高效液相色譜法測(cè)定不同柑橘品種新老葉類黃酮含量

程慧林 孫建城 吳群 鄭雪良

摘要 [目的]利用高效液相色譜法檢測(cè)9個(gè)不同柑橘品種新、老葉片類黃酮含量，分析各品種新、老葉片類黃酮種類及其含量。[方法]色譜柱為Waters ODS C 18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;以色譜乙腈（溶液A）和含有0.1%甲酸的超純水（溶液B）為流動(dòng)相，線性梯度洗脫，流速1 mL/min，柱溫25 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。[結(jié)果]不同柑橘品種新老葉片所含類黃酮組成差異較大，其中葡萄柚主要為柚皮蕓香苷和橙皮苷;胡柚以新圣草次苷和橙皮苷為主，椪柑主要為柚皮苷、甜橙黃酮和川陳皮素，新葉類黃酮化合物總量以汪村1號(hào)椪柑最高（21.153 mg/g），老葉以湯姆遜粉紅葡萄柚最高（14.307 mg/g）。[結(jié)論]9個(gè)柑橘品種之間，同一品種新、老葉間類黃酮含量和種類存在差異，大部分品種老葉含量和種類多于新葉。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜;柑橘;類黃酮;含量測(cè)定

中圖分類號(hào) R284? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2022）07-0184-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.07.043

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Determination of Flavonoid Content in New and Old Leaves of Different Citrus Varieties by High Performance Liquid Chromatography

CHENG Hui-ling，SUN Jian-cheng，WU Qun et al

（Quzhou Academy of Agricultural and Forestry Sciences，Quzhou，Zhejiang 324000）

Abstract [Objective] To determine and analyze flavonoids types and content in new and old leaves of 9 different citrus varieties by high performance liquid chromatograph （HPLC） method.[Method] The separation was carried on Waters ODS C 18 （4.6 mm×250 mm，5 μm） column kept at 25 ℃ using chromatography acetonitrile （solution A） and ultrapure water containing 0.1% formic acid （solution B） mixture as the mobile phase at a flow rate of 1 mL/min through linear gradient elution and the detection wavelength was set at 280 nm.[Result] The flavonoid composition in the leaves of citrus varieties was quite different.Narirutin and hesperidin were major flavonoids in grapefruit.Neoeriocitrin and hesperidin were major flavonoids in Huyou.Ponkan mainly contained naringin，sinensetin and nobiletin.Wangcun No.1 ponkan was highest of flavonoids content in new leaves with 21.153 mg/g and Thomson pink grapefruit was highest of flavonoids content in old leaves with 14.307 mg/g.[Concusion] There are differences in flavonoids types and content in new and old leaves of 9 different citrus varieties and old leaves higher than new leaves in most varieties.

