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      酯化大豆蛋白的制備及抑菌性研究

      2022-04-19 08:54:36武若飛薩日娜姚英杰
      現(xiàn)代食品 2022年6期
      關(guān)鍵詞:羧基酯化反應(yīng)時(shí)間

      ◎ 陳 菲,武若飛,薩日娜,姚英杰,許 晶

      (東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 文理學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030)

      大豆分離蛋白(Soy Protein Isolate,SPI)作為一種重要的植物蛋白產(chǎn)品,主要由大豆球蛋白(11S,52%)和β-伴大豆球蛋白(7S,35%)組成,其蛋白質(zhì)含量高達(dá)90%以上,具備乳化性、溶解性和發(fā)泡性等功能特性[1-2]。這些良好的功能特性使大豆蛋白在食品方面有著廣泛的應(yīng)用,如應(yīng)用于烘焙食品、面制食品等食品產(chǎn)業(yè)[2]。相關(guān)研究表明,當(dāng)溶液pH值與大豆蛋白等電點(diǎn)(pH=4.5)相近時(shí),蛋白質(zhì)會(huì)因?yàn)楸砻嫠鶐щ姾奢^少以及疏水相互作用增強(qiáng)的影響,以聚集體的形式存在,此時(shí)蛋白質(zhì)的溶解性較差,這限制了其在一些偏酸性食品(如乳制品飲料)中的應(yīng)用[3-4]。除此之外,天然蛋白容易腐敗,滋生多種微生物,不易保存,為延長(zhǎng)蛋白類食品的保質(zhì)期,往往需要向其中添加一定量的化學(xué)防腐劑,而食品配方中含有化學(xué)防腐劑可能會(huì)給產(chǎn)品認(rèn)可度帶來(lái)消極影響。

      近年來(lái),一些研究學(xué)者利用化學(xué)改性技術(shù),試圖改善蛋白質(zhì)在酸性條件下的功能性質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn),酯化改性不僅可以改善蛋白質(zhì)在酸性條件下的溶解度,還可以使蛋白質(zhì)表面攜帶正電荷[5]。當(dāng)酯化蛋白表面攜帶的正電荷與細(xì)菌表面的負(fù)電荷成分進(jìn)行相互作用時(shí),可以使細(xì)胞膜表面被撕裂或形成孔洞,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)溶物泄露、細(xì)菌凋亡,從而對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)、繁殖起到抑制作用。因此,酯化蛋白既有在酸性條件下生產(chǎn)乳類食品的潛能,又能夠作為天然防腐劑抑制有害微生物的生長(zhǎng)繁殖。然而,現(xiàn)階段將酯化改性蛋白應(yīng)用于酸性食品的研究較少。基于上述背景,本文分別以SPI、11S和7S 3種大豆蛋白質(zhì)為原料,制備酯化大豆蛋白MSPI、M11S和M7S,研究酸性條件下酯化大豆蛋白對(duì)微生物的抑制作用,為大豆蛋白在酸性食品中得到更廣泛的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 材料與儀器

      1.1.1 材料與菌種

      低溫脫脂大豆粕粉從山東招遠(yuǎn)食品有限公司購(gòu)買。大腸桿菌(E. coli,革蘭氏陰性菌)、沙門(mén)氏菌(Salmonella,革蘭氏陰性菌)以及金黃色葡萄球菌(S. aureus,革蘭氏陽(yáng)性菌)都來(lái)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

      1.1.2 儀器與設(shè)備

      FT200-SH數(shù)顯高速均質(zhì)分散機(jī)(上海標(biāo)本模型廠)、LYOQUEST-85PLUS凍干機(jī)(Telstar儀器公司)、SC-3610型低速離心機(jī)(安徽中科中佳科技股份有限公司)、IRTracer-100紅外光譜儀(Shimadzu儀器公司)、Zetasizer Nano Zeta電位分析儀(Malvern儀器公司)、手提式壓力蒸汽滅菌器(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)及L-8800氨基酸分析儀(Hitachi儀器公司)。

      1.2 實(shí)驗(yàn)方法

      1.2.1 蛋白質(zhì)的提取

      在WANG等[6]的實(shí)驗(yàn)方法上加以修改,按照?qǐng)D1的流程對(duì)SPI進(jìn)行提取,圖2的流程對(duì)11S和7S進(jìn)行提取,并利用凱氏定氮法確定SPI、11S和7S的蛋白含量分別為91.35%、80.32%、84.65%。

