酯化大豆蛋白的制備及抑菌性研究

◎ 陳 菲，武若飛，薩日娜，姚英杰，許 晶

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 文理學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆分離蛋白（Soy Protein Isolate，SPI）作為一種重要的植物蛋白產(chǎn)品，主要由大豆球蛋白（11S，52%）和β-伴大豆球蛋白（7S，35%）組成，其蛋白質(zhì)含量高達(dá)90%以上，具備乳化性、溶解性和發(fā)泡性等功能特性[1-2]。這些良好的功能特性使大豆蛋白在食品方面有著廣泛的應(yīng)用，如應(yīng)用于烘焙食品、面制食品等食品產(chǎn)業(yè)[2]。相關(guān)研究表明，當(dāng)溶液pH值與大豆蛋白等電點(diǎn)（pH=4.5）相近時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)因?yàn)楸砻嫠鶐щ姾奢^少以及疏水相互作用增強(qiáng)的影響，以聚集體的形式存在，此時(shí)蛋白質(zhì)的溶解性較差，這限制了其在一些偏酸性食品（如乳制品飲料）中的應(yīng)用[3-4]。除此之外，天然蛋白容易腐敗，滋生多種微生物，不易保存，為延長(zhǎng)蛋白類食品的保質(zhì)期，往往需要向其中添加一定量的化學(xué)防腐劑，而食品配方中含有化學(xué)防腐劑可能會(huì)給產(chǎn)品認(rèn)可度帶來(lái)消極影響。

近年來(lái)，一些研究學(xué)者利用化學(xué)改性技術(shù)，試圖改善蛋白質(zhì)在酸性條件下的功能性質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)，酯化改性不僅可以改善蛋白質(zhì)在酸性條件下的溶解度，還可以使蛋白質(zhì)表面攜帶正電荷[5]。當(dāng)酯化蛋白表面攜帶的正電荷與細(xì)菌表面的負(fù)電荷成分進(jìn)行相互作用時(shí)，可以使細(xì)胞膜表面被撕裂或形成孔洞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)溶物泄露、細(xì)菌凋亡，從而對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)、繁殖起到抑制作用。因此，酯化蛋白既有在酸性條件下生產(chǎn)乳類食品的潛能，又能夠作為天然防腐劑抑制有害微生物的生長(zhǎng)繁殖。然而，現(xiàn)階段將酯化改性蛋白應(yīng)用于酸性食品的研究較少。基于上述背景，本文分別以SPI、11S和7S 3種大豆蛋白質(zhì)為原料，制備酯化大豆蛋白MSPI、M11S和M7S，研究酸性條件下酯化大豆蛋白對(duì)微生物的抑制作用，為大豆蛋白在酸性食品中得到更廣泛的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與菌種

低溫脫脂大豆粕粉從山東招遠(yuǎn)食品有限公司購(gòu)買。大腸桿菌（E. coli，革蘭氏陰性菌）、沙門(mén)氏菌（Salmonella，革蘭氏陰性菌）以及金黃色葡萄球菌（S. aureus，革蘭氏陽(yáng)性菌）都來(lái)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 儀器與設(shè)備

FT200-SH數(shù)顯高速均質(zhì)分散機(jī)（上海標(biāo)本模型廠）、LYOQUEST-85PLUS凍干機(jī)（Telstar儀器公司）、SC-3610型低速離心機(jī)（安徽中科中佳科技股份有限公司）、IRTracer-100紅外光譜儀（Shimadzu儀器公司）、Zetasizer Nano Zeta電位分析儀（Malvern儀器公司）、手提式壓力蒸汽滅菌器（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）及L-8800氨基酸分析儀（Hitachi儀器公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白質(zhì)的提取

在WANG等[6]的實(shí)驗(yàn)方法上加以修改，按照?qǐng)D1的流程對(duì)SPI進(jìn)行提取，圖2的流程對(duì)11S和7S進(jìn)行提取，并利用凱氏定氮法確定SPI、11S和7S的蛋白含量分別為91.35%、80.32%、84.65%。

圖1 SPI的提取流程圖

圖2 11S和7S的提取流程圖

1.2.2 氨基酸分析

準(zhǔn)確稱取50 mg蛋白質(zhì)，加入10 mL HCl（6 mol·L-1），用氮?dú)獯祾?5 min，置于烘箱中（110 ℃）水解1 d。取出，待其自然冷卻到室溫，對(duì)樣品進(jìn)行全部過(guò)濾，并定容在50 mL容量瓶中。準(zhǔn)確移取1 mL樣品，放入真空濃縮儀中濃縮至干，加入1 mL上樣緩沖液，使蛋白質(zhì)完全溶解。將溶解后的樣品過(guò)0.45 μm濾膜，移取500～1 000 μL進(jìn)行氨基酸分析。

