真菌β-1,3-葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶研究進(jìn)展

付鑫,朱鴻安,崔鳳杰,2 *,昝新藝,孫文敬,2

1(江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江,212013) 2(江西省德興市百勤異VC鈉有限公司,江西 德興,334299)

葡聚糖是一大類由α/β-1,3、1,4或1,6-糖苷鍵連接葡萄糖單體形成的大分子多聚體,作為植物和真菌細(xì)胞壁的重要結(jié)構(gòu)組分之一,在維持細(xì)胞形狀和完整性、保護(hù)細(xì)胞免受內(nèi)部膨脹壓力和外部環(huán)境的影響等方面發(fā)揮關(guān)鍵性作用[1]。常見的β-1,3-葡聚糖包括可得然膠、普魯蘭多糖、昆布多糖、酵母細(xì)胞壁葡聚糖和香菇多糖等。真菌葡聚糖的免疫調(diào)節(jié)活性受到分子質(zhì)量、構(gòu)型、支鏈及分支度等的顯著影響，特別是含有β-1,3-鏈接的主鏈、β-1,6-鏈接的側(cè)鏈的葡聚糖具有良好的水溶性、免疫增強(qiáng)、調(diào)節(jié)腸道菌群和降血糖等功能[2]。MORALES等[3]發(fā)現(xiàn)，香菇子實(shí)體中含有β-1,6-的葡聚糖G1、β-1,3/1,6-的葡聚糖G2和α-1,3-的葡聚糖G3，其中G1具有較高的抗氧化活性。

當(dāng)前,葡聚糖的合成途徑還未被系統(tǒng)地研究和闡明,但基因組學(xué)、分子遺傳學(xué)等學(xué)科的發(fā)展,很大程度加快了對真菌葡聚糖合成途徑和結(jié)構(gòu)重構(gòu)機(jī)制的認(rèn)知。有關(guān)真菌葡聚糖生物合成的研究主要集中在菌體結(jié)構(gòu)相對簡單、遺傳操作效率相對較容易的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)和粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)等低等真菌中[4-5]。以釀酒酵母葡聚糖的合成為例,通常認(rèn)為,胞外葡萄糖被攝入后經(jīng)過糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(phosphotransferase system,PTS)轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸;進(jìn)而通過葡萄糖-6-磷酸變位酶將其異構(gòu)為葡萄糖-1-磷酸;再由UDP-葡萄糖焦磷酸化酶催化合成為UDP-葡萄糖,經(jīng)葡聚糖合成酶將其轉(zhuǎn)移到葡聚糖主鏈的非還原端合成β-葡聚糖。新合成的β-葡聚糖經(jīng)特定糖基轉(zhuǎn)移酶和水解酶的共同作用進(jìn)行重構(gòu)、交聯(lián),形成不同分子量和分支結(jié)構(gòu)的β-葡聚糖,與殼聚糖等共同構(gòu)成細(xì)胞壁[6]。目前已有GH16、GH17和GH72等家族的糖基水解酶或者糖基轉(zhuǎn)移酶被證明在細(xì)胞壁組分的交聯(lián)中發(fā)揮作用。其中,GH16 家族水解酶(β-葡聚糖酶)主要參與葡聚糖和幾丁質(zhì)的交聯(lián),GH17 家族水解酶(β-葡聚糖酶)在葡聚糖之間的交聯(lián)中起作用,GH76 家族的甘露聚糖酶在細(xì)胞壁的生物發(fā)生中起作用,而GH72家族的β-1,3-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶則被認(rèn)為通過形成多分支的β-1,3-葡聚糖，主要參與細(xì)胞壁的重構(gòu)。這些細(xì)胞壁重構(gòu)酶中,屬于GH72 家族的β-1,3-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶為重塑細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)做出了重要的貢獻(xiàn)。因此,本文就近年來GH72 家族的β-1,3-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶領(lǐng)域的主要研究結(jié)果進(jìn)行綜述和展望。

1 β-1,3-葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶及其分類

糖基轉(zhuǎn)移酶是指將單糖共價(jià)連接到多種有機(jī)底物上的一大類酶,這些酶驅(qū)動復(fù)雜的寡糖的合成,在細(xì)胞的整個(gè)生命周期中起著關(guān)鍵作用。β-1,3-葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶能夠以β-1,3-糖苷鍵連接的葡聚糖為轉(zhuǎn)糖苷的受體和供體,通過轉(zhuǎn)糖苷作用生成新的糖苷鍵[7]。

GH72家族 β-1,3-葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶是指能夠以β-1,3-糖苷鍵連接的葡聚糖為轉(zhuǎn)糖苷的受體和供體的一類葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶，其通過內(nèi)部切割 β-1,3-葡聚糖，將新生成的還原端轉(zhuǎn)移到另一個(gè) β-1,3-葡聚糖分子的非還原端，使受體和供體分子之間產(chǎn)生新的 β-1,3-鍵，延伸和分支 β-1,3-葡聚糖的糖鏈[7-8]。截止目前，來源于細(xì)菌、絲狀真菌及酵母的 157種蛋白被鑒定為β-1,3-葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶家族成員，均屬于糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidylinositol, GPI)錨定的膜蛋白[9-10]。常見的β-1,3-葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶主要為煙曲霉、釀酒酵母和白色念珠菌中的同源基因Gel、Gas和Phr編碼的蛋白。

