5.0 g五味子粗多糖，加入500 mL純水?dāng)嚢?6 h，使其充分溶脹，加入95%乙醇，使溶液中乙醇濃度依次達到20%、40%、60%、80%分別收集沉淀，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌3次，冷凍干燥得級分 1（SCP-1）、級分 2（SCP-2）、級分 3（SCP-3）和級分 4（SCP-4）。

2.2 多糖的分離純化 稱取SCP-3配成1%的多糖溶液，使其充分溶脹，調(diào)節(jié)pH值為4.0，加入1.5%活性炭脫色[10]，抽濾去除活性炭，透析48 h，冷凍干燥。取凍干的多糖200 mg加入10 mL純水溶解，采用葡聚糖凝膠G-150進一步分離純化，洗脫劑為 0.1 mol/L NaCl，流速為 0.3 mL/min，每 15 min收集1管，采用苯酚-硫酸法檢測收集液，繪制檢測曲線。根據(jù)檢測曲線收集主峰部分進行合并，合并后的多糖溶液采用3000 kD透析袋透析脫鹽，冷凍干燥，得五味子多糖組分SCP-3-1，備用。

2.3 SCP-3-1的含量測定

2.3.1 標準曲線的繪制 稱取干燥至恒質(zhì)量（105℃）的葡萄糖5.03 mg，置于50 mL容量瓶中，配制成葡萄糖標準溶液。分別精密移取葡萄糖標準溶液0.2、0.4、0.6、0.8、0.9、1.0 mL 于 6 個試管中，精密補水至1.0 mL，分別加入6%苯酚溶液1.0 mL，迅速加入濃硫酸5.0 mL，劇烈振搖，沸水浴10 min后，冰水浴至室溫，490 nm處測得吸光度。以吸光度（Y）對葡萄糖濃度（X）進行線性擬合，得到線性方程[11]。

2.3.2 多糖的含量測定 稱取2.98mgSCP-1、2.54mg SCP-2、2.55 mg SCP-3、2.53 mg SCP-4 和 2.50 mg SCP-3-1，分別置于5.0 mL容量瓶中定容，各取0.1 mL置于試管中，補水至1.0 mL，分別加入6%苯酚溶液1.0 mL，迅速加入濃硫酸5.0 mL，劇烈振搖，沸水浴10 min后，冰水浴至室溫，490 nm處測得吸光度。根據(jù)下列公式計算多糖含量[12-15]。

式中：C為樣品溶液中葡萄糖的濃度，V為樣品溶液的體積，0.9為換算因子，W為樣品的質(zhì)量（mg）。

在小范圍班級試點生物化學(xué)實驗教改課題[8-9]之后，筆者確定了綜合性實驗教學(xué)內(nèi)容，包括酪蛋白的提取、純化、含量測定和分子量的測定等四次蛋白質(zhì)的實驗，質(zhì)粒DNA的提取及瓊脂糖凝膠電泳兩次核酸實驗，通過綜合性實驗的訓(xùn)練，學(xué)生基本能掌握生物大分子的分離提取和檢測流程。

2.4 SCP-3-1的結(jié)構(gòu)表征

2.4.1 分子量及其分布的測定 稱取SCP-3-1適量加入流動相配制成濃度為2.0 mg/mL的多糖溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得樣品。采用高效分子排阻色譜法測定其純度和分子量[16]。色譜條件為：色譜柱：TSKgel GMPWxl凝膠色譜柱（7.8 mm l.D.×30 cm，13 μm）；流動相：0.003 mol/L 乙酸鈉溶液；流速：0.8 mL/min進行等度洗脫；進樣量：100 μL；柱溫：40℃；使用 MALLS-RID 檢測多糖，Astra 6軟件收集及處理數(shù)據(jù)。

2.4.2 單糖組成分析

2.4.2.1 多糖的水解 將SCP-3-1樣品置于具塞試管中，用2.0 mol/L三氟乙酸（TFA）進行完全酸水解（m多糖∶vTFA=2∶1），沸水浴水解 6 h，取出放至室溫，用甲醇反復(fù)濃縮蒸除TFA，最后用雙蒸水溶解，得多糖水解液。