1.2.3 蛋白質(zhì)的酯化改性

（1）酯化大豆蛋白的制備。在SITOHY等[5]的實(shí)驗(yàn)方法上加以修改，將濃甲醇（＞99.5%）、鹽酸和無(wú)水乙醇低溫冷藏，4 ℃下按2%～7%（W/V）的物料比將蛋白樣品加到濃甲醇中。反應(yīng)開(kāi)始時(shí)，逐滴加入12 mol·L-1的鹽酸至最終濃度分別為0.7 mol·L-1、1.5 mol·L-1、3.0 mol·L-1，4 ℃下連續(xù)攪拌 2 h、4 h、6 h、8 h、10 h和12 h，抽濾得到固體產(chǎn)品。用等體積無(wú)水乙醇清洗，重復(fù)操作3次去除殘余鹽酸和甲醇，并用超純水溶解沉淀物，使酯化蛋白固體在水中分散，4 ℃下透析3 d，凍干，得到3種酯化大豆蛋白（MSPI、M11S、M7S），-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）酯化率的測(cè)定。依據(jù)CHANG等[7]的實(shí)驗(yàn)方法，準(zhǔn)確移取0.25 mL樣品溶液（5 mg·mL-1）與0.15 mL的EDTA（0.05 mol·L-1）混合，渦旋的同時(shí)加入0.25 mL的鹽酸羥胺（1 mol·L-1），再加入0.1 mL NaOH（6 mol·L-1），渦旋 1 min；在 75 ℃下水浴加熱5 min，取出，自然冷卻至室溫，加入0.8 mL HCl（1 mol·L-1），再次渦旋1 min；離心，取上清液，并向上清液中加入80 μL FeCl3·6H2O溶液（5%W/V），在475 nm處測(cè)定吸光度。

通過(guò)乙酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)曲線得出酯化蛋白含有的酯基摩爾數(shù)，根據(jù)酸性氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）含量計(jì)算蛋白質(zhì)中游離羧基的總含量[5]。結(jié)果表明，每克SPI、11S和7S中羧基的摩爾數(shù)分別為1.048 mmol、1.334 mmol和1.244 mmol。最后，按照下式計(jì)算蛋白質(zhì)的酯化率：

式中：M1為酯化蛋白含有的酯基摩爾數(shù)；M2為天然蛋白含有的游離羧基總摩爾數(shù)。

1.2.4 紅外光譜測(cè)定

參考SUN等[8]研究方法，將樣品與溴化鉀按照質(zhì)量比1∶100混合均勻，壓成固體制片。使用FT-IR光譜儀，調(diào)節(jié)儀器參數(shù)分辨率為4 cm-1，設(shè)定波數(shù)范圍為400～4 000 cm-1，進(jìn)行紅外光譜測(cè)定，掃描64次。

1.2.5 Zeta-電位測(cè)定

參考LI等[9]的研究方法并稍作修改，使用Zeta電位分析儀測(cè)定樣品的Zeta-電位。測(cè)量之前先用10 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH=5.0～9.0）將樣品進(jìn)行稀釋，避免多重光散射效應(yīng)。

1.2.6 抑菌性分析

實(shí)驗(yàn)中所用到的試劑和器材均事先進(jìn)行高壓蒸汽滅菌再冷卻至室溫，備用。依據(jù)SITOHY等[5]研究方法并稍做修改，移取20 mL滅菌后的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基于玻璃平皿中，自然冷卻，待凝固后備用。用無(wú)菌生理鹽水將1 mL含108～109CFU·mL-1細(xì)菌（革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌）的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基稀釋至106CFU·mL-1，制成菌懸液。移取100 μL菌懸液，將其均勻涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，輕輕放置牛津杯，并向杯中加入150 μL樣品。為消除緩沖溶液對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，使用只含有天然SPI、11S和7S的相同緩沖液作為對(duì)照組[10]。將所有的培養(yǎng)皿放在4 ℃環(huán)境中靜置12 h后取出，恢復(fù)至室溫。最后，將其置于（36±1）℃條件下，靜置培養(yǎng)1 d，并準(zhǔn)確測(cè)量抑菌圈大小。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均平行進(jìn)行3次，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果書(shū)寫(xiě)成“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式。使用SPSS V20.0軟件處理數(shù)據(jù)，進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析（p＜0.05為差異顯著）；采用Origin Version 8.1軟件進(jìn)行圖表的制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 酯化蛋白制備條件的確定

