mTOR活化上調MGST1并增強細胞抗氧化能力

李 杰，浦 洋，張夢迪，張鵬舉，許寅喆

(1. 中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 生理學系， 北京 100005；2.解放軍總醫(yī)院 第一醫(yī)學中心 肝膽胰外科醫(yī)學部 全軍肝膽外科研究所 全軍數(shù)字肝膽外科重點實驗室，北京100853)

反應活性氧(reactive oxygen species, ROS)是一類含氧分子的高活性反應，是細胞氧耗和代謝的副產物。ROS產生過多導致的氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡，即細胞氧化應激，造成細胞內DNA、蛋白質和脂質的損傷并誘導細胞凋亡[1]?；?、放療等腫瘤治療可以造成氧化應激誘導腫瘤細胞死亡，多項研究表明，腫瘤細胞抗氧化能力的增強促進其對放、化療產生的耐藥性[2]。

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又稱AKT)/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信號通路在調控細胞能量代謝和增殖等過程中起著至關重要的作用[3]。該通路中原癌基因PI3K和AKT功能獲得性突變、抑癌基因磷酸酯酶與張力蛋白同源物(gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN)和結節(jié)性硬化癥基因(tuberous sclerosis complex gene 1/2,TSC1/2)的失活突變會導致mTOR過度活化[4]。mTOR通路的異常激活促進細胞增殖和代謝重編程從而誘導腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5]。研究表明，mTOR過度活化還可以增強腫瘤細胞的抗氧化能力導致其對腫瘤治療耐受[6]，但其具體機制有待闡明。

本研究利用氧化應激誘導劑處理野生型(WT)和TSC2敲除的小鼠胚胎成纖維細胞(tsc2-/-MEFs)，并結合生物信息學和功能實驗探討mTOR過度活化增強細胞抗氧化能力的分子機制，對揭示mTOR活化介導的腫瘤細胞耐藥具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞裂解液、ROS試劑盒(上海碧云天生物技術公司)；Bicinchoninic acid檢測蛋白濃度試劑盒、細胞增殖毒性檢測試劑盒、Hifair Ⅱ 1st Str和cDNA Synthesis 反轉錄試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)；硝酸纖維素NC膜(思拓凡公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Corning公司)；胰蛋白酶、胚胎牛血清(Gibco公司)；β-actin抗體、磷酸化S6抗體(CST公司)、MGST1抗體(Abclonal公司)；兔二抗-800通道、鼠二抗-800通道(LI-COR公司)；PCR Mix(ABM公司)；細胞總RNA提取試劑盒(上海奕杉生物科技有限公司)；Lipo2000轉染試劑盒(Invitrogen公司)；無內毒素小提試劑盒(天根生化科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)及干預：將57 mL胚胎牛血清和5.7 mL青鏈霉素雙抗加到500 mL DMEM高糖培養(yǎng)基中用來培養(yǎng)WT和tsc2-/-MEFs，將細胞至于37 ℃、5% CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。細胞重懸并計數(shù)，鋪200 000個細胞至6孔板內，待貼壁后加入亞精胺處理觀察細胞的活力。

1.2.2 細胞ROS水平的檢測：細胞接種至6孔板內，待貼壁后加入亞精胺處理細胞24 h，收集細胞利用DCFH-DA探針孵育30 min，之后用200 μL PBS重懸。將細胞過濾網(wǎng)制備成單細胞懸液并使用C6流式儀進行ROS-488通道的檢測。

1.2.3 CCK8法檢測細胞增殖和活力：將細胞至于96孔板內，4 000個細胞/100 μL。細胞按0、24、48和72 h時間培養(yǎng)，在規(guī)定時間點內在每個孔內加入10 μL CCK8試劑，培養(yǎng)箱孵育2 h。酶標儀檢測450 nm處的吸光度值，觀察細胞的增殖水平和活力。

1.2.4 生信數(shù)據(jù)的分析：利用R語言下載GEO數(shù)據(jù)庫的芯片數(shù)據(jù)集GSE21755，limma包進行芯片數(shù)據(jù)的差異表達分析，clusterProfiler包進行基因集、通路富集分析，蛋白質互作網(wǎng)絡分析使用Cytoscape軟件進行分析。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測細胞內基因表達量：利用細胞RNA提取試劑盒提取細胞的總RNA并測濃度，取1 μg進行反轉錄成cDNA。使用PCR mix配制相應的體系并利用實時PCR擴增儀進行實時熒光檢測。內參基因使用ACTB。使用2-△△Ct值反映基因相對表達量。

