艾草和竊衣?lián)]發(fā)物的提取鑒定及其對煙粉虱MED隱種成蟲選擇性的影響

徐會男, 穆 揚, 張戰(zhàn)泓, 張 卓, 張德詠, 譚新球,史曉斌, *, 劉 勇, *

(1. 湖南大學(xué)研究生院隆平分院, 長沙 410125; 2. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所, 長沙 410125;3. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所, 長沙 410125)

煙粉虱Bemisiatabaci屬于半翅目(Hemiptera)粉虱科(Aleyrodidae)，危害多種作物，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴重的經(jīng)濟損失(Tayetal., 2017; Kanakala and Ghanim, 2019)。煙粉虱主要通過取食植物汁液、分泌蜜露造成煤污病、傳播植物病毒等方式危害農(nóng)作物(Oliveiraetal., 2001; 王雨蒙等, 2020)。煙粉虱體表有蠟粉，繁殖速率快，抗性發(fā)展迅速，目前已對一些殺蟲劑產(chǎn)生了一定的抗藥性，使得利用化學(xué)方法防治煙粉虱的效率大大降低；近年來，根據(jù)“推-拉”策略對煙粉虱進行綠色防治的方法引起了人們極大的關(guān)注(Cooketal., 2007; 朱鋮培, 2008; Zhengetal., 2021)。

植物釋放的揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)在植食性昆蟲和植物的通訊系統(tǒng)中發(fā)揮主要的作用，植食性昆蟲往往被寄主植物揮發(fā)物吸引(Webster, 2012)，如：煙粉虱MED隱種雌、雄蟲都能顯著地被0.01和0.0001 μL/μL的芳樟醇、反-2-己烯醛和桉樹腦吸引(李姝等, 2016)；檸檬烯是橄欖Canariumalbum的主要成分，其釋放量越多，橄欖果蠅Bactroceraoleae對橄欖的危害程度就越大(Malheiroetal., 2016)。另外，植物揮發(fā)物也是植物防御昆蟲的重要武器，非寄主植物往往能釋放揮發(fā)性物質(zhì)使昆蟲躲避和遠離，如：北艾Artemisiavulgaris和遼東蒿Artemisiaverbenacea釋放的揮發(fā)性物質(zhì)能夠顯著驅(qū)避和毒殺菊姬長管蚜Macrosiphoniellasanborni，使得蚜蟲對北艾、遼東蒿的取食選擇率均僅有16.7%(劉陳瑋等, 2019)；從竊衣Torilisscabra中提取的植物精油能顯著驅(qū)避赤擬谷盜Triboliumcastaneum，在含量為1.6 nL/cm2時，竊衣植物精油對赤擬谷盜的驅(qū)避率高達74%(趙娜娜等, 2019)。

利用揮發(fā)物的特性并根據(jù)“推-拉”策略對煙粉虱進行誘集或驅(qū)避已經(jīng)成為防治煙粉虱的一項重要措施。例如，寄主植物反枝莧Amaranthusretroflexus對煙粉虱具有明顯的誘集作用，在辣椒Capsicumannuum的主要生長期，采用集中式種植反枝莧后，對煙粉虱成蟲和成蟲產(chǎn)卵的誘集效果分別高達88.88%和94.2%(李秋榮等, 2019)。蓖麻Ricinuscommunis對煙粉虱具有明顯的驅(qū)避作用，經(jīng)蓖麻葉片粗提物處理的番茄Solanumlycopersicum上，煙粉虱的成蟲迅速減少，處理1 d和2 d后蟲口減退率分別達到45.61%和56.25%(趙斌等, 2010)。

