基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討桂枝茯苓丸治療冠心病的作用機制

代澤陽

成都市龍泉驛區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，四川 成都 610100

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(簡稱冠心病)，該病的發(fā)生進展涉及多種危險因素，因此需聯(lián)合運用抗血小板、穩(wěn)定斑塊、拮抗心肌重構(gòu)、調(diào)節(jié)心肌能量代謝等藥物策略進行防治[1-2]。中醫(yī)學(xué)將冠心病歸屬于“胸痹心痛”范疇，本虛標(biāo)實貫穿疾病的始終，本虛以氣虛、陰虛為主；標(biāo)實以血瘀、痰濁、氣滯多見[3]。

中醫(yī)經(jīng)典名方桂枝茯苓丸由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、赤芍等組成，載于張仲景的《金匱要略》，《金匱要略·婦人雜病脈證并治》曰：“婦人宿有癥病，經(jīng)斷未及三月……當(dāng)下其癥，桂枝茯苓丸主之?！狈街泄鹬亟?jīng)通脈，茯苓健脾祛痰，牡丹皮涼血活血，桃仁活血祛瘀，赤芍散瘀止痛。諸藥合用，共奏溫經(jīng)、通絡(luò)、活血、化瘀、消癥之功，臨床多用于治療子宮肌瘤、卵巢囊腫、子宮內(nèi)膜異位癥、盆腔炎、痛經(jīng)、前列腺增生等疾病[4]。

基于中醫(yī)異病同治、治病求本理論，有文獻報道桂枝茯苓丸能改善心肌微循環(huán)，治療冠心病療效確切[5-7]。但桂枝茯苓丸治療冠心病的機制研究較少，本文運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討桂枝茯苓丸治療冠心病的作用機制，為后續(xù)深入研究提供參考和依據(jù)。

1 方法

1.1 收集桂枝茯苓丸有效成分及靶點基因通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(https：//tcmspw.com/index.php)收集桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、赤芍已知成分。在檢索結(jié)果中以口服利用度[8](oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性[9](drug-likeness，DL)≥0.18為條件，篩選出桂枝茯苓丸的有效成分。在TCMSP中對上述結(jié)果進行搜索匹配，得到有效成分的靶點蛋白，將靶點蛋白輸入Uniprot(https：//www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫，并將種屬選為“Homo sapiens”，檢索得到桂枝茯苓丸的標(biāo)準(zhǔn)靶點基因。

1.2 桂枝茯苓丸治療冠心病潛在靶點的篩選以關(guān)鍵詞“coronary heart disease”在GeneCards(https：//www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫中進行檢索，獲取冠心病相關(guān)靶點并加以整理。將桂枝茯苓丸靶點和冠心病靶點導(dǎo)入Draw Venny Diagram在線程序(http：// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)取交集獲得藥物與疾病共同靶點，此集合為桂枝茯苓丸治療冠心病的潛在靶點。

1.3 藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖繪制將桂枝茯苓丸有效成分、潛在靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件繪制藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。其中節(jié)點(node)代表藥物、有效成分、潛在靶點；邊(edge)連接藥物、有效成分與靶點，展現(xiàn)相互作用關(guān)系。

1.4 核心網(wǎng)絡(luò)分析運用Cytoscape 3.7.2軟件中Bisogenet、CytoNCA插件對潛在靶點構(gòu)建蛋白相互作用(protein protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)分析、拓撲分析，構(gòu)建核心網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)篩選得到核心靶點，以分析桂枝茯苓丸有效成分治療冠心病的作用靶點。

1.5 GO功能和KEGG富集分析將核心靶點導(dǎo)入Hiplot在線作圖工具(https：//hiplot.com.cn/advance/clusterprofiler-go-kegg)，以P<0.05為條件進行GO功能、KEGG通路富集分析，其中GO功能分析包括生物進程(biological process，BP)、細胞組分(cell component，CC)和分子功能(molecular functions，MF)。用氣泡圖形式展示分析結(jié)果，以探究桂枝茯苓丸治療冠心病可能的作用機制。

2 結(jié)果

2.1 桂枝茯苓丸的有效成分、靶點基因收集和整理在TCMSP中檢索桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、赤芍的有效成分，根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18為條件進行篩選，去重后得到包含作用靶點的有效成分43個，見表1。將有效成分對應(yīng)靶點蛋白通過Uniprot數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換為人類基因名，經(jīng)去重后共獲得210個標(biāo)準(zhǔn)靶點基因。