1.2.6 Western blot檢測細胞內蛋白的表達：使用細胞裂解液裂解細胞，將細胞至于150 μL裂解液中，冰上孵育30 min，期間振蕩5次，離心并提取上清中總蛋白，使用BCA進行定量。配置15孔12.5%的SDS-PAGE蛋白膠，用蛋白量20～30 μg/孔進行電泳分離。利用電轉儀，400 mA，1 h將蛋白轉印至NC膜上，使用TBS配制5%脫脂牛奶，放置搖床緩慢搖動，室溫封閉1 h。使用對應的一抗4 ℃孵育過夜后，加入熒光二抗室溫孵育2 h。使用雙色紅外激光成像系統(tǒng)檢測熒光二抗的強度以分析蛋白的表達情況。

1.2.7 ShRNA載體構建：通過https://www.sigmaal drich.cn/CN/zh/semi-configu--rators/shrna網(wǎng)站設計針對MGST1的短發(fā)夾干擾序列，MGST1-shRNA1:5′-C-C-CACCTGAATGATCTTGAAA-3′；MGST1-shRNA2:5′-CGCATTCCAGAGGAT-AACCAA-3′。干擾序列在擎科公司合成并進行退火形成雙鏈，利用限制性內切酶EcorⅠ和AgeⅠ切pLKO.1載體37 ℃ 3 h，將退火片段與pLKO.1載體連接，提取質粒并進行測序驗證shRNA的準確性。

1.2.8 慢病毒及細胞系的構建：使用Lipo2000轉染試劑將包裝質粒PMD2G、PSPAX2和目的載體pLKO.1以1∶2∶2轉染進入293FT細胞，8 h后換液，48 h收集培養(yǎng)液上清，將上清0.45 μmol/L濾膜過濾后分裝至1.5 mL EP管，-80 ℃保存。將1×105個細胞鋪在6孔板內待貼壁后，將病毒液和新鮮全培養(yǎng)基以2∶1比例加入6孔板內感染細胞，同時加入1 000×凝聚胺增加感染效率。感染48 h后利用2 μg/mL的嘌呤酶素篩選含抗性的細胞，進行2代的篩選得到細胞系。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 tsc2-/- MEF的抗氧化能力增強

利用生物信息學對WT和tsc2-/-MEFs進行差異表達基因分析，發(fā)現(xiàn)有557個差異基因，其中273個為上調基因，284個為下調基因(圖1A)?；蚋患治?GSEA)發(fā)現(xiàn)tsc2-/-MEFs的氧化還原通路上調(圖1B)。對差異基因進行GO富集分析和KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)多個上調的基因參與細胞還原通路(圖1C，D)，而下調的基因與細胞氧化還原通路無明顯關系(圖1E，F(xiàn))。

2.2 mTOR高活性細胞的抗氧化能力更強

用于誘導細胞產生過量ROS的高劑量亞精胺(spermidine,SPD)[7]處理WT和tsc2-/-MEFs后，WT MEFs產生高濃度ROS，tsc2-/-MEFs的ROS水平則無明顯變化(圖2A)。不同濃度的亞精胺作用細胞后，與WT MEFs相比，tsc2-/-MEFs具有更高的細胞活力 (圖2B)，ROS清除劑乙酰半胱氨酸(acetylcysteine,NAC)可以恢復WT MEFs的細胞活力(圖2C)。

2.3 mTOR活化促進MGST1的表達

通過富集分析選取與氧化還原通路相關的谷胱甘肽代謝通路，并對差異基因進行蛋白質相互作用網(wǎng)絡構建，篩選出參與谷胱甘肽(GSH)代謝通路中的微粒體谷胱甘肽-S-轉移酶(microsomal glutathione S-transferase 1,MGST1)基因(圖3A)?；蛐酒治霭l(fā)現(xiàn)MGST1在tsc2-/-MEFs中顯著上調(圖3B)，q-PCR和Western blot也驗證了這一結論 (圖3C，D)。mTOR抑制劑雷帕霉素處理tsc2-/-MEFs后，無論從mRNA水平還是蛋白水平，MGST1的表達均顯著下降(圖3E，F(xiàn))。

