甜菜堿比色檢測分析條件優(yōu)化及在枸杞中的應用

◎ 史 蓉，張月蓉，陳麗娟

（酒泉市食品檢驗檢測中心，甘肅 酒泉 735000）

枸杞（Lycium barbarum）是藥食同源茄科類植物，具有明目安神、補腎生精、保護視網(wǎng)膜和抗氧化降血脂等功效[12-13]。枸杞果、葉、莖中普遍存在甜菜堿，是植物果實中的主要藥用成分之一。目前檢測甜菜堿的方法主要有比色法、離子色譜法、液相色譜法，但普遍存在儀器設備昂貴、操作復雜、人員技術(shù)要求高等問題。本研究旨在通過優(yōu)化檢測條件，建立一種便于操作的甜菜堿快速檢測方法，并應用在枸杞產(chǎn)品中，對企業(yè)優(yōu)選枸杞品種、提取產(chǎn)品有效成分、提高產(chǎn)品品質(zhì)起到促進作用。

本試驗的難點在于甜菜堿和雷氏鹽的反應物是沉淀，要盡可能完整的保留沉淀而去除剩余紅色試劑，使其不干擾比色反應。在試驗了多種過濾方法后，選擇0.22 μm的針頭濾器濾去多余試劑，再用洗脫液溶解沉淀收集于比色管。整個過程不用更換反應管、損失小、能完整保留沉淀，結(jié)果準確。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞（甘肅酒泉市場銷售）；甜菜堿標準品（99.2%，中國食品藥品檢定研究院）；丙酮、鹽酸（分析純，南京化學試劑股份有限公司）；雷氏鹽（分析純，天津光復精細化工研究所）。

1.2 儀器與設備

UV-800S紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司）；SP-756P型紫外-可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；FE20型酸度、ME203/02型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；DFT-100型手提式高速粉碎機（上海精勝科學儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 甜菜堿標準溶液的制備

精密稱取甜菜堿標準品20 mg定容于10 mL容量瓶得標準溶液濃度為2 mg·mL-1。

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1.3.2 甜菜堿的檢測方法

注射器式塑料取樣管，下端連接夸克閥和0.22 μm的針頭濾器，關(guān)閉夸克閥，吸取一定量甜菜堿標準溶液注入取樣管，加入一定量酸性雷氏鹽溶液，冷藏反應一段時間，打開夸克閥，濾除多余雷氏鹽試劑，少量冰水淋洗至無紅色試劑，加入丙酮溶液溶解甜菜堿雷氏鹽沉淀，收集于10 mL比色管，用丙酮溶液定容，在波長525 nm處測定溶液的吸光值。

1.3.3 甜菜堿檢測方法的優(yōu)化

（1）雷氏鹽酸性介質(zhì)。稱取1.500 g雷氏鹽，加入90 mL蒸餾水，分別用硫酸、鹽酸、硝酸3種酸性介質(zhì)調(diào)pH=1.0，超聲15 min，過濾，定容于100 mL容量瓶，得酸性飽和雷氏鹽溶液。精確吸取2 mg·mL-1甜菜堿標準品溶液0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、0.8 mL和1.0 mL，分別滴加雷氏鹽溶液5 mL，4 ℃冷藏反應10 min，過濾、淋洗，用70%丙酮洗脫，定容至10 mL容量瓶，使甜菜堿標準溶液濃度為0 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.16 mg·mL-1和0.20 mg·mL-1，525 nm處測吸光度。

（2）丙酮洗脫液濃度選擇。標準溶液梯度同（1），分別滴加pH=1.0的雷氏鹽溶液5 mL，4 ℃冷藏反應10 min，過濾、淋洗，分別用30%丙酮溶液、50%丙酮溶液、70%丙酮溶液、90%丙酮溶液和100%純丙酮洗脫沉淀，定容至10 mL容量瓶，525 nm處測吸光度。

