醛糖還原酶抑制劑抑制屋塵螨誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2氧化應(yīng)激反應(yīng)

鮑 敏，林 玫，甄海寧，何 芳，丁 敏，袁竹青，陳亞雋，薛欣欣

(武漢市第三醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，湖北 武漢 430060)

支氣管哮喘(bronchial asthma)是一種以可逆性的氣道痙攣、氣道高原反應(yīng)等為特點(diǎn)的氣道慢性炎性反應(yīng)疾病[1]。氣道上皮細(xì)胞是氣道的首要防線，可有效的抵御外界刺激，多種證據(jù)表明其在哮喘氣道炎性的啟動和維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，阻斷或減弱醛糖還原酶(aldose reductase，AR)活性可緩解細(xì)胞功能損傷，目前醛糖還原酶抑制劑(aldose reductase inhibitors，ARIs)的研究已經(jīng)取得一定成效[3]，中藥醛糖還原酶抑制劑分為多種，其中惱火黃酮類、生物堿類等，其因來源廣、副作用小的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用，目前臨床用于治療糖尿病并發(fā)癥疾病，療效確切[4]，但ARIs對支氣管上皮細(xì)胞的作用機(jī)制研究較少。本研究探究醛糖還原酶抑制劑對屋塵螨誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系：人支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B(ATCC公司)。

1.1.2 試劑：RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Invitrogen公司)；醛糖還原酶抑制劑(Pfizer公司)；地塞米松(Sigma Aldrich公司)；活性氧(reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxidedis-mutase，SOD)檢測試劑盒(均購于中國碧云天生物技術(shù)研究所)；NF-κB抗體、p38 MAPK抗體(Cell Signal Technology公司)；屋塵螨(北京博蕾德生物科技有限公司)；NF-κB抑制劑PDTC(北京白奧萊博科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理：將BEAS-2B細(xì)胞分為對照組，模型組(屋塵螨50 μmol/L刺激)，NF-κB抑制劑(PDTC)組(PDTC干預(yù)模型組，10 μmol/L)，ARIs組(ARIs干預(yù)模型組，50 μmol/L)。

1.2.2 細(xì)胞中SOD活性和MDA含量的測定：將BEAS-2B細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個(gè)/L，檢測細(xì)胞中氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA含量和SOD活性。

1.2.3 細(xì)胞中ROS含量的測定：將BEAS-2B細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個(gè)/L，加入終濃度10 μmol/L的活性氧熒光黃探針(DCFH-DA)，置于細(xì)胞于避光環(huán)境中，孵育30 min后，用PBS溶液洗滌，最后用流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度，來反應(yīng)ROS含量。

1.2.4 ELISA檢測細(xì)胞中IL-5、IL-13、IFN-γ含量：用無菌離心管收集培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞培養(yǎng)液，2 000 r/min離心20 min，收集上清液。ELISA檢測IL-5、IL-13、IFN-γ含量。

1.2.5 MTT法測定細(xì)胞存活率：取對數(shù)期的BEAS-2B細(xì)胞，按1×106個(gè)接種于96孔板中，100 μL/孔，將孔板置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)細(xì)胞過夜，各組細(xì)胞的孔板內(nèi)分別加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，用無血清的培養(yǎng)基避光孵育細(xì)胞4 h，棄掉上層血清，將二甲基亞砜溶液MTT再次加入到培養(yǎng)基中，對細(xì)胞在490 nm處的吸光度值進(jìn)行測定，對細(xì)胞的存活率進(jìn)行計(jì)算。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡：取對數(shù)期的各組BEAS-2B細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為3×106個(gè)/L。用胰蛋白酶消化孔板內(nèi)的細(xì)胞，離心細(xì)胞，5 min后棄掉細(xì)胞上清液，加入annexin V-FITC和PI于細(xì)胞中，避光孵育制成的細(xì)胞懸液，15 min后向每個(gè)流式管中加入400 μL上樣緩沖液，讓細(xì)胞充分混勻，上機(jī)檢測。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡檢測細(xì)胞內(nèi)NF-κB、NF-κB p65和p38 MAPK蛋白表達(dá)：取對數(shù)期的各組BEAS-2B細(xì)胞加入胰蛋白酶消化細(xì)胞并離心，棄掉上清液后用PBS溶液重懸細(xì)胞，再次離心后裂解滑膜成纖維樣細(xì)胞，離心15 min后收集上清液并測定總蛋白含量。取30 μg蛋白上樣煮沸、電泳、PVDF膜轉(zhuǎn)印。封閉組織后加入一抗和二抗，充分混勻后孵育5 min，GABA一抗稀釋液加入到組織中，充分混勻后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，顯色后測定蛋白的相對吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞中SOD活性和MDA含量比較

