慢性自發(fā)性蕁麻疹發(fā)病機(jī)制的生物信息學(xué)研究

賈秀娟 烏日娜 薩琦拉 王百靈 賀希格圖 特格喜白音 郭靖雪 齊寶鵬 木其日

1內(nèi)蒙古國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院皮膚科，呼和浩特，010020；2內(nèi)蒙古國(guó)際蒙醫(yī)醫(yī)院創(chuàng)新蒙醫(yī)藥工程研究中心，呼和浩特，010070；3內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，呼和浩特，010110

蕁麻疹為一種以皮膚、黏膜小血管擴(kuò)張并滲透性增加而出現(xiàn)的局限性水腫反應(yīng)，臨床以風(fēng)團(tuán)及瘙癢為主要表現(xiàn)，較為常見且易復(fù)發(fā)，臨床分類主要包括自發(fā)性與誘導(dǎo)性兩類，自發(fā)性蕁麻疹根據(jù)病程是否大于6周分為急性自發(fā)性蕁麻疹與慢性自發(fā)性蕁麻疹，而誘導(dǎo)性蕁麻疹的分類依據(jù)則根據(jù)其發(fā)生是否與物理因素相關(guān)分為物理性與非物理性蕁麻疹，前者主要包括人工蕁麻疹(皮膚劃痕癥)、冷接觸性蕁麻疹、延遲壓力性蕁麻疹、熱接觸性蕁麻疹、日光性蕁麻疹、振動(dòng)性血管性水腫、膽堿能性蕁麻疹，后者主要包括水源性蕁麻疹、接觸性蕁麻疹，其中病程持續(xù)至少6周的蕁麻疹為慢性蕁麻疹(chronic urticaria, CU)，根據(jù)誘發(fā)因素的相關(guān)性，CU通常分為兩個(gè)亞型：慢性自發(fā)性蕁麻疹(chronic spontaneous urticaria, CSU)和慢性誘導(dǎo)性蕁麻疹(chronic inducible urticaria, CIndU)。CSU主要指無(wú)明確誘發(fā)因素反復(fù)出現(xiàn)皮膚、黏膜一過性(<24 h)的瘙癢性風(fēng)團(tuán)和/或血管性水腫，且病程持續(xù)至少6周；CIndU主要指由物理因素誘發(fā)的風(fēng)團(tuán)，反復(fù)出現(xiàn)病程持續(xù)6周以上，均嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1-3]。CSU的發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜且尚不完全明確，故于治療方面也面臨巨大的的挑戰(zhàn)性，CSU的發(fā)生主要由肥大細(xì)胞驅(qū)動(dòng)，由于其兼?zhèn)渥陨砻庖咝耘c變態(tài)反應(yīng)性疾病的特征，涉及到多因素，近些年各種炎癥遞質(zhì)、自身免疫、肥大細(xì)胞與嗜堿粒細(xì)胞信號(hào)失調(diào)、凝血與氧化應(yīng)激等被認(rèn)為與其發(fā)病密切相關(guān)[4，5]。

CSU的發(fā)生是較為復(fù)雜的生物學(xué)過程，涉及多種機(jī)制且存在相互串?dāng)_、相互激活的關(guān)系[4]。近些年來，高通量測(cè)序技術(shù)聯(lián)合生物信息學(xué)分析在炎癥性皮膚病領(lǐng)域研究方面為探索疾病發(fā)病機(jī)制與治療靶點(diǎn)提供研究方向與思路的新手段[6，7]。因此，對(duì)參與CSU發(fā)病相關(guān)的關(guān)鍵基因及其相互作用、通路進(jìn)行研究，可能為CSU的相關(guān)研究提供新方向與思路。本研究使用從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的數(shù)據(jù)完備且可靠的GSE72541數(shù)據(jù)集，使用生物信息學(xué)方法，確定差異表達(dá)基因，并進(jìn)一步對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析、KEGG通路分析同時(shí)構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)，篩選顯著的PPI模塊，尋找關(guān)鍵通路與基因，進(jìn)一步探究CSU發(fā)病的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù) 從Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取GSE72541數(shù)據(jù)集，該研究是基于GPL16699平臺(tái)(Agilent-039494 SurePrint G3 Human GE v2 8x60K Microarray 039381)，由Giménez-Arnau A等提交，包括30個(gè)樣本，來自20個(gè)CSU及10個(gè)健康對(duì)照者的靜脈血標(biāo)本。

1.2 差異基因篩選 對(duì)獲取的GSE72541芯片的矩陣數(shù)據(jù)進(jìn)行背景校正、標(biāo)準(zhǔn)化、匯總與探針質(zhì)量控制，同時(shí)獲取注釋包文件，將探針矩陣轉(zhuǎn)換為gene symbol矩陣。安裝加載limma包進(jìn)行差異基因表達(dá)分析，篩選標(biāo)準(zhǔn)為(|logFC|>1 & P.Val<0.05)，繪制差異表達(dá)基因的熱圖與火山圖。