2.4.2.2 衍生化產(chǎn)物的制備 稱取D-甘露糖1.53mg、鼠李糖1.10 mg、D-半乳糖 1.50 mg、D-無水葡萄糖1.51 mg、L-阿拉伯糖 1.54 mg、D-木糖 1.50 mg、D-葡萄糖醛酸1.46 mg、D-半乳糖醛酸1.53 mg置于10 mL容量瓶，純水定容，作為混合對照品溶液。分別取混合對照品溶液和多糖水解液200 μL，加入200 μL的 0.5 mol/L的 PMP-甲醇溶液和 200 μL的0.3 mol/L的NaOH溶液，70℃衍生化30 min，冷卻至室溫，加入200 μL的0.3 mol/L的HCl溶液，混勻，加入1.0 mL氯仿萃取，去除多余的PMP試劑，重復(fù)3次，8 000 r/min離心 10 min，離心半徑 6.0 cm，取上清液進樣測定。

2.4.2.3 色譜條件 色譜柱：Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.1 mol/L 乙酸銨水溶液-乙腈（84∶16）；柱溫：35 ℃；檢測波長：250 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL。

2.4.3 紅外光譜分析 稱取1.50 mg SCP-3-1樣品，加入150 mg干燥的KBr粉末置于瑪瑙研缽中研磨均勻后壓片。采用傅里葉變換紅外光譜儀掃描，掃描波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1。

3 結(jié)果

3.1 粗多糖的分級醇沉結(jié)果 采用水提醇沉法提取得到五味子粗多糖，通過加入95%乙醇使五味子多糖溶液達到20%、40%、60%、80%的乙醇濃度，分級醇沉得到 SCP-1、SCP-2、SCP-3 和 SCP-4，見表1。

表1 不同級分的五味子多糖Tab.1 Different fractions of polysaccharide from Schisandra chinensis

3.2 多糖的分離純化結(jié)果 SCP-3經(jīng)葡聚糖凝膠柱進一步分離，以0.1 mol/L的NaCl為洗脫劑，洗脫得到純度較高的五味子多糖。采用苯酚-硫酸法檢測收集液，繪制洗脫曲線（圖1），根據(jù)洗脫曲線收集主峰部分進行合并，合并后的多糖溶液采用3 000 kDa透析袋透析脫鹽，冷凍干燥得SCP-3-1。

圖1 SCP-3洗脫曲線Fig.1 Elution profile of SCP-3

3.3 SCP-3-1的含量測定結(jié)果 采用苯酚-硫酸法對得到的SCP-3-1的多糖含量進行測定，首先用不同濃度的葡萄糖標準溶液建立標準曲線，以吸光度為縱坐標（Y）、葡萄糖濃度為橫坐標（X）進行線性擬合，得到線性方程Y=10.027 37X+0.013 89，R2=0.994 08。根據(jù)標準曲線計算出SCP-3-1的多糖含量為74.28%。

3.4 SCP-3-1的結(jié)構(gòu)表征

3.4.1 分子量及其分布測定結(jié)果 采用HPSECMALLS-RID法測定多糖，Astra 6軟件收集及處理數(shù)據(jù)，得到SCP-3-1的分子量為84.9 kDa，多分散指數(shù)為1.207，SCP-3-1的多分散指數(shù)接近于1且峰型為單一對稱峰，說明SCP-3-1的純度較高。見圖2、表2。

圖2 SCP-3-1示差及多角度激光光散射色譜圖Fig.2 Chromatograms of SCP-3-1 using MALLS-RID

表2 SCP-3-1分子量及分子量分布測定結(jié)果Tab.2 Results of molecular weight and molecular weight distribution of SCP-3-1

3.4.2 單糖組成分析結(jié)果 采用PMP柱前衍生化HPLC法測定五味子多糖的單糖組成，TFA將多糖水解為單糖，PMP對單糖衍生化處理后，采用二極管陣列檢測器檢測，得到多糖的單糖組成及其摩爾比（圖3）。結(jié)果表明，SCP-3-1主要由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖（摩爾比為0.09∶0.19∶19.82∶2.08∶0.13）組成。

圖3 混合對照品、SCP-3-1的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of standard monosaccharides and acidolysis products of SCP-3-1