模型組BEAS-2B細(xì)胞中SOD活性低于對照組，MDA含量高于對照組(P<0.05)；和模型組相比，PDTC組和ARIs組BEAS-2B細(xì)胞中SOD活性均升高，MDA含量均顯著降低(P<0.05)(表1)。

2.2 各組細(xì)胞中ROS含量比較

模型組BEAS-2B細(xì)胞中ROS含量較對照組明顯增加(P<0.05)；PDTC組和ARIs組BEAS-2B細(xì)胞中ROS含量較模型組明顯減少(P<0.05)(圖1)。

表1 各組SOD活性、MDA含量比較

2.3 各組細(xì)胞中IL-5、IL-13、IFN-γ含量比較

模型組BEAS-2B細(xì)胞中IL-5、IL-13含量顯著高于對照組細(xì)胞，IFN-γ含量較對照組顯著降低(P<0.05)；PDTC組和ARIs組BEAS-2B細(xì)胞中IL-5、IL-13含量明顯低于模型組，IFN-γ含量高于模型組(P<0.05)(表2)。

A.fluorescence detection of ROS content in each group; B.comparison of ROS content in each group *P<0.05 compared with control group; △P<0.05 compared with model group

表2 各組細(xì)胞中IL-5、IL-13、IFN-γ含量比較

2.4 各組細(xì)胞存活率比較

模型組BEAS-2B細(xì)胞存活率低于對照組(P<0.05)；PDTC組和ARIs組BEAS-2B細(xì)胞存活率均明顯高于模型組(P<0.05)(圖2)。

2.5 各組細(xì)胞凋亡率比較

和對照組相比，模型組BEAS-2B細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.05)；和模型組相比，PDTC組和ARIs組BEAS-2B細(xì)胞凋亡率均顯著降低(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 comparedwith model group圖2 各組細(xì)胞存活率比較Fig 2 Comparison of cell survival rate in each group

2.6 各組細(xì)胞中NF-κB p65和p38 MAPK蛋白表達(dá)比較

和對照組相比，模型組BEAS-2B細(xì)胞中NF-κB、NF-κB p65和p38 MAPK蛋白表達(dá)均顯著增加(P<0.05)；和模型組相比，PDTC組和ARIs組BEAS-2B細(xì)胞中NF-κB、NF-κB p65和p38 MAPK蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)(圖4)。

3 討論

支氣管哮喘是一種異質(zhì)性疾病[5]。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的大量活性氧會導(dǎo)致氣道發(fā)生炎性反應(yīng)，氣道高反應(yīng)性和氣道重塑等[6-7]。研究證實(shí)，抑制哮喘大鼠中活性氧的生成，可減少嗜酸粒細(xì)胞的產(chǎn)生，抑制氣道免疫炎性反應(yīng)[8]?？梢娭夤芟嬖谘趸?抗氧化失衡現(xiàn)象，影響病理學(xué)改變。