      圖1 SPI的提取流程圖

      圖2 11S和7S的提取流程圖

      1.2.2 氨基酸分析

      準(zhǔn)確稱取50 mg蛋白質(zhì),加入10 mL HCl(6 mol·L-1),用氮?dú)獯祾?5 min,置于烘箱中(110 ℃)水解1 d。取出,待其自然冷卻到室溫,對(duì)樣品進(jìn)行全部過(guò)濾,并定容在50 mL容量瓶中。準(zhǔn)確移取1 mL樣品,放入真空濃縮儀中濃縮至干,加入1 mL上樣緩沖液,使蛋白質(zhì)完全溶解。將溶解后的樣品過(guò)0.45 μm濾膜,移取500~1 000 μL進(jìn)行氨基酸分析。

      1.2.3 蛋白質(zhì)的酯化改性

      (1)酯化大豆蛋白的制備。在SITOHY等[5]的實(shí)驗(yàn)方法上加以修改,將濃甲醇(>99.5%)、鹽酸和無(wú)水乙醇低溫冷藏,4 ℃下按2%~7%(W/V)的物料比將蛋白樣品加到濃甲醇中。反應(yīng)開(kāi)始時(shí),逐滴加入12 mol·L-1的鹽酸至最終濃度分別為0.7 mol·L-1、1.5 mol·L-1、3.0 mol·L-1,4 ℃下連續(xù)攪拌 2 h、4 h、6 h、8 h、10 h和12 h,抽濾得到固體產(chǎn)品。用等體積無(wú)水乙醇清洗,重復(fù)操作3次去除殘余鹽酸和甲醇,并用超純水溶解沉淀物,使酯化蛋白固體在水中分散,4 ℃下透析3 d,凍干,得到3種酯化大豆蛋白(MSPI、M11S、M7S),-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

      (2)酯化率的測(cè)定。依據(jù)CHANG等[7]的實(shí)驗(yàn)方法,準(zhǔn)確移取0.25 mL樣品溶液(5 mg·mL-1)與0.15 mL的EDTA(0.05 mol·L-1)混合,渦旋的同時(shí)加入0.25 mL的鹽酸羥胺(1 mol·L-1),再加入0.1 mL NaOH(6 mol·L-1),渦旋 1 min;在 75 ℃下水浴加熱5 min,取出,自然冷卻至室溫,加入0.8 mL HCl(1 mol·L-1),再次渦旋1 min;離心,取上清液,并向上清液中加入80 μL FeCl3·6H2O溶液(5%W/V),在475 nm處測(cè)定吸光度。

      通過(guò)乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)曲線得出酯化蛋白含有的酯基摩爾數(shù),根據(jù)酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)含量計(jì)算蛋白質(zhì)中游離羧基的總含量[5]。結(jié)果表明,每克SPI、11S和7S中羧基的摩爾數(shù)分別為1.048 mmol、1.334 mmol和1.244 mmol。最后,按照下式計(jì)算蛋白質(zhì)的酯化率:

      式中:M1為酯化蛋白含有的酯基摩爾數(shù);M2為天然蛋白含有的游離羧基總摩爾數(shù)。

      1.2.4 紅外光譜測(cè)定

      參考SUN等[8]研究方法,將樣品與溴化鉀按照質(zhì)量比1∶100混合均勻,壓成固體制片。使用FT-IR光譜儀,調(diào)節(jié)儀器參數(shù)分辨率為4 cm-1,設(shè)定波數(shù)范圍為400~4 000 cm-1,進(jìn)行紅外光譜測(cè)定,掃描64次。

      1.2.5 Zeta-電位測(cè)定

      參考LI等[9]的研究方法并稍作修改,使用Zeta電位分析儀測(cè)定樣品的Zeta-電位。測(cè)量之前先用10 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH=5.0~9.0)將樣品進(jìn)行稀釋,避免多重光散射效應(yīng)。

      1.2.6 抑菌性分析

      實(shí)驗(yàn)中所用到的試劑和器材均事先進(jìn)行高壓蒸汽滅菌再冷卻至室溫,備用。依據(jù)SITOHY等[5]研究方法并稍做修改,移取20 mL滅菌后的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基于玻璃平皿中,自然冷卻,待凝固后備用。用無(wú)菌生理鹽水將1 mL含108~109CFU·mL-1細(xì)菌(革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌)的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基稀釋至106CFU·mL-1,制成菌懸液。移取100 μL菌懸液,將其均勻涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上,輕輕放置牛津杯,并向杯中加入150 μL樣品。為消除緩沖溶液對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,使用只含有天然SPI、11S和7S的相同緩沖液作為對(duì)照組[10]。將所有的培養(yǎng)皿放在4 ℃環(huán)境中靜置12 h后取出,恢復(fù)至室溫。最后,將其置于(36±1)℃條件下,靜置培養(yǎng)1 d,并準(zhǔn)確測(cè)量抑菌圈大小。

      1.3 數(shù)據(jù)分析

      所有實(shí)驗(yàn)均平行進(jìn)行3次,并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果書(shū)寫(xiě)成“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式。使用SPSS V20.0軟件處理數(shù)據(jù),進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析(p<0.05為差異顯著);采用Origin Version 8.1軟件進(jìn)行圖表的制作。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 酯化蛋白制備條件的確定