田間作物收獲后，雜草易助長蟲害發(fā)生，并作為病毒傳播的重要中間寄主(Kiletal., 2015; Orfanidouetal., 2016; Tangetal., 2017)。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)艾草Artemisiaargyi和竊衣有較強吸引和驅(qū)避昆蟲的作用。然而艾草和竊衣及其揮發(fā)物對煙粉虱MED隱種成蟲的作用還未見有研究報道。為了更好地利用艾草和竊衣及其揮發(fā)物對煙粉虱MED隱種成蟲實施綠色防控，本研究通過Y型嗅覺儀和四臂嗅覺儀分別測定了煙粉虱MED隱種成蟲對艾草和竊衣的嗅覺反應(yīng)和選擇性，并利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(GC-MS)對其揮發(fā)物成分進行鑒定分析,最后通過Y型嗅覺儀檢測了艾草葉片中的主要揮發(fā)物α-可巴烯(α-copaene)和竊衣葉片中的主要揮發(fā)物環(huán)己烯(cyclohexene)對煙粉虱MED隱種成蟲的作用，以期利用艾草和竊衣的揮發(fā)物開發(fā)食誘劑或驅(qū)避劑，為煙粉虱MED隱種成蟲的防控提供新技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲與植物

實驗用蟲為煙粉虱MED隱種成蟲，取自湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，飼養(yǎng)于研究所溫室的棉花植株上。溫室條件：平均溫度為26℃±2℃，相對濕度為70%±5%，光周期為14L∶10D。

竊衣、艾草取自湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草地上；氣候條件：平均溫度為27℃±2℃，相對濕度為85%±5%。番茄植株(鉆紅美娜)和黃瓜Cucumissativus植物(長春密刺)種植于湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所；溫室條件：平均溫度為26℃±2℃，相對濕度為70%±5%，光周期為14L∶10D。

1.2 煙粉虱MED隱種成蟲對4種植物的選擇性測定

采用四臂嗅覺儀(上海賀帆儀器有限公司，上海)測定，其中Φ150 mm，深度30 mm，總厚度80 mm。四臂嗅覺儀置于暗室，室溫為26℃±2℃，氣流通過空氣泵進入氣口，經(jīng)過洗氣瓶去除雜質(zhì)，并經(jīng)過活性炭干燥，氣流流速控制在300 mL/min。選取長勢一致的番茄、黃瓜、艾草和竊衣幼苗，放入四臂嗅覺儀的4個味源瓶內(nèi)，打開氣閥通氣4 h后，取饑餓處理2 h的煙粉虱MED隱種成蟲約100頭放入四臂嗅覺儀管口處，迅速關(guān)上管蓋，待2/3煙粉虱選擇完畢后，記錄下嗅覺儀各誘集瓶內(nèi)煙粉虱的數(shù)量，煙粉虱進入誘集瓶即做出選擇，沒有進入各誘集瓶即為未做出選擇。每組試驗重復(fù)4次。

1.3 煙粉虱MED隱種成蟲對艾草和竊衣的嗅覺反應(yīng)測定

用Y型嗅覺儀(上海賀帆儀器有限公司，上海)分別測定煙粉虱對艾草和竊衣的嗅覺反應(yīng)，其中支臂長20 cm、主臂長8 cm、支臂夾角為60°、管內(nèi)徑2 cm。選取長勢一致的艾草和竊衣幼苗，分別放入Y型嗅覺儀的味源瓶內(nèi)，Y型嗅覺儀的另一端是空白對照，兩臂的氣流流速控制在300 mL/min。用錫箔紙將Y型管全部包住，防止光源不均勻影響煙粉虱的選擇。通氣4 h后，取饑餓處理2 h的煙粉虱MED隱種成蟲約100頭放入Y型管底部，迅速關(guān)上管蓋，待2/3煙粉虱選擇完畢后，觀察并記錄下煙粉虱選擇數(shù)，煙粉虱進入到管2/3處即做出選擇，沒有進入各管即為未做出選擇。每次試驗后，用乙醇溶液和清水將Y型管清洗干凈，烘箱烘干至無水滴狀態(tài)。試驗重復(fù)6次。

1.4 植物揮發(fā)物的提取及鑒定

艾草及竊衣葉片揮發(fā)物的提?。悍謩e采集0.1 g艾草和竊衣的葉片，分別研磨后加入1.5 mL正己烷(色譜純)。離心后取上清用于氣相-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)GC-MS鑒定。

GC條件：進樣口溫度240℃；程序升溫：初始柱溫50℃，保持1 min；然后以5℃/min升溫至240℃，保持2 min；以30℃/min升溫至300℃，保持5 min。