1.3 功能富集分析 使用clusterProfiler包對(duì)差異基因(pvalue<0.05 & qvalue<0.05)進(jìn)行功能富集分析，包括生物過程(BP)、分子功能(MF)、細(xì)胞組份(CC) 及 KEGG 通路的富集分析，得出顯著富集的功能與通路，此外分別對(duì)上調(diào)及下調(diào)基因進(jìn)行功能及KEGG通路富集分析，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 使用10.5版本STRING軟件對(duì)差異基因相應(yīng)蛋白的相互作用關(guān)系進(jìn)行構(gòu)建與分析。PPI網(wǎng)絡(luò)圖中綜合得分>0.4的蛋白具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并使用Cytoscape插件MCODE篩選出有意義的PPI模塊，篩選標(biāo)準(zhǔn)為: Node score cutoff>0.2和K-core>2。

2 結(jié)果

2.1 篩選差異基因 以|logFC|>1 & adj.P.Val<0.05為標(biāo)準(zhǔn)共篩選出86個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因64個(gè)，如ITGB3、AQP10等；下調(diào)基因22個(gè)，如HLA-DQA1、KRTAP19-2。采用R語(yǔ)言繪制火山圖(圖1a)與上調(diào)基因與下調(diào)基因的熱圖(圖1b)。其中，上調(diào)及下調(diào)差異表達(dá)基因Top10與差異倍數(shù)見表1。

表1 Top10上調(diào)及下調(diào)的基因

圖1 差異表達(dá)基因的火山圖(1a)與熱圖(1b)

2.2 GO及KEGG通路分析 GO富集分析(圖2)表明，CSU組與健康對(duì)照組相比的差異表達(dá)基因主要涉及血小板活化、血液凝固、止血、凝固、β淀粉樣蛋白清除(amyloid-beta clearance)、MHC II類分子介導(dǎo)的外源性肽抗原的抗原加工和提呈(antigen processing and presentation of exogenous peptide antigen via MHC class II)、MHC II類分子介導(dǎo)的肽抗原的抗原加工和提呈(antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class II)、MHC II類分子介導(dǎo)的肽或多糖抗原的抗原加工和提呈(antigen processing and presentation of peptide or polysaccharide antigen via MHC class II)、內(nèi)源性凝血途徑、蛋白質(zhì)活化級(jí)聯(lián)等生物學(xué)過程；富集在MHC II類蛋白復(fù)合物(MHC class II protein complex)、MHC蛋白復(fù)合物(MHC protein complex)、分泌顆粒膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔側(cè)的組成部分(integral component of lumenal side of endoplasmic reticulum membrane)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜腔側(cè)(lumenal side of endoplasmic reticulum membrane)、血小板α顆粒、網(wǎng)格蛋白包被的內(nèi)吞泡膜(clathrin-coated endocytic vesicle membrane)、反向高爾基網(wǎng)(trans-Golgi network)、三級(jí)顆粒、血小板α顆粒膜等細(xì)胞組份；參與MHC II類受體活性(MHC class II receptor activity)、肽抗原結(jié)合、糖結(jié)合、肽結(jié)合、胰島素樣生長(zhǎng)因子I結(jié)合(insulin-like growth factor I binding)、酰胺結(jié)合、膠原結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性，轉(zhuǎn)移氨基酰基、補(bǔ)體結(jié)合、胰島素受體結(jié)合、MHC蛋白復(fù)合物結(jié)合(MHC protein complex binding)等分子功能。

KEGG分析顯示，富集的主要通路包括：造血細(xì)胞系、移植物抗宿主病、金黃色葡萄球菌感染、哮喘、同種異體移植排斥反應(yīng)、利什曼病(Leishmaniasis)、抗原加工和提呈、I型糖尿病、血小板活化、產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、ECM受體相互作用(ECM-receptor interaction)、自身免疫性甲狀腺疾病、細(xì)胞間黏附分子、病毒性心肌炎、炎癥性腸病、補(bǔ)體途徑、Th1和Th2細(xì)胞分化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、吞噬體、甲型流感、Th17細(xì)胞分化、弓形蟲病、結(jié)核病、中性粒細(xì)胞胞外陷阱形成、EB 病毒感染、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、黏著斑、人T細(xì)胞白血病病毒1感染、致心律失常性右室心肌病、前列腺癌(prostate cancer)等信號(hào)通路過程。