（3）反應時間。標準溶液梯度同（1），分別滴加pH=1.0的雷氏鹽溶液5 mL，4 ℃冷藏反應10 min、30 min、60 min、120 min和180 min，過濾、淋洗，用70%丙酮溶液洗脫沉淀，定容至10 mL容量瓶，525 nm處測吸光度。

（4）雷氏鹽溶液用量選擇。為保證雷氏鹽與甜菜堿標準溶液反應完全，并微過量。選用的甜菜堿標準溶液濃度為 0.2 mg·mL-1和 0.6 mg·mL-1，分別滴加pH=1.0的雷氏鹽溶液1～10 mL，4 ℃冷藏反應10 min，過濾、淋洗，用70%丙酮溶液洗脫沉淀，定容至10 mL容量瓶，525 nm處測吸光度。

1.3.4 枸杞中甜菜堿含量的測定

取7份枸杞樣品按照優(yōu)化后的條件檢測。三角瓶精密稱取枸杞粉末5.00 g，加純水220 mL，沸水浴提取1 h，冷卻定容至250 mL容量瓶，上清液用硅藻土過濾，吸取待測液1～3 mL，加入鹽酸調(diào)pH=1.0的飽和雷氏鹽5 mL，4 ℃冷藏反應120 min，0.22 μm的濾膜過濾掉反應液，保留沉淀，用70%丙酮溶液溶解洗脫沉淀至10 mL比色管，采用標準曲線測得枸杞樣液的吸光度，計算枸杞甜菜堿的含量。

1.4 數(shù)據(jù)與處理

每組試驗平行測定3次，數(shù)據(jù)為3次的平均值，用Origin 8.0繪制各個試驗組的動力學曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜堿檢測方法的確定

2.1.1 雷氏鹽酸性介質(zhì)的確定

甜菜堿和雷氏鹽需在酸性條件下才能生成沉淀，將飽和雷氏鹽溶液用硫酸、鹽酸、硝酸調(diào)pH=1.0，反應后測得甜菜堿濃度為0.04～0.20 mg·mL-1，硫酸雷氏鹽吸光度在0.005～0.069，鹽酸雷氏鹽吸光度在0.027～0.155，硝酸雷氏鹽吸光度在0.018～0.105?？芍}酸雷氏鹽溶液吸光度明顯高于硫酸雷氏鹽和硝酸雷氏鹽。這可能是因為硫酸、硝酸為含氧酸，在反應過程中參與了反應，鹽酸是無氧酸，性質(zhì)較穩(wěn)定，只調(diào)節(jié)pH，不參與反應，因此選用鹽酸為雷氏鹽酸度調(diào)節(jié)劑。

2.1.2 丙酮洗脫液濃度的確定

用5種不同濃度的丙酮溶液洗脫收集測得吸光度。30%丙酮溶液和50%丙酮溶液洗脫后吸光度明顯偏低，可能是因為丙酮含量低，洗脫不完全。甜菜堿濃度為0.1 mg·mL-1時，70%丙酮溶液、90%丙酮溶液和100%純丙酮洗脫后，吸光度分別為0.055、0.065、0.058；甜菜堿濃度為0.2 mg·mL-1時，70%丙酮溶液、90%丙酮溶液和100%純丙酮洗脫后，吸光度分別為0.145、0.137、0.138，基本無差別。從節(jié)約試劑、經(jīng)濟環(huán)保的角度考慮，選擇70%丙酮溶液為洗脫液。

2.1.3 反應時間的確定

為保證反應完全，甜菜堿溶液需與雷氏鹽冷藏反應一段時間，反應180 min后，標準溶液不成線性，反應管壁出現(xiàn)紅色析出物，可能是因為雷氏鹽不穩(wěn)定，反應時間過長有結(jié)晶析出，影響反應結(jié)果。反應120 min后，2個高濃度標液 0.16 mg·mL-1和 0.20 mg·mL-1的吸光值達到最大，為0.129和0.157，說明120 min反應完全，因此選擇反應時間120 min。

