基于二代測(cè)序技術(shù)對(duì)非小細(xì)胞肺癌八基因聯(lián)合檢測(cè)的突變分析

譚茜，袁正泉，謝麗云，龔燕飛

(岳陽(yáng)市中心醫(yī)院，湖南 岳陽(yáng) 414000)

肺癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率在所有癌癥中均排首位[1]。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是我國(guó)肺癌的主要病理類型，占肺癌患者總數(shù)的80%～85%。大多數(shù)肺癌患者在早期無(wú)明顯癥狀，初診時(shí)已經(jīng)處于晚期。據(jù)統(tǒng)計(jì)，Ⅲ期肺癌患者的5 年生存率僅為20%[2]。由此可見，晚期肺癌患者的生存率非常低。近年來(lái)由于肺癌驅(qū)動(dòng)基因的研究，對(duì)肺癌患者的治療已進(jìn)入精準(zhǔn)治療的時(shí)代。

通過(guò)基因檢測(cè)技術(shù)，找到肺癌患者相應(yīng)驅(qū)動(dòng)基因，針對(duì)性應(yīng)用靶向治療藥物，使肺癌患者中位生存期明顯延長(zhǎng)，療效得到顯著改善，部分患者甚至可以達(dá)到無(wú)進(jìn)展緩解[3]。二代測(cè)序技術(shù)(NGS)能夠大規(guī)模平行檢測(cè)NSCLC多個(gè)驅(qū)動(dòng)基因，其檢測(cè)通量高、速度快、準(zhǔn)確度高，在探索新的生物標(biāo)志物并靶向識(shí)別特異性基因突變方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，從而有助于臨床制訂個(gè)性化的肺癌靶向治療方案[4]。本研究收集148 例NSCLC患者樣本，在illumina MiseqDX平臺(tái)上平行檢測(cè)肺癌表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)、間變性淋巴瘤激酶(ALK)、鼠類肉瘤濾過(guò)性毒菌(v-raf)致癌同源體B1(BRAF)、酪氨酸激酶受體2(ERBB2)、間質(zhì)-上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子(MET)、ROS肉瘤致癌因子1(ROS1)和轉(zhuǎn)染重排原癌基因(RET)8 個(gè)驅(qū)動(dòng)基因的突變情況，分析其與臨床病理特征間的關(guān)系，探討NGS檢測(cè)技術(shù)對(duì)于治療肺癌的臨床應(yīng)用價(jià)值，為肺癌的個(gè)體化治療提供有力的證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2020年7月—2021年7月148 例NSCLC患者的組織樣本，其中手術(shù)蠟塊18 例，穿刺蠟塊104 例，胸腔積液細(xì)胞蠟塊7 例，新鮮組織19 例。依據(jù)2015版WHO肺癌病理分類標(biāo)準(zhǔn)，肺腺癌134 例，鱗癌13 例，肉瘤樣癌1 例；原發(fā)灶124 例，轉(zhuǎn)移灶17 例，胸腔積液蠟塊7 例。148 例NSCLC患者中，男87 例，女61 例；年齡<60 歲者62 例，年齡≥60 歲者86 例；有吸煙史74 例，無(wú)吸煙史74 例；臨床分期方面，Ⅰ期+Ⅱ期41 例，Ⅲ期+Ⅳ期94 例，分期不明確13 例；原發(fā)灶左肺54 例，右肺70 例，資料不明確者24 例。本研究經(jīng)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且患者均知情同意。

1.2 試劑與儀器

本研究采用廣州燃石基因有限公司的核酸提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，通過(guò)人多基因突變檢測(cè)試劑盒(朗克)進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，測(cè)序分析所用實(shí)驗(yàn)儀器為美國(guó)illumina MiseqDX高通量測(cè)序儀。

1.3 DNA提取和驅(qū)動(dòng)基因測(cè)序

所有樣本采用核酸提取純化試劑盒提取DNA，Qubit定量方法進(jìn)行濃度測(cè)定，電泳法評(píng)估DNA樣本的質(zhì)量。腫瘤細(xì)胞含量≥10%，DNA樣本總量≥30 ng，質(zhì)量為C或C級(jí)以上為合格，合格樣本采用人多基因突變聯(lián)合檢測(cè)試劑盒(朗克)進(jìn)行建庫(kù)，最后在illumina MiseqDX測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0系統(tǒng)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。變量組間比較采用χ2檢驗(yàn)，理論頻數(shù)<5的則采用Fisher確切概率法，所有P值均基于雙向假設(shè)檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 8個(gè)驅(qū)動(dòng)基因突變狀態(tài)