2.2 桂枝茯苓丸治療冠心病潛在靶點篩選在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索關(guān)鍵詞“coronary heart diseases”，共得到7 100個相關(guān)基因。使用Draw Venny Diagram在線程序?qū)⒐谛牟∠嚓P(guān)且關(guān)聯(lián)分數(shù)≥19.71共889個基因，與桂枝茯苓丸210個靶點基因取交集，最終獲得89個潛在靶點，見圖1。

2.3 藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建使用Cytoscape 3.7.2軟件繪制桂枝茯苓丸治療冠心病“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，其中包含284條邊、126個節(jié)點，見圖2。度值越大，節(jié)點形狀越大、作用越關(guān)鍵，該圖直觀反映了桂枝茯苓丸是通過多成分、多靶點治療冠心病。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，43個有效成分通過89個靶點對冠心病起到直接調(diào)控作用，其中25個成分單獨或共同作用于PTGS2、PTGS1、PRKACA、NR3C2、ESR1、CASP3、BCL2、ADRB2、PDE3A、CN5A、PPARG等靶點。圖2中度值排名靠前的活性成分依次為槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、(+)-兒茶素、黃芩素，這些認為是桂枝茯苓丸治療冠心病的核心成分。由此可見，中藥治療疾病具有多成分、多靶點的特點。

表1 桂枝茯苓丸43個有效成分收集結(jié)果

圖1 桂枝茯苓丸-冠心病韋恩圖

注：黃色圓形表示藥物；藍色六邊形表示成分；綠色菱形表示潛在靶點；邊表示它們之間的相互作用圖2 桂枝茯苓丸治療冠心病的“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析、核心靶點篩選以潛在靶點為基礎(chǔ)利用Cytoscape中Bisogenet插件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)；采用CytoNCA插件進行拓撲分析和核心網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，一級子網(wǎng)絡(luò)篩選條件：Degree≥29，二級子網(wǎng)絡(luò)(核心網(wǎng)絡(luò))篩選條件：Degree≥221、局部平均連通度(local average connectivity,LAC)≥26.469、Betweenness≥12 319.327、Closeness Centrality≥0.463，共獲得70個核心靶點基因，見圖3。依照Degree值由大到小排序，展示排名前10位的靶點，見表2。

圖3 桂枝茯苓丸治療冠心病的PPI 網(wǎng)絡(luò)核心靶點篩選示意圖

表2 排名前10位的核心靶點

2.5 GO功能和KEGG富集分析將70個核心靶點基因?qū)際iplot在線作圖工具，以P<0.05進行GO功能、KEGG通路富集分析。選取GO功能分析中前10條通路繪制氣泡圖，見圖4。結(jié)果顯示：BP主要涉及細胞代謝、生長、分化、凋亡等；MF主要涉及泛素蛋白連接酶結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子激活、鈣黏蛋白結(jié)合、組蛋白脫乙?；附Y(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、受損DNA結(jié)合、無序域特異性結(jié)合、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、MHCⅡ蛋白復(fù)合物結(jié)合；CC主要涉及黏著斑、細胞基質(zhì)結(jié)合、囊腔等。

選取KEGG通路富集分析中前20條通路，見圖4，發(fā)現(xiàn)核心基因主要富集于PI3K-Akt、FoxO、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、Notch、癌癥中的microRNA、甲狀腺激素、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工等信號通路。

圖4 桂枝茯苓丸治療冠心病的GO功能和KEGG富集分析氣泡圖

3 討論

本研究篩選出桂枝茯苓丸共43個有效成分，210個藥物靶基因與889個疾病靶基因相映射，得到包括功能酶、信號分子、轉(zhuǎn)錄因子等89個潛在靶點。由此可見，桂枝茯苓丸主要通過調(diào)控89個潛在靶點干預(yù)機體多種生物進程、多條信號通路來治療冠心病，并抑制其進展為急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)。對冠心病有調(diào)控作用的主要有效成分包括槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、(+)-兒茶素、黃芩素等。研究顯示，槲皮素通過影響血管細胞增殖、抑制炎癥反應(yīng)途徑拮抗動脈粥樣硬化[10]，也能減輕心肌缺血再灌注損傷。β-谷甾醇具有調(diào)節(jié)血脂、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、抗炎等作用[11]。山柰酚具有抗氧化應(yīng)激活性，可降低血管炎癥反應(yīng)、防止動脈粥樣硬化發(fā)生、抑制心肌細胞凋亡[12]。兒茶素能抑制腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、CRP、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)等炎癥介質(zhì)、下調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor kappa beta,NF-κB)表達，對冠心病模型大鼠有保護作用[13]。黃芩素對發(fā)生缺血、缺氧損傷的心肌具有保護作用[14]。

