GSDMD-N和p-MLKL蛋白在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜組織中上調(diào)

盧 珊，張冰清，葉菜英，朱 蕾*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 藥理學(xué)系， 北京 100005；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 普通內(nèi)科，北京 100730)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以累及周?chē)P(guān)節(jié)為主的慢性、系統(tǒng)性和炎癥性自身免疫性疾病。慢性增生性滑膜炎是RA的基本病理改變，是導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞的重要原因，但目前發(fā)生機(jī)制尚不十分明確[1]。細(xì)胞焦亡(pyroptosis)和程序性壞死(necroptosis)是近年發(fā)現(xiàn)的促炎形式的程序性細(xì)胞死亡，其觸發(fā)時(shí)伴有大量細(xì)胞內(nèi)容物的釋放，暴露的損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs)會(huì)激活機(jī)體的免疫應(yīng)答，引起炎性反應(yīng)[2-3]。這兩種程序性細(xì)胞死亡方式被推測(cè)是機(jī)體防止病原體大量復(fù)制并擴(kuò)散，從而保護(hù)機(jī)體的有效機(jī)制。但越來(lái)越多的研究表明，其失調(diào)在多種疾病中起重要作用[2-3]。因此，本研究檢測(cè)了RA關(guān)節(jié)滑膜組織中細(xì)胞焦亡和程序性壞死相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，并分析其相應(yīng)的標(biāo)志性蛋白GSDMD-N和p-MLKL與患者臨床特征及病理滑膜炎之間的相關(guān)性，初步探索細(xì)胞焦亡和程序性壞死與RA發(fā)病的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本的來(lái)源：滑膜組織取材2017年12月至2018年12月于北京協(xié)和醫(yī)院行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的RA患者5例，骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)患者5例。RA患者符合1987年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(American College of Rheumatology, ACR)修訂的RA分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)或2010年ACR與歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(European League Against Rheumatism,EULAR)聯(lián)合修訂的RA分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，并排除其他自身免疫病；OA患者符合2010年ACR膝關(guān)節(jié)OA分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)。本研究經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：003-2018)。

1.1.2 臨床資料的收集：記錄患者的性別、年齡、紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)和超敏C反應(yīng)蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hsCRP)水平。

1.1.3 試劑：M-PER哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)抽提液、蛋白酶及磷酸酶抑制劑Cocktail和電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)底物(Thermo Fisher Scientific公司)；BCA蛋白定量試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；兔抗GSDMD單抗和兔抗cleaved-GSDMD單抗(Cell Signaling Technology公司)；鼠抗caspase-1單抗(Adipogen公司)；兔抗混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(mixed-lineage kinase domain-like protein，MLKL)單抗(Invitrogen公司)；兔抗p-MLKL單抗(Abcam公司)；羊抗兔IgG二抗和羊抗鼠IgG二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 HE染色評(píng)估滑膜病理改變：按常規(guī)HE染色方法操作，并采用Krenn評(píng)分評(píng)估病理滑膜炎程度[4]，包括襯里層增生、襯里下層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和基質(zhì)活化3個(gè)亞分，每個(gè)亞分根據(jù)相應(yīng)病理改變的輕重程度進(jìn)行半定量評(píng)分(0～3分)，相加為Krenn總分(0～9分)。

1.2.2 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)：將滑膜組織樣本按質(zhì)量體積比1∶7加入預(yù)冷的組織蛋白提取液(含1%蛋白酶及磷酸酶抑制劑)，用勻漿機(jī)勻漿15 s，冰上靜置30 min后4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清。同樣條件再次離心取上清。采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取蛋白樣品30 μg，加上樣緩沖液加熱變性，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，然后用一抗4 ℃孵育過(guò)夜。次日TBST洗膜后室溫孵育相應(yīng)的二抗1 h，再次用TBST洗膜后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光并拍照，用ImageJ分析各條帶吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 RA組與OA組患者的臨床資料

詳細(xì)資料見(jiàn)表1。

表1 RA組與OA組患者臨床資料的比較

2.2 RA和OA患者關(guān)節(jié)滑膜病理Krenn評(píng)分

與OA相比，RA的Krenn總分顯著增加(P<0.05)，其中襯里下層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)亞分的增加最為顯著(P<0.01)(圖1)。

2.3 RA和OA關(guān)節(jié)滑膜組織中細(xì)胞焦亡與程序性壞死的比較

與OA滑膜組織相比，RA中pro-caspase-1的表達(dá)顯著降低(P<0.01)，caspase-1的表達(dá)顯著升高(P<0.05)；GSDMD的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，而GSDMD-N的表達(dá)明顯升高(P<0.05)(圖2)。RA滑膜組織中p-MLKL和MLKL的表達(dá)均顯著高于OA關(guān)節(jié)滑膜(P<0.05)(圖3)。

2.4 細(xì)胞焦亡和程序性壞死與臨床指標(biāo)的相關(guān)性

GSDMD-N與ESR呈正相關(guān)(r=0.678，P<0.05)，與CRP呈正相關(guān)(r=0.725，P<0.05)；p-MLKL與ESR呈正相關(guān)(r=0.639，P<0.05)。

A-J.representative HE staining of synovium from OA patients No.1-5 (A-E) and RA patients No.1-5 (F-J)(×100); K.Krenn total score; L.Krenn subscore; *P<0.05，**P<0.01 compared with OA group

*P<0.05，**P<0.01 compared with OA group圖2 RA和OA患者關(guān)節(jié)滑膜組織中細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白的檢測(cè)Fig 2 Analysis of the related proteins of pyroptosis in synovial tissues from RA and OA patients