2.1.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯化率的影響

由圖3可知，不同蛋白質(zhì)在相同反應(yīng)時(shí)間內(nèi)酯化率不同，SPI酯化率最高，11S和7S酯化率略低；但是，當(dāng)不斷延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間時(shí)，這3種蛋白質(zhì)的酯化率均先逐漸升高后趨于穩(wěn)定。SPI酯化率由2 h時(shí)的（24.7±3.1）% 增加到10 h時(shí) 的（51.4±0.4）%后不再明顯增加；與SPI相似，11S酯化率由2 h時(shí)的（20.8±0.8）%增加到10 h時(shí)的（42.1±0.2）%后不再明顯增加；7S酯化率由2 h時(shí)的（18.3±1.8）%增加到8 h時(shí)的（36.9±0.2）%后不再明顯增加。故這3種大豆蛋白與甲醇充分反應(yīng)后，繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間并不能提高蛋白質(zhì)的酯化率。這主要是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)中可以參與酯化反應(yīng)的游離羧基數(shù)是有限的，無(wú)限延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間對(duì)提高酯化程度無(wú)較大意義。因此，制備MSPI、M11S、M7S較為合適的反應(yīng)時(shí)間分別為10 h、10 h、8 h。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)酯化率的影響圖

2.1.2 鹽酸濃度對(duì)酯化率的影響

如圖4所示，當(dāng)鹽酸濃度從0.7 mol·L-1增加到3 mol·L-1時(shí)，SPI、11S和 7S 3種蛋白質(zhì)的酯化率均先上升后下降，且這3種蛋白質(zhì)的最高酯化率所對(duì)應(yīng)的鹽酸濃度均為1.5 mol·L-1。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與SITOHY等[5]使用的酯化蛋白制備條件相同。反應(yīng)開(kāi)始隨著鹽酸濃度的增加，蛋白質(zhì)的酯化率顯著增加，說(shuō)明鹽酸促進(jìn)了羧基質(zhì)子化，使蛋白質(zhì)的酯化程度得到提高。當(dāng)鹽酸濃度達(dá)到3.0 mol·L-1時(shí)，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)-甲醇-鹽酸混合體系由微黃色混濁液變成粉紅色，說(shuō)明鹽酸濃度過(guò)高，破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，體系發(fā)生了副反應(yīng)，對(duì)羧基反應(yīng)產(chǎn)生了不利的影響。WANG等[11]的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。因此，制備MSPI、M11S、M7S較為合適的鹽酸濃度為1.5 mol·L-1。

圖4 鹽酸濃度對(duì)蛋白質(zhì)酯化率的影響圖

2.1.3 物料比對(duì)酯化率的影響

如圖5所示，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與甲醇的物料比為2%～5%時(shí)，SPI、11S和7S的酯化率無(wú)明顯變化；但是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與甲醇的物料比超過(guò)5%時(shí)，3種蛋白質(zhì)的酯化率均有所降低。此結(jié)果表明，當(dāng)物料比為2%～5%時(shí)，鹽酸已將蛋白質(zhì)的羧基充分質(zhì)子化，蛋白質(zhì)最大程度與甲醇反應(yīng)生成酯鍵；繼續(xù)增加蛋白質(zhì)含量，可能會(huì)導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)的羧基沒(méi)有發(fā)生質(zhì)子化，未參與反應(yīng)的游離羧基含量升高，最終蛋白質(zhì)的酯化率下降。結(jié)合酯化蛋白產(chǎn)率的需求，物料比5%時(shí)可以制備更多的酯化蛋白，故制備MSPI、M11S、M7S較合適的蛋白質(zhì)與甲醇物料比為5%（W/V）。

圖5 物料比對(duì)蛋白質(zhì)酯化率的影響圖

綜上，SPI和11S酯化改性的最佳條件為反應(yīng)時(shí)間10 h、鹽酸濃度1.5 mol·L-1、蛋白質(zhì)與甲醇物料比5%（W/V）；7S酯化改性的最佳條件為反應(yīng)時(shí)間8 h、鹽酸濃度1.5 mol·L-1、蛋白質(zhì)與甲醇物料比5%（W/V）。