本研究的148 例患者中突變116 例(78.4%)，其中EGFR突變、KRAS突變以及ALK融合的發(fā)生率較高，分別為53.4%(79/148)，10.1%(15/148)，7.4%(11/148)；其他基因BRAF，ERBB2，MET，ROS1和RET突變率較低，分別為2.0%(3/148)，2.0%(3/148)，1.4%(2/148)，1.4%(2/148)和0.7%(1/148)。其中EGFR突變率在女性、不吸煙以及肺腺癌患者中的發(fā)生率明顯高于男性(P<0.001)、吸煙(P<0.001)以及肺鱗癌(P=0.008)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而KRAS突變則在男性、吸煙患者中的發(fā)生率顯著高于女性、不吸煙的肺癌患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。ALK，BRAF，ERBB2，MET，ROS1和RET這6 個(gè)基因的突變率均未發(fā)現(xiàn)與患者性別、年齡、吸煙史、組織分型以及臨床分期等存在相關(guān)性(見表1)。

2.2 EGFR基因各位點(diǎn)突變情況

本研究中EGFR基因突變79 例(53.4%)，突變頻率最高，其中包含65 例單點(diǎn)突變，14 例雙點(diǎn)突變。單點(diǎn)突變類型中，以19Del的突變例數(shù)最多(39 例)，其次為L(zhǎng)858R突變(22 例)。另外雙點(diǎn)突變中有6 例伴隨T790M耐藥突變(見表2)，這類患者服用EGFR-TKI靶向藥物后的療效以及預(yù)后有限。

2.3 雙位點(diǎn)共變異情況

在檢出突變的116 例樣本中，存在雙位點(diǎn)共變異現(xiàn)象21 例(見表2)。其中，雙基因共變異3 例，包括ERBB2/KRAS基因突變1 例，EGFR 19Del/KRAS基因突變1 例，EGFR 19Del/ROS1-SDC4融合1 例。EGFR 19Del/ROS1-SDC4融合仍然可以采用相應(yīng)的靶向藥物進(jìn)行治療，而KRAS/EGFR和KRAS/ERBB2共突變患者對(duì)EGFR-TKIs藥物不敏感。

2.4 不同樣本類型驅(qū)動(dòng)基因突變檢出率

原發(fā)灶的突變檢出率為79.0%(98/124)，轉(zhuǎn)移灶的突變檢出率為82.4%(14/17)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)。在不同樣本類型中，新鮮組織、穿刺蠟塊、手術(shù)蠟塊、細(xì)胞蠟塊的突變檢出率依次是89.5%，74.0%，100.0%及57.1%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表3)。

表1 148 例非小細(xì)胞肺癌患者的8 個(gè)驅(qū)動(dòng)基因突變者的臨床特征單位：例(%)