      2.1.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯化率的影響

      由圖3可知,不同蛋白質(zhì)在相同反應(yīng)時(shí)間內(nèi)酯化率不同,SPI酯化率最高,11S和7S酯化率略低;但是,當(dāng)不斷延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間時(shí),這3種蛋白質(zhì)的酯化率均先逐漸升高后趨于穩(wěn)定。SPI酯化率由2 h時(shí)的(24.7±3.1)% 增加到10 h時(shí) 的(51.4±0.4)%后不再明顯增加;與SPI相似,11S酯化率由2 h時(shí)的(20.8±0.8)%增加到10 h時(shí)的(42.1±0.2)%后不再明顯增加;7S酯化率由2 h時(shí)的(18.3±1.8)%增加到8 h時(shí)的(36.9±0.2)%后不再明顯增加。故這3種大豆蛋白與甲醇充分反應(yīng)后,繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間并不能提高蛋白質(zhì)的酯化率。這主要是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)中可以參與酯化反應(yīng)的游離羧基數(shù)是有限的,無(wú)限延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間對(duì)提高酯化程度無(wú)較大意義。因此,制備MSPI、M11S、M7S較為合適的反應(yīng)時(shí)間分別為10 h、10 h、8 h。

      圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)酯化率的影響圖

      2.1.2 鹽酸濃度對(duì)酯化率的影響

      如圖4所示,當(dāng)鹽酸濃度從0.7 mol·L-1增加到3 mol·L-1時(shí),SPI、11S和 7S 3種蛋白質(zhì)的酯化率均先上升后下降,且這3種蛋白質(zhì)的最高酯化率所對(duì)應(yīng)的鹽酸濃度均為1.5 mol·L-1。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與SITOHY等[5]使用的酯化蛋白制備條件相同。反應(yīng)開(kāi)始隨著鹽酸濃度的增加,蛋白質(zhì)的酯化率顯著增加,說(shuō)明鹽酸促進(jìn)了羧基質(zhì)子化,使蛋白質(zhì)的酯化程度得到提高。當(dāng)鹽酸濃度達(dá)到3.0 mol·L-1時(shí),發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)-甲醇-鹽酸混合體系由微黃色混濁液變成粉紅色,說(shuō)明鹽酸濃度過(guò)高,破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),體系發(fā)生了副反應(yīng),對(duì)羧基反應(yīng)產(chǎn)生了不利的影響。WANG等[11]的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。因此,制備MSPI、M11S、M7S較為合適的鹽酸濃度為1.5 mol·L-1。

      圖4 鹽酸濃度對(duì)蛋白質(zhì)酯化率的影響圖

      2.1.3 物料比對(duì)酯化率的影響

      如圖5所示,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與甲醇的物料比為2%~5%時(shí),SPI、11S和7S的酯化率無(wú)明顯變化;但是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與甲醇的物料比超過(guò)5%時(shí),3種蛋白質(zhì)的酯化率均有所降低。此結(jié)果表明,當(dāng)物料比為2%~5%時(shí),鹽酸已將蛋白質(zhì)的羧基充分質(zhì)子化,蛋白質(zhì)最大程度與甲醇反應(yīng)生成酯鍵;繼續(xù)增加蛋白質(zhì)含量,可能會(huì)導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)的羧基沒(méi)有發(fā)生質(zhì)子化,未參與反應(yīng)的游離羧基含量升高,最終蛋白質(zhì)的酯化率下降。結(jié)合酯化蛋白產(chǎn)率的需求,物料比5%時(shí)可以制備更多的酯化蛋白,故制備MSPI、M11S、M7S較合適的蛋白質(zhì)與甲醇物料比為5%(W/V)。

      圖5 物料比對(duì)蛋白質(zhì)酯化率的影響圖

      綜上,SPI和11S酯化改性的最佳條件為反應(yīng)時(shí)間10 h、鹽酸濃度1.5 mol·L-1、蛋白質(zhì)與甲醇物料比5%(W/V);7S酯化改性的最佳條件為反應(yīng)時(shí)間8 h、鹽酸濃度1.5 mol·L-1、蛋白質(zhì)與甲醇物料比5%(W/V)。