通過KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，核心基因主要顯著富集于PI3K-Akt、FoxO、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、Notch、癌癥中的microRNA、甲狀腺激素、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工等信號通路。以PI3K-Akt信號通路最為重要，該通路被激活，關(guān)鍵蛋白Akt將從細胞膜轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)和細胞核，通過磷酸化抑制或增強靶蛋白活性，進而調(diào)節(jié)下游信號通路，參與調(diào)節(jié)細胞代謝、增殖、存活及血管生成等。例如，冠心病患者重要危險因素和治療目標(biāo)是血脂中低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)水平[15]。血管內(nèi)皮下的LDL能被修飾成氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，Ox-LDL)。Ox-LDL可抑制PI3K/Akt/eNOS信號通路中Akt和eNOS磷酸化，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷、血小板聚集、單核細胞浸潤、泡沫細胞形成，構(gòu)成動脈粥樣硬化斑塊的脂質(zhì)核心、促進動脈粥樣硬化斑塊形成[16]。而Akt能激活eNOS促進一氧化氮生成，產(chǎn)生抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗纖維化、抑制血小板活性、擴張冠狀動脈等生物學(xué)效應(yīng)[17]；Akt能激活mTOR抑制細胞自噬進程，抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，誘導(dǎo)巨噬細胞自噬，減少巨噬細胞對斑塊的浸潤，穩(wěn)定動脈粥樣硬化易損斑塊[18]，預(yù)防ACS發(fā)生。Akt還能夠磷酸化IKK調(diào)節(jié)NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抑制促凋亡蛋白Bad調(diào)控細胞存活、抑制CDK影響細胞增殖。PI3K-Akt信號通路也是FoxO轉(zhuǎn)錄因子的主要上游通路，F(xiàn)oxO轉(zhuǎn)錄的基因能夠調(diào)控細胞周期、誘導(dǎo)細胞凋亡、抵抗氧化應(yīng)激、促進DNA修復(fù)等[19]。研究表明，F(xiàn)oxO信號通路參與拮抗心肌纖維化、減輕心臟缺血再灌注損傷[20]。此外，泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路能抗氧化、抗炎、降解細胞周期相關(guān)蛋白質(zhì)、抑制血管內(nèi)膜增生、誘導(dǎo)血管平滑肌細胞凋亡、防止動脈粥樣硬化進展[21]。Notch信號通路參與細胞增殖、分化、凋亡，能通過拮抗心肌纖維化、抑制炎性反應(yīng)抗動脈粥樣硬化，還能抑制平滑肌細胞過度增殖、穩(wěn)定粥樣硬化斑塊[22]。癌癥中的microRNA通路關(guān)聯(lián)動脈粥樣硬化病理過程[23]。甲狀腺激素信號通路涉及拮抗心肌重構(gòu)、調(diào)節(jié)促動脈粥樣硬化和抗動脈粥樣硬化過程[24]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工通路調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，干預(yù)動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，調(diào)控血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞及巨噬細胞活性、凋亡[25]。因此，桂枝茯苓丸通過介導(dǎo)細胞增殖凋亡、細胞分解、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等治療冠心病、防止其進展為ACS。

冠心病是由環(huán)境、基因共同作用的復(fù)雜疾病，需要采取多種措施進行防治。桂枝茯苓丸能由拮抗動脈粥樣硬化、穩(wěn)定粥樣硬化斑塊、改善心肌缺血缺氧、抑制心肌纖維化等方面治療冠心病、防止其進展為ACS，這與冠心病病理生理過程和中醫(yī)異病同治、治病求本思想相符。綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法論證了桂枝茯苓丸是通過多成分、多靶點、多通路治療冠心病，為桂枝茯苓丸治療冠心病進一步研究奠定基礎(chǔ)，也為擴展中醫(yī)經(jīng)典方劑臨床運用提供參考。由于檢索數(shù)據(jù)庫有限、分析不全面等主客觀因素的存在，使該研究存在一定局限性，仍需進行深入研究。