此外，對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因按照上調(diào)及下調(diào)分別進(jìn)行了GO與KEGG富集分析，結(jié)果見圖3。功能富集分析結(jié)果顯示，上調(diào)基因主要富集于血小板活化、血液凝固、止血、凝固等生物學(xué)過程，下調(diào)基因則主要富集于MHC II類分子介導(dǎo)的外源性肽抗原的抗原加工和提呈、MHC II類分子介導(dǎo)的肽抗原的抗原加工和提呈、MHC II類分子介導(dǎo)的肽或多糖抗原的抗原加工和提呈等生物學(xué)過程。KEGG通路富集分析，上調(diào)基因富集的主要通路為血小板活化、ECM受體相互作用、造血細(xì)胞系、中性粒細(xì)胞胞外陷阱形成、而下調(diào)基因主要富集在移植物抗宿主病、抗原加工和提呈、甲型流感、EB 病毒感染等信號(hào)通路過程。

PPI網(wǎng)絡(luò)為一種突出蛋白-蛋白間相互作用的重要方式，可進(jìn)一步反應(yīng)機(jī)體的各項(xiàng)功能[8]。將篩選出的差異表達(dá)基因上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中，構(gòu)建、繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，該網(wǎng)絡(luò)由62個(gè)節(jié)點(diǎn)蛋白和257條邊構(gòu)成(圖4a)。使用Cytoscape的MCODE插件進(jìn)行子網(wǎng)絡(luò)分析，得到PPI網(wǎng)絡(luò)的子網(wǎng)絡(luò)模塊，篩選出3種最顯著的模塊(圖4b～4d、表2)。其中，最顯著的相互作用模塊見4B，包括CXCL10, MMP9, SELP, MME, ITGA2B, ITGB3, CLU, GP6, C5AR1, C6orf25, GP1BB, VWF, CR1, GP9, PLAU共15個(gè)關(guān)鍵基因，存在密切的相互作用關(guān)系。

2a ：GO功能富集柱狀圖(a)生物學(xué)過程；(b)細(xì)胞組份；(c)分子功能圖;2b：KEGG通路分析柱狀圖

3a ：上調(diào)基因的GO功能富集柱狀圖;3b：上調(diào)基因的KEGG通路分析柱狀圖;3c ：下調(diào)基因的GO功能富集柱狀圖;3d：下調(diào)基因的KEGG通路分析柱狀圖

4a:蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖;4b～4d:顯著模塊分析圖

表2 3種最顯著蛋白-蛋白相互作用模塊

3 討論

本研究通過分析CSU的基因芯片結(jié)果，發(fā)現(xiàn)CSU與健康對(duì)照者相比共有86個(gè)差異基因表達(dá)，其中上調(diào)基因64個(gè)，下調(diào)基因22個(gè)。將篩選出的差異基因進(jìn)行GO富集及KEGG通路分析，這些差異表達(dá)基因主要富集在凝血、免疫調(diào)節(jié)、感染等過程。凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與了CSU的發(fā)病機(jī)制，其主要為組織因子與補(bǔ)體(如C3a、C5a)所觸發(fā)，目前對(duì)組織因子及補(bǔ)體所觸發(fā)的凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與CSU皮膚肥大細(xì)胞與外周嗜堿粒細(xì)胞的機(jī)制不清楚[3,9,10]。肥大細(xì)胞與嗜堿粒細(xì)胞激活誘導(dǎo)的促炎癥因子釋放為CSU的重要的病理生理學(xué)特征，諸多證據(jù)表明高達(dá)50%的CSU患者存在潛在的自身免疫相關(guān)的病因，如Th1/Th2細(xì)胞因子失衡、補(bǔ)體活化、肥大細(xì)胞與嗜堿粒細(xì)胞異常分布等，CSU的發(fā)生常合并自身免疫性疾病，如甲狀腺疾病、乳糜瀉、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等[11-13]。盡管多數(shù)情況下CSU發(fā)生的確切原因無(wú)法明確，但其發(fā)生與感染具有一定的關(guān)聯(lián)性，關(guān)于感染誘發(fā)CSU的機(jī)制尚不完全清楚，但目前認(rèn)為感染誘發(fā)的免疫與非免疫機(jī)制均介導(dǎo)了CSU的發(fā)生，主要包括IgE依賴和非IgE依賴的免疫機(jī)制，而非免疫機(jī)制亦涉及多方面，如通過Toll樣受體介導(dǎo)肥大細(xì)胞活化、通過誘發(fā)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)活化肥大細(xì)胞、感染后刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，結(jié)合后形成抗原抗體復(fù)合物后活化補(bǔ)體，進(jìn)而由補(bǔ)體介導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒，或直接刺激肥大細(xì)胞脫顆粒等[14,15]?？傊珻SU的發(fā)生是涉及多種因素的較為復(fù)雜的生物學(xué)過程。