MS條件：EI離子源，電離能量70 eV，溫度300℃；四級桿溫度150℃；質(zhì)量掃描范圍：50～650m/z，掃描速度為0.5 scans/s。

整個實驗重復(fù)9次，經(jīng)GC-MS分析得到的所有化合物的質(zhì)譜圖均采用峰面積歸一法處理及NIST數(shù)據(jù)庫匹配分析。

1.5 煙粉虱MED隱種成蟲對艾草、竊衣葉片主要揮發(fā)物的嗅覺反應(yīng)測定

將α-可巴烯、環(huán)己烯、β-姜黃烯、6,6-二甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚烷-2-羧醛和茨醇標準品(購自壇墨質(zhì)檢有限公司，北京)用色譜純正己烷作為溶劑，配制成濃度為100 μg/L的樣品。取10 mL揮發(fā)物樣品放入一個味源瓶內(nèi)，另一個味源瓶以正己烷為對照，兩臂的氣流流速控制在300 mL/min。用錫箔紙將Y型管全部包住。通氣2 h后，取饑餓2 h后的煙粉虱MED隱種成蟲約100頭從Y型管豎直管口放入，待2/3煙粉虱選擇完畢后，觀察Y型管兩臂的煙粉虱數(shù)量并記錄下數(shù)量。每次試驗后，將Y型管用乙醇溶液和清水清洗干凈，烘干至無水滴狀態(tài)。試驗重復(fù)6次。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用IBM SPSS Statistics 21進行數(shù)據(jù)分析。比較煙粉虱MED隱種成蟲對4種不同植物選擇性的數(shù)據(jù)采用one-way ANOVA方差分析，并用Duncan氏多重比較進行差異顯著性分析，顯著水平設(shè)為P<0.05；煙粉虱MED隱種成蟲對艾草和竊衣及其揮發(fā)物α-可巴烯和環(huán)己烯的嗅覺反應(yīng)數(shù)據(jù)采用t檢驗進行差異性分析，顯著和極顯著分別設(shè)為P<0.05和P<0.01。作圖采用GraphPad Prism 7。

2 結(jié)果

2.1 煙粉虱MED隱種成蟲對4種植物的選擇性

煙粉虱MED隱種成蟲對4種植物的選擇性存在差異，其中對艾草和竊衣的選擇數(shù)(分別為16頭和9頭)顯著少于選擇番茄和黃瓜的數(shù)量(分別為22頭和21頭)，對艾草的選擇數(shù)顯著多于對竊衣的選擇數(shù)(F3, 15=3.906,P<0.05)(圖1)。這些結(jié)果表明，煙粉虱MED隱種成蟲對艾草的嗅覺反應(yīng)顯著小于對番茄和黃瓜的嗅覺反應(yīng)，顯著大于對竊衣的嗅覺反應(yīng)。

圖1 煙粉虱MED隱種成蟲對4種植物的選擇性

2.2 煙粉虱MED隱種成蟲分別對艾草和竊衣的嗅覺反應(yīng)

煙粉虱MED隱種成蟲對艾草和竊衣的嗅覺反應(yīng)結(jié)果顯示，煙粉虱MED隱種成蟲對艾草的選擇數(shù)量(60頭)極顯著多于對空白對照的選擇數(shù)量(22頭)(F1, 11=292.703,P<0.01)；煙粉虱MED隱種成蟲對竊衣的選擇數(shù)量(22頭)極顯著少于對空白對照的選擇數(shù)量(55頭)(F1, 11=320.736,P<0.01)(圖2)。這些結(jié)果表明,艾草對煙粉虱MED隱種成蟲有較強的吸引作用，而竊衣對煙粉虱MED隱種成蟲有較強的驅(qū)避作用。

圖2 煙粉虱MED隱種成蟲對艾草和竊衣的嗅覺反應(yīng)