Key words HPLC;Citrus;Plavonoids;Content determination

柑橘是我國(guó)廣泛種植的重要水果之一，有著豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和獨(dú)特的口感風(fēng)味，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。柑橘果實(shí)富含類黃酮、酚酸、類胡蘿卜素等活性物質(zhì)，還含有幾乎只存在柑橘屬中的多甲氧基黃酮，如川陳皮素、橘皮素、橙黃酮等[1]。研究表明，類黃酮具有抗癌、消炎、降血脂、強(qiáng)化毛細(xì)血管、抗過(guò)敏等作用[2]，除此之外，類黃酮具有廣譜的抑菌效果，對(duì)黃曲霉、青霉菌、革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用[3-5]。目前，柑橘中已經(jīng)鑒定得到80多種類黃酮，大多數(shù)柑橘品種以黃烷酮類和黃酮類為主，少數(shù)黃酮醇類、花色素類和多甲氧基黃酮（PMFs）等[2]。類黃酮測(cè)定方法主要有高效液相色譜法（HPLC）和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS），王智聰?shù)萚6]用HPLC法對(duì)西柚不同組織中的10種柑橘類黃酮化合物進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示柑橘類黃酮化合物在西柚果皮、囊衣和果瓣中的分布不同，含量差異顯著。劉曉娟[7]利用HPLC和LC-MS/MS在甌柑果皮中鑒定得到9種類黃酮，并對(duì)類黃酮單體進(jìn)行了鑒定和代謝規(guī)律分析，結(jié)果表明，CrOMT1 和CrOMT2具有調(diào)控PMFs合成的生物學(xué)功能，且在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，黃烷酮類糖苷在油胞層和白皮層的含量均呈下降趨勢(shì)，PMFs 特異地積累在果實(shí)油胞層中，呈先上升后下降的趨勢(shì)。除柑橘果實(shí)外，柑橘葉片、花及根也均富含類黃酮[8]，近年來(lái)，柑橘類黃酮的研究多集中在柑橘果實(shí)部分，如果皮、果肉和囊衣等，少有對(duì)柑橘葉片相關(guān)研究報(bào)道。該研究選取椪柑、胡柚和葡萄柚等9個(gè)不同柑橘品種材料，探討不同品種柑橘新、老葉片中類黃酮的含量和種類，以期為柑橘類黃酮在醫(yī)藥、保健、食品工業(yè)等方面的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試材。試驗(yàn)材料來(lái)自原衢州市經(jīng)濟(jì)特產(chǎn)站十里豐試驗(yàn)基地（后為衢州市農(nóng)業(yè)林業(yè)科學(xué)研究院），采集時(shí)間為2017年7月5日，葉片新葉為采自當(dāng)年新發(fā)出的春梢，從上往下第3片開始采集，老葉為采集新葉枝梢的前1年老熟秋梢，每個(gè)品種3棵樹，每棵樹隨機(jī)摘取新老葉各10片，混勻，即每個(gè)品種新老葉共30片。品種包括派溪頭椪柑、和陽(yáng)椪柑、黃皮椪柑、汪村1號(hào)椪柑、羅浮金柑、優(yōu)株胡柚、胡柚2號(hào)、湯姆遜粉紅葡萄柚、火焰葡萄柚。類黃酮的測(cè)定在浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1.2 試劑。標(biāo)準(zhǔn)品圣草次苷、新圣草次苷、柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷、異甜橙黃酮、甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素，美國(guó)Sigma-Aldrich公司;香風(fēng)草苷，百靈威生物科技有限公司;5-去甲川陳皮素（5-羥基-6，7，8，3′，4′-五甲氧基黃酮），云南西力生物技術(shù)股份有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備。真空濃縮儀（Concentrator plus，Eppendorf，德國(guó)）;Agilent高效液相色譜儀（安捷倫，美國(guó)）;KQ100DE數(shù)控超聲波儀（昆山超聲儀器有限公司）;Sigma3K15高速冷凍離心機(jī)（Sigma 公司，美國(guó)）;Millpore超純水器（Millpore 公司，美國(guó)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備。分別稱取柑橘葉片新鮮樣品粉末0.1 g，用80%乙醇3 mL超聲輔助提取30 min，提取液離心（4 000 r/min，10 min），重復(fù)超聲提取和離心步驟3次，合并上清（約9 mL），收集在離心管中，提取液利用真空濃縮儀濃縮 5 倍，重新溶解于甲醇中，過(guò)0.22 μm 濾膜后用HPLC檢測(cè)。利用類黃酮標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定性和定量分析。

1.2.2 HPLC色譜條件。采用 Agilent HPLC 系統(tǒng)，以 Waters ODS C 18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）為固定相;以色譜乙腈（溶液 A）和含有 0.1%甲酸的超純水（溶液 B）為流動(dòng)相，線性梯度洗脫，洗脫梯度為 0～5 min，20%A;5～10 min，20%～27%A;10～15 min，27%A;15～25 min，27%～40%A;25～35 min，40%～60%A;35～40 min，60%～80%A;40～42 min，80%～100%A;42～45 min，100%～20%A;45～50 min，20%A。檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm;柱溫25 ℃;進(jìn)樣量10 μL;流速1 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 類黃酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖 柑橘水果成分復(fù)雜，既有極性較大的糖類、氨基酸類、有機(jī)酸和酚酸類，又有極性適中的黃烷酮類和極性較小的多甲氧基黃酮等，同樣，在柑橘葉片中也具有多種類黃酮化合物。圖1是類黃酮化合物標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，13種化合物分離明顯，峰型較好。因9種樣品新、老葉都未檢測(cè)到香風(fēng)草苷，因此下文類黃酮含量沒(méi)有體現(xiàn)，特此說(shuō)明。