2.2 紅外光譜分析

如圖6所示，所有蛋白樣品在3 300 cm-1附近的明顯寬峰是O-H和N-H的伸縮振動(dòng)引起的；而2 960 cm-1附近的峰是CH2和CH3上的C-H拉伸振動(dòng)引起的；1 630～1 670 cm-1附近的峰是C=O的伸縮振動(dòng)（酰胺I帶）引起的[12]；1 520～1 540 cm-1附近的峰是N-H鍵的變形振動(dòng)和C-N的拉伸振動(dòng)（酰胺II帶）引起的[13-14]。對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行酯化改性后，蛋白質(zhì)上的羧基與甲醇的羥基進(jìn)行反應(yīng)會(huì)生成酯基。樣品MSPI，M11S和M7S的酯基在1 750～1 730 cm-1和1 300～1 000 cm-1處有2個(gè)較強(qiáng)吸收帶，分別代表C=O和C-O的拉伸振動(dòng)[11]。比較天然蛋白和酯化蛋白的紅外光圖譜，發(fā)現(xiàn)所有酯化蛋白在1 733 cm-1處均出現(xiàn)C=O吸收帶，而天然蛋白在此處無(wú)吸收帶，表明對(duì)天然蛋白進(jìn)行酯化改性成功，生成了酯化蛋白，類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在WANG等[11]、MORAND等[15]、SALINAS等[16]的研究中也被報(bào)道。

圖6 酯化蛋白的紅外光譜圖

2.3 酯化蛋白等電點(diǎn)（pI）分析

如圖7所示，M11S在pH=9.0時(shí)的電位為零，說(shuō)明M11S的等電點(diǎn)（pI）為pH=9.0；同理，MSPI和M7S的pI值分別為pH=10.3和pH=10.4；天然SPI、11S和 7S的 pI值 分 別 為 pH=4.5、pH=6.4和pH=4.8[1,3]，兩者相比，酯化蛋白的等電點(diǎn)顯著升高，且酯化改性后3種蛋白質(zhì)的pI值大小順序?yàn)镸7S≈MSPI＞M11S。根據(jù)SITOHY等[5]觀點(diǎn)，酯化蛋白比天然蛋白的等電點(diǎn)高，很可能是酯化改性封閉了蛋白質(zhì)的游離羧基，使酯化蛋白與天然蛋白表面的電荷分布情況不同所致。由于11S蛋白結(jié)構(gòu)致密，酯化程度略低，導(dǎo)致其等電點(diǎn)增幅低于M7S和MSPI，這與蛋白質(zhì)的酯化率結(jié)果一致。

圖7 不同pH時(shí)酯化蛋白溶液的Zeta-電位圖

2.4 酯化蛋白抑菌性分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在pH=5.0的環(huán)境中，對(duì)照組對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌沒(méi)有抑制效果；然而，在此pH下，酯化大豆蛋白對(duì)這兩類細(xì)菌存在一定的抑菌性。如圖8所示，隨著酯化蛋白濃度不斷增加，MSPI、M11S、M7S對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制效果均逐漸增強(qiáng)。當(dāng)3種酯化蛋白濃度均為10 mg·mL-1時(shí)，MSPI、M11S、M7S對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為（11.20±0.02）mm、（10.42±0.07）mm和（11.31±0.2）mm；對(duì)沙門(mén)氏菌的抑菌圈直徑分別為（11.34±0.02）mm、（11.47±0.12）mm 和（11.90±0.22）mm；對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為（11.33±0.06）mm、（11.25±0.02）mm和（11.27±0.14）mm。而MSPI和M7S濃度為0.1 mg·mL-1時(shí)，就可以觀察到抑菌圈；M11S則在1.0 mg·mL-1時(shí)，才可以觀察到抑菌圈的出現(xiàn)。因此，MSPI、M11S、M7S出現(xiàn)抑菌效果的最小濃度分別為0.1 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1。

圖8 酯化蛋白的抑菌性圖

3 結(jié)論

酯化改性有利于提高SPI、11S、7S的等電點(diǎn)，改善蛋白質(zhì)在酸性條件下的溶解度；同時(shí)，能夠使蛋白質(zhì)表面攜帶正電荷，通過(guò)靜電作用來(lái)抑制微生物生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)以蛋白質(zhì)酯化率為指標(biāo)，確定了制備MSPI和M11S兩種蛋白質(zhì)的最優(yōu)條件：反應(yīng)時(shí)間控制為10 h，鹽酸濃度為1.5 mol·L-1，蛋白質(zhì)與甲醇物料比為5%（W/V）；制備M7S的最優(yōu)條件：反應(yīng)時(shí)間控制為8 h，鹽酸濃度為1.5 mol·L-1，蛋白質(zhì)與甲醇物料比為5%（W/V）。在pH=5.0時(shí)，MSPI、M11S、M7S具有優(yōu)良的抑菌效果，最小抑菌濃度分別為 0.1·mL-1、1.0·mL-1、0.1 mg·mL-1。本研究制備的酯化大豆蛋白等電點(diǎn)升高，改善了酸性條件大豆蛋白的溶解性，賦予了大豆蛋白抑菌性能，拓寬了大豆蛋白的應(yīng)用范圍，提高了大豆制品的附加值。