2.3 艾草和竊衣葉片揮發(fā)物成分含量

艾草和竊衣葉片中各組分揮發(fā)物成分見表1和表2。經(jīng)GC-MS鑒定，艾草葉片中的揮發(fā)物有14種，竊衣葉片中的揮發(fā)物有16種。艾草葉片中揮發(fā)物主要為烯類物質(zhì)，占總含量的74.2%。竊衣葉片中揮發(fā)物成分主要是烯類和醇類物質(zhì)，烯類物質(zhì)占總含量的40.9%，醇類物質(zhì)占總含量的29.1%。本研究中含量大于10%的視為主要成分。艾草揮發(fā)物中的主要成分為α-可巴烯(12.0%)、(E)-β-金合歡烯(11.8%)、β-姜黃烯(11.8%)、2,6-二甲基-2,4,6-羅勒烯(11.7%)、葉綠醇(10.9%)、4-甲基-4-環(huán)己烯-1,2-二羧酸(11.4%)、β-依蘭烯(10.0%)。 竊衣?lián)]發(fā)物中的主要成分為環(huán)己烯(13.7%)、6,6-二甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚烷-2-羧醛(13.5%)、茨醇(13.3%)。

表1 艾草葉片揮發(fā)物成分和相對含量

表2 竊衣葉片揮發(fā)物成分和相對含量

2.4 煙粉虱MED隱種成蟲對艾草和竊衣主要揮發(fā)物的嗅覺反應(yīng)

煙粉虱MED隱種成蟲對1 μg/L α-可巴烯的嗅覺反應(yīng)實驗結(jié)果顯示，選擇α-可巴烯的煙粉虱MED隱種成蟲數(shù)量(60頭)極顯著多于選擇對照的數(shù)量(24頭)(F1, 11=64.614,P<0.01)(圖3)。煙粉虱MED隱種成蟲對 1 μg/L 環(huán)己烯的嗅覺反應(yīng)實驗結(jié)果顯示，選擇環(huán)己烯的頭數(shù)(20頭)極顯著少于選擇對照的頭數(shù)(62頭)(F1, 11=172.941,P<0.01)(圖3)。

圖3 煙粉虱MED隱種成蟲對1 μg/L環(huán)己烯和α-可巴烯的嗅覺反應(yīng)

3 結(jié)論與討論

寄主植物釋放的揮發(fā)性物質(zhì)在昆蟲識別和選擇寄主中發(fā)揮著重要的作用(Fleischeretal., 2018; Scott, 2018)。由于不同寄主植物揮發(fā)性物質(zhì)成分和含量的不同，同一種昆蟲對不同植物的嗅覺反應(yīng)也有所不同。例如，寄主植物洋桔梗Eustomagrandiflorum、杜鵑Rhododendronsimsii、百合Liliumbrowmii和菊花Dendranthemamorifolium的揮發(fā)物成分不同，黃胸薊馬Thripshawaiiensis對這4種植物的趨向性也有所不同，嗅覺反應(yīng)依次為洋桔梗>杜鵑>百合>菊花(曹宇等, 2020)。本研究在測定煙粉虱MED隱種成蟲對番茄、黃瓜、艾草、竊衣的行為趨向試驗中發(fā)現(xiàn)，煙粉虱MED隱種成蟲對艾草的趨向反應(yīng)小于對番茄和黃瓜的，大于對竊衣的(圖1)。已有多篇文獻報道番茄和黃瓜是煙粉虱的嗜好寄主(Tianetal., 2020; Gorayebetal., 2021)，根據(jù)本研究結(jié)果可以推測，黃瓜和番茄中的吸引性揮發(fā)性物質(zhì)多于艾草和竊衣中的吸引性揮發(fā)物質(zhì)，艾草中的吸引性揮發(fā)物質(zhì)多于竊衣中的吸引性揮發(fā)物質(zhì)；也有可能是艾草和竊衣中的驅(qū)避性揮發(fā)物質(zhì)多于黃瓜和番茄中的，竊衣中的驅(qū)避成分多于艾草中的。