2.2 不同柑橘品種新老葉類黃酮總量的比較 從圖2可以看出，不同柑橘品種葉片類黃酮含量差異較大。新葉中，9種柑橘葉片類黃酮總量變異范圍為未檢測(cè)出～21.153 mg/g，黃皮椪柑新葉未檢測(cè)出類黃酮化合物，而汪村1號(hào)椪柑類黃酮總量最高，為21.153 mg/g，含有豐富的橙皮苷和川陳皮素;老葉的類黃酮總量有所不同，為0.564～14.307 mg/g，最大和最小分別是湯姆遜粉紅葡萄柚和火焰葡萄柚，兩者相差25倍，其次是羅浮金柑，類黃酮總量12.594 mg/g，在湯姆遜粉紅葡萄柚老葉中，橙皮苷占主要成分，高達(dá)13.710 mg/g。新葉類黃酮總量從大到小依次為汪村1號(hào)椪柑>胡柚2號(hào)>羅浮金柑>優(yōu)株胡柚>火焰葡萄柚>和陽(yáng)椪柑>派溪頭椪柑>湯姆遜粉紅葡萄柚>黃皮椪柑;老葉類黃酮總量從大到小依次為湯姆遜粉紅葡萄柚>羅浮金柑>和陽(yáng)椪柑>優(yōu)株胡柚>派溪頭椪柑>汪村1號(hào)椪柑>黃皮椪柑>火焰葡萄柚>胡柚2號(hào)。

2.3 不同柑橘品種新葉類黃酮含量和種類比較 從表1可以看出，不同柑橘品種新葉中類黃酮含量和種類各不盡相同。汪村1號(hào)椪柑新葉檢測(cè)出的類黃酮化合物種類最多，也是所有品種含量最高，橙皮苷含量最高，為15.906 mg/g，其次為川陳皮素（4.411 mg/g）、5-去甲川陳皮素（0.340 mg/g）、柚皮蕓香苷（0.325 mg/g）和異甜橙黃酮（0.170 mg/g）。優(yōu)株胡柚新葉中檢測(cè)出4種類黃酮化合物，分別為圣草次苷、新圣草次苷、柚皮蕓香苷和新橙皮苷，未檢測(cè)到PMFs?；鹧嫫咸谚?、胡柚2號(hào)和羅浮金柑新葉只檢測(cè)到2種類黃酮化合物，分別是柚皮蕓香苷和柚皮苷、圣草次苷和橙皮苷、圣草次苷和柚皮苷。湯姆遜粉紅葡萄柚、派溪頭椪柑、和陽(yáng)椪柑新葉中分別檢測(cè)到1種類黃酮化合物，分別為枸橘苷、柚皮苷和橙皮苷。黃皮椪柑新葉未檢測(cè)任何類黃酮化合物。以上新葉檢測(cè)出的類黃酮化合物種類中，大多都以黃烷酮類化合物居多，主要有圣草次苷、柚皮蕓香苷、柚皮苷和橙皮苷，而PMFs種類較少甚至未檢測(cè)到，如甜橙黃酮和橘皮素，未在任何柑橘品種檢測(cè)到。

2.4 不同柑橘品種老葉類黃酮含量和種類比較 從表2可以看出，不同柑橘品種老葉中類黃酮化合物含量和種類也有所不同。優(yōu)株胡柚老葉中類黃酮種類最多，黃烷酮類和PMFs都有檢測(cè)到，分別有圣草次苷、新圣草次苷、柚皮蕓香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷6種化合物和橘皮素、5-去甲川陳皮素2種PMFs，新圣草次苷、柚皮苷和橙皮苷占主要成分，含量分別是1.323、1.009和1.728 mg/g，但未檢測(cè)到枸橘苷、異甜橙黃酮、甜橙黃酮、川陳皮素4種類黃酮化合物。其次是羅浮金柑老葉，共檢測(cè)到5種化合物，圣草次苷含量最高（7.577 mg/g），橙皮苷（4.588 mg/g）其次，新圣草次苷、柚皮蕓香苷和柚皮苷含量較少。在9個(gè)樣品中，除胡柚2號(hào)、湯姆遜粉紅葡萄柚和火焰葡萄柚外，圣草次苷在其他6個(gè)品種都有分布，而柚皮蕓香苷雖在6個(gè)品種檢測(cè)到，但胡柚2號(hào)、派溪頭椪柑和陽(yáng)椪柑老葉未檢測(cè)到，而在湯姆遜粉紅葡萄柚和火焰葡萄柚老葉含有。與新葉不同的是，黃烷酮類化合物雖然都有檢測(cè)到，但在老葉中5種PMFs也有品種能檢測(cè)到，包括甜橙黃酮、橘皮素，分布于椪柑和胡柚中;最少的還是枸橘苷、異甜橙黃酮和5-去甲川陳皮素，都只有單個(gè)品種檢測(cè)到，分別是火焰葡萄柚、派溪頭椪柑和優(yōu)株胡柚。