通過構(gòu)建蛋白-蛋白間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖篩選顯著模塊，共篩選出了15個(gè)關(guān)鍵基因，包括CXCL10, MMP9, SELP, MME, ITGA2B, ITGB3, CLU, GP6, C5AR1, C6orf25, GP1BB, VWF, CR1, GP9, PLAU。其中，ITGB3，ITGA2B，MMP9及CR1是差異表達(dá)最為顯著的top10上調(diào)基因。ITGB3 (β3 integrin, β3整合素)，又稱CD61或GP3A；ITGA2B(integrin Alpha 2b, Alpha 2b整合素)，又稱CD41，兩者均為整合素家族成員，整合素作為與細(xì)胞外基質(zhì)配體、細(xì)胞表面配體和可溶性配體結(jié)合的細(xì)胞黏附受體家族，是細(xì)胞表面的黏附受體及細(xì)胞表面的重要分子，參與多種生物學(xué)過程，如發(fā)育、免疫反應(yīng)、止血和傷口愈合等，其還作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體發(fā)揮作用，參與調(diào)控調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖和細(xì)胞命運(yùn)的胞內(nèi)途徑等功能[16-18]。細(xì)胞間的相互黏附作為人類機(jī)體免疫功能正常運(yùn)作的基礎(chǔ)，黏附分子的異常表達(dá)可導(dǎo)致免疫功能異常，其中整合素在細(xì)胞之間的相互作用中發(fā)揮著重要作用[19]。目前對(duì)于ITGB3, ITGA2B參與蕁麻疹病理生理學(xué)的確切機(jī)制與意義不完全清楚。此外，MMP9在本研究中上調(diào)表達(dá)也較為顯著，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)為鋅依賴性蛋白水解酶, 其中MMP9是一種最復(fù)雜的基質(zhì)金屬蛋白酶，MMP9具有降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的能力，在病理生理功能中起重要作用，其過度表達(dá)和失調(diào)與多種疾病相關(guān)[20]。MMP9作為一種促進(jìn)炎癥和組織重塑的酶，可能也參與了蕁麻疹的病理生理過程，但多項(xiàng)研究表明了MMP9水平與疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性的矛盾結(jié)果，部分研究認(rèn)為MMP9水平升高與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，升高的MMP9水平并被視為CSU的生物標(biāo)志物，然而近期研究表明MMP9水平與CSU的嚴(yán)重程度無(wú)關(guān)，MMP9水平并未隨著治療過程而降低，結(jié)論認(rèn)為MMP9不能作為CSU疾病活動(dòng)的生物標(biāo)志物，也不能用于評(píng)估治療效果[21-24]。因此，盡管于本研究MMP9呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)，但基于現(xiàn)有的研究分析MMP9參與CSU的病理生理學(xué)機(jī)制、作為CSU生物標(biāo)志物的臨床意義及其潛在價(jià)值仍有爭(zhēng)議，亦值得進(jìn)一步研究。CR1(complement receptor 1, 補(bǔ)體受體1)為C3b/C4b補(bǔ)體的受體，存在于不同的細(xì)胞、血漿與尿液中，CR1作為一種多功能多態(tài)性糖蛋白，在紅細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞亞群、樹突狀細(xì)胞、皮膚中的朗格罕細(xì)胞等表達(dá)[25-29]。補(bǔ)體過度激活是一系列自身免疫性和炎癥性疾病發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵事件，而CR1在免疫復(fù)合物沉積和補(bǔ)體系統(tǒng)過度激活導(dǎo)致組織損傷的疾病過程中是一個(gè)極其重要的分子[26]。補(bǔ)體在蕁麻疹發(fā)病中起主要或加重因素的作用，補(bǔ)體(C3a和C5a)觸發(fā)的外源性凝血級(jí)聯(lián)參與了CSU的發(fā)病機(jī)制[9,30]。外周血紅細(xì)胞CR1的表達(dá)水平在慢性蕁麻疹患者中顯著高于健康對(duì)照組，且血清總免疫球蛋白E水平與外周血紅細(xì)胞CR1表達(dá)水平也呈顯著正相關(guān)，CR1參與了CSU發(fā)病機(jī)制[31]。

綜上所述，本研究使用生物信息學(xué)方法全面分析了CSU與健康對(duì)照組間的差異表達(dá)基因，并篩選出CXCL10, MMP9, SELP, MME, ITGA2B, ITGB3, CLU, GP6, C5AR1, C6orf25, GP1BB, VWF, CR1, GP9, PLAU 15個(gè)關(guān)鍵差異表達(dá)基因在CSU的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，它們參與的生物過程、細(xì)胞組份、分子功能及相關(guān)信號(hào)通路可能與CSU的發(fā)病密切相關(guān)。生物信息學(xué)分析對(duì)進(jìn)一步深入了解、研究CSU的生物學(xué)機(jī)制與治療靶點(diǎn)提供了新思路與方向。