3.4.3 紅外光譜結(jié)果 分析結(jié)果見圖4。SCP-3-1具有多糖特征吸收峰，3 383 cm-1為多糖分子間或分子內(nèi)氫鍵O-H伸縮振動的強且寬的吸收峰[17]，2 927 cm-1為甲基和次甲基的C-H伸縮振動的吸收峰，1 740 cm-1處的吸收峰為酯鍵的特征吸收峰，說明有一部分的半乳糖醛酸是以內(nèi)酯的形式存在的。1 622 cm-1為羰基的C=O伸縮振動形成的吸收峰，1 417 cm-1為C-H的變形振動的吸收峰，1 400～1 200 cm-1為C-H的變角振動，和C-H的伸縮振動構(gòu)成了糖環(huán)的特征吸收，SCP-3-1在1 022、1 080和1 153 cm-1處為3個吸收峰，說明其糖環(huán)構(gòu)型為吡喃型，848 cm-1處的吸收峰表明SCP-3-1含有α-吡喃糖苷鍵[18-20]。

圖4 SCP-3-1紅外光譜圖Fig.4 IR spectrum of SCP-3-1

3.4.4 核磁共振波譜分析結(jié)果1H-NMR主要用于判斷多糖的糖苷鍵構(gòu)型，多糖的C1上的1H-NMR信號出現(xiàn)在δ 5.5～4.8 ppm，C2-C6的1H-NMR信號出現(xiàn)在δ 4.8～4.0 ppm，此處信號堆積嚴重，難以解析。通常，α構(gòu)型的吡喃糖其C1上的1H-NMR信號化學(xué)位移值大于5.0 ppm，β構(gòu)型的則小于5.0 ppm。13C-NMR的范圍較廣，通常在δ 110～96 ppm處為糖端基碳信號，其他化學(xué)位移為非端基碳信號。未發(fā)生取代的 C2、C3、C4、C5 信號通常在 δ 78～70 ppm，發(fā)生取代后在δ 85～78 ppm。未發(fā)生取代的C6信號通常在 δ 64～60 ppm，取代后在 δ 70～67 ppm[18，20-21]。

SCP-3-1的1H-NMR譜如圖5所示，結(jié)果表明，δ 5.43 ppm和δ 5.42 ppm為糖端基C1的質(zhì)子信號，δ 4.7～3.6 ppm為非端基質(zhì)子信號，δ 3.80處的強信號含有半乳糖醛酸的甲氧酯基的甲基質(zhì)子信號。化學(xué)位移δ 5.43 ppm、δ 5.42 ppm大于5.0 ppm，表明其構(gòu)型為α構(gòu)型，說明級分SCP-3-1的單糖是以α-糖苷鍵連接的。

圖5 SCP-3-1的1H-NMR譜Fig.5 The1H-NMR spectrum of SCP-3-1

SCP-3-1的13C-NMR譜如圖6所示，結(jié)果表明，δ104.4ppm、δ99.7 ppm為異頭碳的信號，δ77～70ppm為未發(fā)生取代的 C2、C3、C4、C5 的信號，δ 60.8 ppm、δ 60.5 ppm為未取代的C6的信號。

圖6 SCP-3-1的13C-NMR譜Fig.6 The13C-NMR spectrum of SCP-3-1

SCP-3-1的DEPT-135譜如圖7所示，δ 60.3ppm、δ 60.4 ppm和δ 60.7 ppm可能為吡喃糖6位的碳信號，且譜圖中在δ84～82ppm處沒有碳的共振吸收峰，表明該多糖不含有呋喃糖環(huán)。

圖7 SCP-3-1的DEPT-135譜Fig.7 The DEPT-135 spectrum of SCP-3-1

4 結(jié)論

多糖的分離純化是對其結(jié)構(gòu)表征的基礎(chǔ)。從天然產(chǎn)物提取的粗多糖通常含有蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)，因此，本實驗通過水提醇沉法得到五味子粗多糖，分級醇沉、脫蛋白、脫色及葡聚糖凝膠G-150進一步分離純化得五味子多糖組分SCP-3-1。經(jīng)鑒定SCP-3-1是純度較高的相對分子質(zhì)量為84.9 kDa的吡喃型多糖，主要由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成。

五味子多糖是五味子的重要活性成分，也是中藥的重要功效成分之一，具有多種生理活性功能。且其功能活性與相對分子質(zhì)量及其分布、單糖組成等結(jié)構(gòu)特征密切相關(guān)[22]。而本研究通過對五味子多糖的結(jié)構(gòu)表征，為五味子藥材的綜合開發(fā)利用及進一步解析多糖的構(gòu)效關(guān)系提供一定理論參考。