SOD是抗氧化酶的一種，可清除細(xì)胞代謝過程中所產(chǎn)生的氧自由基，降低活性氧水平，保護(hù)支氣管。MDA是膜脂過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物之一，蓄積過多的氧化產(chǎn)物，導(dǎo)致蛋白質(zhì)等大分子相互交聯(lián)，加重組織損傷[9]。本研究結(jié)果顯示，ARIs組細(xì)胞中SOD活性可降低MDA和ROS含量，提示醛糖還原酶抑制劑可改善屋塵螨誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞中的氧化應(yīng)激反應(yīng)。近年來研究顯示，醛糖還原酶介導(dǎo)支氣管哮喘炎性反應(yīng)的病理過程，可通過抑制炎性細(xì)胞因子和活性氧等抑制醛糖還原酶的活性，進(jìn)而降低氣道發(fā)生的炎性反應(yīng)和高反應(yīng)性，對哮喘病理過程的進(jìn)展有很好的療效[0]。

有研究發(fā)現(xiàn)，支氣管哮喘的發(fā)生通常被認(rèn)為是輔助性T細(xì)胞介導(dǎo)的病原體所致炎性細(xì)胞浸潤而誘發(fā)[11]。其中Th1/Th2協(xié)調(diào)的不平衡是導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性發(fā)生的關(guān)鍵原因。IFN-γ為Th1的特征因子，IL-5、IL-13為Th2分泌的炎性因子[12]。本研究結(jié)果顯示，ARIs組細(xì)胞中IL-5、IL-13含量減少，IFN-γ含量增加，提示醛糖還原酶抑制劑可抑制屋塵螨刺激的支氣管上皮細(xì)胞中的炎性因子。醛糖還原酶(AR)可介導(dǎo)糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生，AR抑制劑(ARIs)可影響高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變，并且ARIs在臨床上長期使用的副作用也較小。動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[13]AR介導(dǎo)哮喘炎性的發(fā)生發(fā)展，ARIs可抑制氣道上皮細(xì)胞內(nèi)炎性因子的產(chǎn)生和聚集，同時(shí)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)以及氣道上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)轲ひ悍置诩?xì)胞，進(jìn)而減少哮喘發(fā)生時(shí)的炎性反應(yīng)，因此ARIs成為防治哮喘的新方向。

支氣管哮喘的肺部炎性機(jī)制與復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)傳導(dǎo)有著不可分割的聯(lián)系，其中NF-κB相關(guān)通路與p38 MAPK是導(dǎo)致支氣管哮喘整個(gè)發(fā)病過程的重要傳導(dǎo)機(jī)制，與哮喘等免疫和炎性反應(yīng)有明顯相關(guān)性[14]。在正常情況下，NF-κB 穩(wěn)定存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞激活后，p38 MAPK發(fā)生磷酸化降解，導(dǎo)致NF-κB核定位序列的暴露，進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與目的基因特異性結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)包括IL-5和IL-13等目的基因的轉(zhuǎn)錄，提示了NF-κB和MAPK是治療支氣管哮喘的潛在靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，ARIs組細(xì)胞中NF-κB、NF-κB p65與p38 MAPK蛋白表達(dá)減少。研究證實(shí)，給予哮喘大鼠姜黃素干預(yù)，結(jié)果顯示干預(yù)組大鼠支氣管中多種炎性細(xì)胞數(shù)、IL-4、IL-5含量降低，浸潤的炎性細(xì)胞計(jì)數(shù)減少，其作用機(jī)制與調(diào)控NF-κB p65核轉(zhuǎn)位及磷酸化MAPK蛋白水平有關(guān)[15]。

A.cell apoptosis was detected by flow cytometry; B.comparison of apoptosis rates in each group；*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with model group

A.expression of NF-κB, NF-κB P65 and p38 MAPK protein in each group; B.comparison of NF-κB protein expression in each group (n=6); C.comparison of NF-κB p65 protein expression in all groups (n=6); D.comparison of p38 MAPK protein expression in each group (n=6)；*P<0.05 compared with control group; △P<0.05 compared with model group

綜上所述，醛糖還原酶抑制劑可抑制屋塵螨誘導(dǎo)的人氣道上皮細(xì)胞發(fā)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)BEAS-2B細(xì)胞增殖，抑制凋亡。