A.differential gene analysis of WT and tsc2-/-MEFs; B.GSEA analysis of redox pathway; C,D.GO and KEGG analysis of upregulated genes; E,F.GO and KEGG analysis of down-regulated genes

A.ROS level of WT and tsc2-/- MEFs by flow cytometry; B.effect of spermidine on WT and tsc2-/- MEFs viability; C.effect of spermidine combined with NAC on WT and tsc2-/- MEF viability; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with WT MEFs group

2.4 下調MGST1降低tsc2-/-MEFs的抗氧化能力

構建MGST1敲低的tsc2-/-MEFs細胞系后，設計的兩條位點特異shRNA均能顯著抑制MGST1的表達水平(圖4A，B)，可用于后續(xù)功能實驗研究。高劑量亞精胺處理后，MGST1敲低的tsc2-/-MEFs的細胞活力更低(圖4C)。同時，MGST1的敲低可以顯著抑制tsc2-/-MEFs的增殖(圖4D)。對The Cancer Genome Atlas (TCGA)數(shù)據(jù)中的肝癌和黑色瘤患者進行生存分析，發(fā)現(xiàn)MGST1高表達的患者生存期低于低表達患者(圖4E)。

3 討論

mTOR作為細胞內能量代謝調節(jié)的樞紐，在多種癌中異常激活，并造成腫瘤細胞蛋白質合成、有氧糖酵解等代謝的增強[8-9]。ROS是細胞代謝過程中不可避免的代謝產物，腫瘤細胞往往表現(xiàn)出升高的ROS水平。高水平的 ROS 對腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移和化療耐藥等具有重要意義，多項研究表明mTOR活化可以通過清除ROS抵抗藥物誘導的細胞凋亡、自噬和鐵死亡等死亡方式造成腫瘤細胞耐藥[10]，但具體的分子機制有待進一步闡明。本研究揭示mTOR的異常活化通過上調MGST1的表達增強細胞的抗氧化能力。

谷胱甘肽(glutathione，GSH)代謝通路是細胞內經(jīng)典的抗氧化通路之一，還原型谷胱甘肽能夠清除掉細胞內的氧自由基以維持細胞內氧化還原的平衡[11]。有研究報道，mTOR可以促進細胞內谷胱甘肽的合成[11]。本研究顯示，與WT MEFs相比，谷胱甘肽代謝通路相關基因的表達在tsc2-/-MEFs普遍上調，進一步提示mTOR的活化通過促進谷胱甘肽代謝增強細胞的抗氧化能力。本研究通過對差異基因進行功能富集和蛋白質相互作用分析篩選出MGST1，該蛋白通過將還原型GSH連接到氧自由基，促進ROS的清除并維持細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)[12]。

A.differentially expressed genes protein-protein interaction networks; B.expression of MGST1 in chip data; C, D.expression of MGST1 mRNA and protein in WT and tsc2-/- MEFs detected by fluorescence quantitative PCR and Western blot; E, F.expression of MGST1 mRNA and protein in tsc2-/- MEFs detected by fluorescence quantitative PCR and Western blot; *P<0.05 compared with control group

本研究發(fā)現(xiàn)，敲低該基因造成tsc2-/-MEFs對ROS誘導的細胞死亡更敏感，說明MGST1在mTOR高活性細胞的抗氧化防御過程中扮演著重要角色。

許多mTOR抑制劑已被批準用于治療人類癌，比如晚期腎細胞癌一線藥物坦羅莫司和腎癌二線藥物依維莫司等。不幸的是，有效治療幾個月或幾年后腫瘤就能對第一代mTOR抑制劑產生耐藥性，而且很可能也會對第二代mTOR抑制劑產生耐藥性[13]。本研究揭示了mTOR活化細胞的耐藥新機制，指出MGST1有可能成為治療mTOR活化耐藥腫瘤的新靶點，為耐藥腫瘤的治療提供新的方向。

A, B.relative MGST1 mRNA and protein expression levels detected by fluorescence quantitative PCR and Western blot; C,D.viability and proliferation detected by CCK8 method; E.survival of mTOR high-expression patients with high or low MGST1 expression in melanoma from TCGA cancer data sets; *P<0.05 compared with control group