*P<0.05 compared with OA group圖3 RA和OA患者關(guān)節(jié)滑膜組織中程序性壞死相關(guān)蛋白的檢測(cè)Fig 3 Analysis of the related proteins of necroptosis in synovial tissues from OA and RA patients

2.5 GSDMD-N和p-MLKL與病理滑膜炎的相關(guān)性

GSDMD-N與Krenn總分呈正相關(guān)(r=0.680，P<0.05)，與襯里下層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)亞分呈正相關(guān)(r=0.784，P<0.01)；p-MLKL與Krenn總分呈正相關(guān)(r=0.664，P<0.05)，與襯里下層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)亞分呈正相關(guān)(r=0.872，P<0.001)。

3 討論

程序性細(xì)胞死亡包括細(xì)胞焦亡、程序性壞死、凋亡和自噬等多種細(xì)胞死亡方式[2]。其中，細(xì)胞焦亡是一種caspase家族依賴(lài)性的細(xì)胞程序性死亡。在其經(jīng)典激活途徑中，病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)或DAMPs活化炎性小體，使無(wú)活性的pro-caspase-1水解為有酶活性的caspase-1，活化的caspase-1將IL-1β和IL-18的前體剪切為成熟體，同時(shí)caspase-1切割GSDMD蛋白產(chǎn)生N端產(chǎn)物(GSDMD-N)，后者發(fā)生寡聚化并在細(xì)胞膜上形成膜孔，使細(xì)胞腫脹破裂，釋放細(xì)胞內(nèi)容物和大量促炎因子，引起細(xì)胞焦亡[5-6]。關(guān)于細(xì)胞焦亡的上游通路，即炎性小體的激活可能參與RA的疾病進(jìn)程已有報(bào)道。然而，RA中細(xì)胞焦亡的研究相對(duì)較少。據(jù)報(bào)道，與OA患者相比，RA患者外周血CD14+的巨噬細(xì)胞中GSDMD-N的表達(dá)明顯增加，細(xì)胞呈現(xiàn)焦亡樣改變[7]。為了明確RA關(guān)節(jié)滑膜中是否發(fā)生細(xì)胞焦亡，比較了RA和OA患者關(guān)節(jié)滑膜組織中pro-caspase-1、caspase-1、GSDMD和GSDMD-N的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與OA相比，RA滑膜組織中pro-caspase-1的表達(dá)降低，caspase-1的表達(dá)顯著升高；GSDMD的表達(dá)降低，而GSDMD-N的表達(dá)明顯升高，提示，RA患者關(guān)節(jié)滑膜中可能發(fā)生細(xì)胞焦亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞焦亡的標(biāo)志性蛋白GSDMD-N的表達(dá)水平與臨床反映RA疾病活動(dòng)的ESR、CRP以及病理滑膜炎的Krenn總分、襯里下層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)亞分呈顯著正相關(guān)，提示RA患者關(guān)節(jié)滑膜的細(xì)胞焦亡水平在一定程度上反映了疾病活動(dòng)度，并可能參與了RA滑膜炎的進(jìn)程。

程序性壞死是另一種促炎形式的新的細(xì)胞程序性死亡方式，死亡細(xì)胞形態(tài)類(lèi)似壞死，而其死亡過(guò)程受胞內(nèi)主動(dòng)機(jī)制的調(diào)節(jié)，由死亡受體介導(dǎo)，以caspase非依賴(lài)性方式發(fā)生[8-9]。TNF-α、Fas/CD95、LPS、干擾素、病毒DNA以及抗腫瘤藥物等多種刺激可以激活死亡受體誘導(dǎo)程序性細(xì)胞壞死[10]，其中 TNF-α誘導(dǎo)的途徑研究最為廣泛。TNF-α與TNFR1結(jié)合誘導(dǎo)TNFR1發(fā)生構(gòu)象變化，從而募集包括受體相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1, RIPK1)在內(nèi)的多種蛋白，形成復(fù)合物，并進(jìn)一步形成由RIPK1、RIPK3和MLKL組成的壞死小體(necrosome)，MLKL被磷酸化，p-MLKL寡聚化并轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜形成孔道樣結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致膜通透性增加，離子內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)滲透壓升高，進(jìn)而發(fā)生細(xì)胞死亡，細(xì)胞內(nèi)容物釋放，引發(fā)免疫和炎性反應(yīng)[11-12]。文獻(xiàn)報(bào)道，膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎鼠關(guān)節(jié)滑膜中p-MLKL的表達(dá)水平明顯升高[13]。為進(jìn)一步明確RA關(guān)節(jié)滑膜中是否發(fā)生程序性壞死，比較了RA和OA患者關(guān)節(jié)滑膜組織中MLKL和p-MLKL的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，RA關(guān)節(jié)滑膜中p-MLKL和MLKL的表達(dá)水平顯著增高。而且，程序性壞死的標(biāo)志性蛋白p-MLKL的表達(dá)水平與ESR、Krenn總分及襯里下層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)亞分呈正相關(guān)。提示，RA患者關(guān)節(jié)滑膜中可能發(fā)生程序性壞死，且其可能參與了RA滑膜炎的病理改變。

綜上，RA關(guān)節(jié)滑膜中細(xì)胞焦亡和程序性壞死均明顯增強(qiáng)，且與疾病活動(dòng)度和滑膜炎性水平呈正相關(guān)。提示，細(xì)胞焦亡和程序性壞死可能在RA滑膜炎的發(fā)病中起重要作用，這為RA的治療提供潛在靶點(diǎn)。相關(guān)的體內(nèi)和體外基礎(chǔ)研究需要進(jìn)一步開(kāi)展以深入探討細(xì)胞焦亡和程序性壞死在RA發(fā)病中的具體機(jī)制。