本研究通過Y型嗅覺儀對煙粉虱MED隱種成蟲進行行為趨向測試，結(jié)果顯示煙粉虱MED隱種成蟲對艾草的選擇數(shù)極顯著多于對對照組的選擇數(shù)(圖2)，說明艾草對煙粉虱MED隱種成蟲有較強的吸引作用。該結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)艾草對煙粉虱MED隱種成蟲有吸引作用，這與文獻發(fā)現(xiàn)艾草具有驅(qū)避昆蟲的作用(Ahmedetal., 2020; 廖應(yīng)江, 2020)不一致，有可能是由于季節(jié)和氣候的不同導(dǎo)致艾草中的揮發(fā)物的不同(許再福, 2000; Lietal., 2020)?？赡茉谝恍┨囟ǖ臅r期，艾草中釋放的某些揮發(fā)性物質(zhì)對煙粉虱MED隱種成蟲有強烈的吸引作用，這時的吸引作用大于驅(qū)避作用；而在另外一些時期，艾草中釋放的驅(qū)避性揮發(fā)物增多，導(dǎo)致艾草產(chǎn)生驅(qū)避作用。煙粉虱MED隱種成蟲對竊衣的選擇性試驗結(jié)果顯示，煙粉虱MED隱種成蟲對竊衣的選擇數(shù)極顯著少于對對照組的選擇數(shù)(圖2)，說明竊衣對煙粉虱MED隱種成蟲有較強的驅(qū)避作用。該試驗結(jié)果與黃守敏和胡向奇(2020)發(fā)現(xiàn)小竊衣有驅(qū)避昆蟲的作用一致，小竊衣提取物對玉米象24, 48和72 h都有較高的驅(qū)避效果，驅(qū)避率分別高達89.29%, 89.92%和78.95%。產(chǎn)生驅(qū)避的結(jié)果可能是竊衣釋放的驅(qū)避性的揮發(fā)性物質(zhì)較高，吸引性的物質(zhì)較低。

艾草葉片中有14種揮發(fā)物。有研究發(fā)現(xiàn)，(E)-β-金合歡烯、葉綠醇、β-姜黃烯、萘都具有驅(qū)避昆蟲的作用(Daisyetal., 2002; 范佳等, 2014; 王璐豐等, 2017; Antonious and Kochhar, 2020)，β-依蘭烯和α-可巴烯具有吸引作用(Niogretetal., 2011)。煙粉虱MED隱種成蟲對艾草的選擇性試驗表明艾草能夠吸引煙粉虱MED隱種成蟲(圖1)，因此可以推測艾草葉片中的α-可巴烯和β-依蘭烯是介導(dǎo)艾草吸引煙粉虱MED隱種成蟲的重要物質(zhì)。預(yù)試驗中檢測了煙粉虱MED隱種成蟲對β-依蘭烯的嗅覺反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)β-依蘭烯對煙粉虱MED隱種成蟲沒有吸引作用。通過檢測煙粉虱MED隱種成蟲對α-可巴烯的嗅覺反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)α-可巴烯對煙粉虱MED隱種成蟲有較強的吸引作用(圖3)。該結(jié)果與我們的推測一致，證實了在特定階段，α-可巴烯含量的增加導(dǎo)致了艾草對煙粉虱MED隱種成蟲的吸引作用。竊衣葉片中有16種揮發(fā)物，其中茨醇、環(huán)己烯、6,6-二甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚烷-2-羧醛在竊衣葉片揮發(fā)物中總量中占有較大比例。目前還沒有文獻研究茨醇和6,6-二甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚烷-2-羧醛對昆蟲的作用，本研究在預(yù)試驗中檢測了煙粉虱成蟲對這2種物質(zhì)的嗅覺反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)它們對煙粉虱MED隱種成蟲沒有驅(qū)避作用，并通過嗅覺反應(yīng)試驗驗證了環(huán)己烯對煙粉虱MED隱種成蟲具有驅(qū)避作用(圖3)，可為后續(xù)研究提供參考。

本研究發(fā)現(xiàn)了α-可巴烯對煙粉虱MED隱種成蟲表現(xiàn)出較強的吸引性，而環(huán)己烯對煙粉虱MED隱種成蟲表現(xiàn)出較強的驅(qū)避性，在蔬菜種植地中可以利用α-可巴烯作為食誘劑來誘集煙粉虱MED隱種成蟲，利用環(huán)己烯作為驅(qū)避劑對煙粉虱MED隱種成蟲實施驅(qū)避，從而對煙粉虱MED隱種成蟲進行綠色防控。本研究只選取了艾草和竊衣中的幾種揮發(fā)物的一個濃度進行了驗證，對于這幾種揮發(fā)物的其他濃度是否具有吸引或驅(qū)避煙粉虱MED隱種成蟲的作用，或者幾種不同濃度的幾種揮發(fā)物混合在一起是否能更好地吸引或驅(qū)避煙粉虱MED隱種成蟲還未可知，有待進一步的檢測鑒定。