2.1.4 雷氏鹽溶液用量的確定

為保證雷氏鹽和甜菜堿充分反應，雷氏鹽應微過量，選取甜菜堿標準溶液濃度為0.2 mg·mL-1和0.6 mg·mL-1，分別加入1～10 mL酸性雷氏鹽溶液，反應吸光度見圖1。0.2 mg·mL-1甜菜堿和5 mL雷氏鹽反應吸光值最大，表明加入5 mL雷氏鹽即可反應完全，0.6 mg·mL-1甜菜堿和10 mL雷氏鹽反應，吸光值仍在上升，說明雷氏鹽未達到最大值，因此后續(xù)實驗中甜菜堿標準溶液最大濃度選用0.2 mg·mL-1，雷氏鹽溶液用量5 mL。

圖1 不同雷氏鹽用量對甜菜堿溶液吸光度的影響圖

2.2 標準曲線繪制與枸杞甜菜堿的檢測

2.2.1 甜菜堿標準曲線

經(jīng)試驗測定，甜菜堿標準品的吸光度與標準溶液濃度之間的回歸方程為A=0.757 1C+0.024 4（A表示吸光度值，C表示溶液濃度），R2=0.999 94，標準曲線見圖2。結(jié)果表明，甜菜堿含量在0.02 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.16 mg·mL-1和0.20 mg·mL-1與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

圖2 甜菜堿標準曲線圖

2.2.2 枸杞甜菜堿的測定

按照1.3.4優(yōu)化過的方法測得7份枸杞的甜菜堿含量分別為640 mg/100 g、210 mg/100 g、850 mg/100 g、520 mg/100 g、1 100 mg/100 g、1 090 mg/100 g和920 mg/100 g，RSD值在3.2%～7.5%，說明該方法適用性良好。

2.3 精密度試驗

精密吸取2 mg·mL-1甜菜堿標液0.2 mL，按照1.3.4優(yōu)化過的方法測定吸光度，連續(xù)測定6次，測得RSD=0.011%，小于2%，表明精密度符合要求。

2.4 回收率試驗

精密吸取5份不同濃度的枸杞待測液，分別加入一定量甜菜堿標準溶液，混勻，其余步驟按1.3.4枸杞中甜菜堿的測定方法操作，根據(jù)回歸方程計算回收率。由表1可知，該方法的回收率為87.5%～110.0%，平均值為95.83%，RSD=9.31%，說明該方法回收率良好。

表1 加標回收率試驗結(jié)果表

3 結(jié)論與討論

本試驗采用比色法檢測枸杞中甜菜堿含量，研究了影響試驗結(jié)果的幾個主要因素，最終確定了最佳檢測條件，即用鹽酸調(diào)飽和雷氏鹽溶液pH=1.0，在甜菜堿含量0.02～0.20 mg·mL-1，雷氏鹽溶液用量5 mL，反應條件為4 ℃冷藏反應120 min，洗脫液為70%丙酮溶液。試驗結(jié)果表明該方法準確性好、時間短、靈敏度高，樣品回收率在87.5%～110%。枸杞提取物中除含有生物堿外，還含有多糖、黃酮、總酚等活性物質(zhì)，選用雷氏鹽法，利用雷氏鹽只和生物堿類物質(zhì)反應的特性，排除了其他干擾物。整個反應過程不更換反應管，利用離心和0.22 μm針式濾膜完整保留反應沉淀，最大程度降低損失，測得枸杞樣品的甜菜堿含量為210～1 100 mg/100 g。檢測方法方便快捷、準確可信、成本低，適合中小企業(yè)枸杞加工企業(yè)優(yōu)選品種、提高枸杞深加工能力，為枸杞產(chǎn)業(yè)功能性成分提取開發(fā)提供科學依據(jù)。