      2.2 紅外光譜分析

      如圖6所示,所有蛋白樣品在3 300 cm-1附近的明顯寬峰是O-H和N-H的伸縮振動(dòng)引起的;而2 960 cm-1附近的峰是CH2和CH3上的C-H拉伸振動(dòng)引起的;1 630~1 670 cm-1附近的峰是C=O的伸縮振動(dòng)(酰胺I帶)引起的[12];1 520~1 540 cm-1附近的峰是N-H鍵的變形振動(dòng)和C-N的拉伸振動(dòng)(酰胺II帶)引起的[13-14]。對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行酯化改性后,蛋白質(zhì)上的羧基與甲醇的羥基進(jìn)行反應(yīng)會(huì)生成酯基。樣品MSPI,M11S和M7S的酯基在1 750~1 730 cm-1和1 300~1 000 cm-1處有2個(gè)較強(qiáng)吸收帶,分別代表C=O和C-O的拉伸振動(dòng)[11]。比較天然蛋白和酯化蛋白的紅外光圖譜,發(fā)現(xiàn)所有酯化蛋白在1 733 cm-1處均出現(xiàn)C=O吸收帶,而天然蛋白在此處無(wú)吸收帶,表明對(duì)天然蛋白進(jìn)行酯化改性成功,生成了酯化蛋白,類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在WANG等[11]、MORAND等[15]、SALINAS等[16]的研究中也被報(bào)道。

      圖6 酯化蛋白的紅外光譜圖

      2.3 酯化蛋白等電點(diǎn)(pI)分析

      如圖7所示,M11S在pH=9.0時(shí)的電位為零,說(shuō)明M11S的等電點(diǎn)(pI)為pH=9.0;同理,MSPI和M7S的pI值分別為pH=10.3和pH=10.4;天然SPI、11S和 7S的 pI值 分 別 為 pH=4.5、pH=6.4和pH=4.8[1,3],兩者相比,酯化蛋白的等電點(diǎn)顯著升高,且酯化改性后3種蛋白質(zhì)的pI值大小順序?yàn)镸7S≈MSPI>M11S。根據(jù)SITOHY等[5]觀點(diǎn),酯化蛋白比天然蛋白的等電點(diǎn)高,很可能是酯化改性封閉了蛋白質(zhì)的游離羧基,使酯化蛋白與天然蛋白表面的電荷分布情況不同所致。由于11S蛋白結(jié)構(gòu)致密,酯化程度略低,導(dǎo)致其等電點(diǎn)增幅低于M7S和MSPI,這與蛋白質(zhì)的酯化率結(jié)果一致。

      圖7 不同pH時(shí)酯化蛋白溶液的Zeta-電位圖

      2.4 酯化蛋白抑菌性分析

      實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在pH=5.0的環(huán)境中,對(duì)照組對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌沒(méi)有抑制效果;然而,在此pH下,酯化大豆蛋白對(duì)這兩類細(xì)菌存在一定的抑菌性。如圖8所示,隨著酯化蛋白濃度不斷增加,MSPI、M11S、M7S對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制效果均逐漸增強(qiáng)。當(dāng)3種酯化蛋白濃度均為10 mg·mL-1時(shí),MSPI、M11S、M7S對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為(11.20±0.02)mm、(10.42±0.07)mm和(11.31±0.2)mm;對(duì)沙門(mén)氏菌的抑菌圈直徑分別為(11.34±0.02)mm、(11.47±0.12)mm 和(11.90±0.22)mm;對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為(11.33±0.06)mm、(11.25±0.02)mm和(11.27±0.14)mm。而MSPI和M7S濃度為0.1 mg·mL-1時(shí),就可以觀察到抑菌圈;M11S則在1.0 mg·mL-1時(shí),才可以觀察到抑菌圈的出現(xiàn)。因此,MSPI、M11S、M7S出現(xiàn)抑菌效果的最小濃度分別為0.1 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1。

      圖8 酯化蛋白的抑菌性圖

      3 結(jié)論

      酯化改性有利于提高SPI、11S、7S的等電點(diǎn),改善蛋白質(zhì)在酸性條件下的溶解度;同時(shí),能夠使蛋白質(zhì)表面攜帶正電荷,通過(guò)靜電作用來(lái)抑制微生物生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)以蛋白質(zhì)酯化率為指標(biāo),確定了制備MSPI和M11S兩種蛋白質(zhì)的最優(yōu)條件:反應(yīng)時(shí)間控制為10 h,鹽酸濃度為1.5 mol·L-1,蛋白質(zhì)與甲醇物料比為5%(W/V);制備M7S的最優(yōu)條件:反應(yīng)時(shí)間控制為8 h,鹽酸濃度為1.5 mol·L-1,蛋白質(zhì)與甲醇物料比為5%(W/V)。在pH=5.0時(shí),MSPI、M11S、M7S具有優(yōu)良的抑菌效果,最小抑菌濃度分別為 0.1·mL-1、1.0·mL-1、0.1 mg·mL-1。本研究制備的酯化大豆蛋白等電點(diǎn)升高,改善了酸性條件大豆蛋白的溶解性,賦予了大豆蛋白抑菌性能,拓寬了大豆蛋白的應(yīng)用范圍,提高了大豆制品的附加值。

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