3 討 論

迄今為止，肺癌仍然是中國(guó)甚至世界范圍內(nèi)癌癥死亡的主要原因，并且病死率逐年上升。臨床上，超過(guò)60%的肺癌晚期患者無(wú)法進(jìn)行手術(shù)治療，預(yù)后較差[5]，嚴(yán)重影響晚期肺癌患者的生存率。隨著針對(duì)特定驅(qū)動(dòng)基因改變的靶向治療的出現(xiàn)，肺癌的精準(zhǔn)治療獲得了新的發(fā)展。二代測(cè)序技術(shù)能夠通過(guò)檢測(cè)驅(qū)動(dòng)基因，予以肺癌患者針對(duì)性的治療干預(yù)，如表皮生長(zhǎng)因子受體-酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)(克唑替尼、奧希替尼)等，從而延緩疾病進(jìn)展、延長(zhǎng)生存時(shí)間、改善生活質(zhì)量[6]?；诙鷾y(cè)序技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)NSCLC中8 個(gè)驅(qū)動(dòng)基因的變異情況，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，節(jié)省了腫瘤組織標(biāo)本，能夠?qū)Χ喾N基因突變同時(shí)進(jìn)行高精度和高靈敏度的篩選，例如單/多核苷酸的突變、小基因與大基因的插入和缺失、拷貝數(shù)擴(kuò)增和基因融合等[7]。本研究148 例NSCLC患者中，各驅(qū)動(dòng)基因檢測(cè)EGFR突變陽(yáng)性率為53.4%，KRAS陽(yáng)性率為10.1%，ALK為7.4%，RBB2，BRAF，MET，ROS1和RET陽(yáng)性率較低，分別為2.0%，2.0%，1.4%，1.4%和0.7%，符合既往報(bào)道[8]。在EGFR突變的NSCLC中，突變類型多樣，其中最常見的突變類型是19號(hào)外顯子缺失和21號(hào)外顯子L858R突變，與既往研究報(bào)道一致[9]。在EGFR突變?nèi)后w中，EGFR在不吸煙的女性患者中突變率較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，與既往研究結(jié)果相近[10]。研究表明[11]，EGFR突變與EGFR-TKI(如吉非替尼、厄洛替尼等)的臨床療效有一定的相關(guān)性，尤其對(duì)于晚期NSCLC患者的治療，療效令人矚目。雖然EGFR-TKI對(duì)攜帶20號(hào)外顯子突變的NSCLC患者敏感性低于常見的19號(hào)和21號(hào)外顯子突變，存在異質(zhì)性，但是相對(duì)于傳統(tǒng)的化療，靶向治療仍然具有比較大的優(yōu)勢(shì)。在本次研究中，有6 例EGFR 19Del和L858R突變的患者同時(shí)出現(xiàn)T790M的耐藥性突變，因此，這類患者在使用一代或二代EGFR-TKI的治療過(guò)程中，臨床效果不顯著，其無(wú)進(jìn)展生存期(PFS)明顯低于只有19Del和L858R的患者[12]。本研究顯示，與KRAS野生型相比，KRAS突變主要發(fā)生在肺腺癌、有吸煙史的男性患者中，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，符合既往研究報(bào)道[8]。KRAS基因突變可導(dǎo)致對(duì)TKI原發(fā)耐藥，是晚期NSCLC患者預(yù)后的不利因素，因此攜帶KRAS突變的NSCLC患者是免疫治療相對(duì)獲益人群[13]。ALK融合是NSCLC中繼EGFR突變之后第二個(gè)明確可用藥的腫瘤驅(qū)動(dòng)基因，多見于男性肺腺癌患者，并且在不吸煙的年輕患者中發(fā)生率較高，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ALK-EML4融合基因是肺腺癌患者ALK融合的主要類型，攜帶ALK融合的NSCLC對(duì)多種酪氨酸激酶抑制劑敏感，可推薦使用克唑替尼或第二代ALK抑制劑塞瑞替尼等靶向藥[14]。

表2 NSCLC患者8 個(gè)基因檢測(cè)雙位點(diǎn)共變異類型及比例

表3 不同樣本類型突變基因突變檢出率單位：例(%)

在本研究中，有3 例NSCLC患者存在2個(gè)基因突變共存現(xiàn)象，分別是EGFR 19Del/KRAS，KRAS/ERBB2共突變以及EGFR 19Del/ROS1融合共存。既往研究報(bào)道[15]EGFR突變合并ALK融合的患者TKI療效與單基因突變患者相比更差，但仍優(yōu)于化療，因此，聯(lián)合使用EGFR抑制劑和ALK融合抑制劑可能是一種有效的治療方法。由此猜想，與EGFR單基因突變患者相比，EGFR突變合并ROS1融合的患者使用TKI的療效較差。而EGFR或ERBB2合并KRAS突變時(shí)，使用EGFR抑制劑療效不佳。另外，聯(lián)合突變是否比單一突變患者的預(yù)后更差尚不清楚。因此，多基因共存突變的發(fā)生機(jī)制以及在腫瘤中作用機(jī)制的研究仍具有很大的挑戰(zhàn)性。同時(shí)，我們對(duì)原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶以及不同樣本類型之間驅(qū)動(dòng)基因突變檢出率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)(見表3)，發(fā)現(xiàn)原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中的突變檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的組織標(biāo)本均可用于肺癌驅(qū)動(dòng)基因突變的檢測(cè)[16]。但是，在不同取材方法之間驅(qū)動(dòng)基因的檢出率卻存在差異(P<0.05)(見表3)。穿刺蠟塊檢出率偏低可能與樣本質(zhì)量、腫瘤細(xì)胞含量及腫瘤異質(zhì)性等相關(guān)?？偠灾?，NGS基因檢測(cè)技術(shù)在肺癌基因檢測(cè)中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可對(duì)多個(gè)樣本類型的DNA進(jìn)行準(zhǔn)確的腫瘤驅(qū)動(dòng)基因突變檢測(cè)，指導(dǎo)晚期NSCLC的治療，但是在質(zhì)量評(píng)估和腫瘤細(xì)胞含量這些質(zhì)控環(huán)節(jié)需嚴(yán)格把控，方能提高突變基因檢出率，避免假陰性。

總而言之，NGS基因檢測(cè)技術(shù)在肺癌基因檢測(cè)中有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，具有極高的靈敏度與特異性，能夠幫助臨床全面了解腫瘤突變情況，對(duì)NSCLC患者實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)個(gè)性化治療，從而使更多的肺癌患者從靶向治療中獲益。