3 討論與結(jié)論

前人對(duì)柑橘類黃酮的研究已有很多報(bào)道，主要集中在果實(shí)部分，如果實(shí)、果皮，也有不少研究不同的柑橘品種，如橙類、柚類和寬皮橘類[9-10]。方波等[11]研究表明，柑橘類黃酮組分和含量與柑橘遺傳基因有關(guān)，柚果實(shí)中類黃酮主要為柚皮苷，葡萄柚果實(shí)以柚皮苷和新橙皮苷為主;雜種后代類黃酮累積受其親本的影響。張玉等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在宮川溫州蜜柑、衢州椪柑、哈姆林甜橙、常山胡柚和蕉柑5種果皮中，常山胡柚類黃酮總量最高，且主要成分為柚皮苷和新橙皮苷，而宮川溫州蜜柑和哈姆林甜橙果皮中主要成分為橙皮苷;衢州椪柑和蕉柑果皮中主要成分為橙皮苷和川皮素。

該研究以9種不同品種的柑橘為材料，分析了其新、老葉類黃酮含量和組分變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同柑橘品種葉片所含類黃酮組成差異較大，其中葡萄柚主要為柚皮蕓香苷和橙皮苷;胡柚以新圣草次苷和橙皮苷為主，椪柑主要為柚皮苷、甜橙黃酮和川陳皮素，這與李利改等[10]的研究結(jié)果有所不同，可能是因?yàn)椴煌贩N之間存在的差異。PMFs是柑橘類黃酮的一個(gè)特殊分支，其中以川陳皮素、橘皮素和甜橙黃酮比較常見，具有很好的藥用價(jià)值[12-13]。該試驗(yàn)表明，在9種不同柑橘品種材料中，椪柑中的PMFs含量最為豐富，尤其是在新葉中，幾乎只在汪村1號(hào)椪柑（4.922 mg/g）當(dāng)中檢測(cè)到，而老葉中，除了優(yōu)株胡柚含有少量的PMFs（0.108 mg/g）外，派溪頭椪柑、和陽(yáng)椪柑、黃皮椪柑、汪村1號(hào)椪柑4個(gè)品種葉片都有檢測(cè)到，且以派溪頭椪柑葉片含量最多（3.692 mg/g），這與李利改等[10]和張玉等[9]的研究結(jié)果一致，由此可以說(shuō)明，PMFs多存在于寬皮柑橘類當(dāng)中，開發(fā)和利用潛力較大。

我國(guó)柑橘屬植物類黃酮化合物含量豐富，該試驗(yàn)結(jié)果顯示，除果實(shí)外，柑橘葉片同樣含有豐富的類黃酮化合物，但不同品種之間同一品種新老葉間存在差異。9個(gè)品種中，新葉類黃酮化合物以汪村1號(hào)椪柑含量最高（21.153 mg/g），老葉以湯姆遜粉紅葡萄柚（14.307 mg/g）最高，但在類黃酮種類上，大部分品種老葉多于新葉，尤其是派溪頭椪柑、和陽(yáng)椪柑和黃皮椪柑中，PMFs種類和含量上遠(yuǎn)高于新葉。我國(guó)作為柑橘生產(chǎn)大國(guó)，每年各生產(chǎn)基地都會(huì)因枝條修剪而生產(chǎn)大量的枝葉，往往會(huì)作為廢棄物粉碎、填埋等處理，然而其葉片含有豐富的類黃酮，如若能加以科學(xué)利用，開發(fā)提煉功能保健成分，變廢為寶，將具有很大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

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