GH72家族成員包括72+和72-兩個(gè)亞家族(圖1),均含有1個(gè)GH72結(jié)構(gòu)域和1個(gè)連接區(qū),GH72結(jié)構(gòu)域包含2個(gè)對催化至關(guān)重要的保守谷氨酸殘基和3個(gè)保守的酪氨酸殘基。對其家族的蛋白質(zhì)序列的多重比對發(fā)現(xiàn),除了典型的催化結(jié)構(gòu)域外,72+和72-亞家族的區(qū)別主要在于其C-端是否有無半胱氨酸的碳水化合物結(jié)合模塊(carbohydrate-binding module family 43,CBM43,在Pfam數(shù)據(jù)庫中又被注釋為X8結(jié)構(gòu)域)[11]。GH72+亞家族同時(shí)擁有GH72結(jié)構(gòu)域和CBM43域;GH72-亞家族缺少CBM43/X8,其在C-末端有1個(gè)低復(fù)雜性區(qū)域。盡管二者存在區(qū)別,但GH72+和 GH72-均表現(xiàn)出相同的體外轉(zhuǎn)糖苷酶的活性,這也提示CBM43域在 GH72+酶的催化過程中起到更微妙的作用。在一些GH72家族成員中,在 C -端 GPI 連接信號之前的 C-端區(qū)域中存在1個(gè)高度O-甘露糖基化且對活性是可有可無的富含絲氨酸/蘇氨酸的區(qū)域(Ser/Thr-box)。另外,GH72酶還共享1個(gè)由規(guī)則間隔的半胱氨酸殘基組成的保守模式,這些殘基形成分子內(nèi)的二硫鍵。在GH72+亞家族中,存在2個(gè)二硫鍵簇：簇I由3個(gè)二硫鍵組成,涉及GH72結(jié)構(gòu)域和連接區(qū)保守的半胱氨酸殘基,簇II由4個(gè)二硫鍵組成,連接位于CBM43/X8的半胱氨酸殘基。而在GH72-酶中缺少簇II,這表明GH72結(jié)構(gòu)域和CBM43構(gòu)成了一個(gè)完整的結(jié)構(gòu)和功能單元[12]。只有GH72+蛋白(如Gas1p、Gas2p和AfGel4p)具有延長和分支活性,而GH72-酶(如Gas5p、AfGel1p和AfGel2p)具有延長而不具有分支活性,表明CBM43對于正確識別催化底物、定位催化位點(diǎn)和形成分支結(jié)構(gòu)必不可少[13]。

圖1 GH72家族系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of GH72 family

2 真菌β-1,3-葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶

2.1 煙曲霉β-1,3-葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶Gel家族

煙曲霉(Aspergillusfumigatus)的細(xì)胞壁構(gòu)成主要是由 β-1,3-葡聚糖聚合物作為骨架,β-1,6分支點(diǎn)的支鏈葡聚糖作為側(cè)支,共價(jià)結(jié)合甲殼素、半乳甘露聚糖等其他組分[14]。GH72家族 β-1,3-葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶在葡聚糖內(nèi)切割糖鏈,并將新產(chǎn)生的還原端轉(zhuǎn)移到另一個(gè)β-1,3-葡聚糖分子的非還原端,實(shí)現(xiàn)其β-1,3-葡聚糖鏈的延長[14]。煙曲霉含有編碼GH72家族蛋白的7個(gè)基因Gel1～Gel7;其中Gel1(AFUA_2G01170)、Gel2(AFUA_6G11390)、Gel6(AFUA_3G13200)屬于GH72-亞家族,Gel3 (AFUA_2G12850)、Gel4(AFUA_2G05340)、Gel5(AFUA_8G02130)、Gel7(AFUA_6G13200)屬于GH72+亞家族。Gel1、Gel2和Gel4等3個(gè)基因在一系列的生長條件下,在菌絲生長過程中組合型表達(dá),分別對葡聚糖的合成、菌絲形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞壁完整性和致病能力等有著不同程度的影響[15]。在煙曲霉細(xì)胞壁中分離得到 β-1,3-葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶Gel1p,克隆和測序編碼該酶的Gel1基因,結(jié)果表明,純化重組的GEL1p 通過GPI以與酵母同源蛋白相似的方式附著在煙曲霉細(xì)胞膜[16]。Gel1p在體外催化β-1,3-葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶的兩步反應(yīng)：首先,切斷供體β-1,3-葡聚糖鏈的內(nèi)部糖苷鍵,釋放還原部分;然后將新的還原端轉(zhuǎn)移到受體 β-1,3-葡聚糖鏈的非還原端,從而延長其長度。Gel2p與Gel1p類似，屬于GPI錨定蛋白，包含4個(gè)內(nèi)含子、5個(gè)N-糖基化位點(diǎn),也具有 β-1,3-葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶活性。有研究表明,Gel1p與Gel2p都能夠補(bǔ)充釀酒酵母中 ΔGas1p的缺失,充分證實(shí)了Gel1p、Gel2p與Gas1p具有類似的催化功能。然而,Gel1的缺失不會導(dǎo)致表型的改變,而ΔGel2突變體和ΔGel1ΔGel2雙突變體則表現(xiàn)出生長緩慢、分生孢子發(fā)生異常和細(xì)胞壁組成變化的現(xiàn)象。

煙曲霉Gel4p含有碳水化合物結(jié)合域CBM43[17],具有延伸 β-1,3-葡聚糖和分支糖鏈的雙重功能[18]。敲除Gle4會導(dǎo)致β-1,3-葡聚糖分支的消失,進(jìn)而影響菌株生長。Gel4p在所有生長時(shí)期表達(dá)量最多。通過構(gòu)建插入了Gel4 ORF的含有潮霉素抗性標(biāo)記的敲除盒用于轉(zhuǎn)化煙曲霉原生質(zhì)體,但未能成功獲得突變體,提示Gel4是其生長過程中必不可少的基因[17]。

β-1,3-葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶的正?；钚员磉_(dá)需要N-糖基化。N-糖基化缺失顯著下調(diào)突變株的細(xì)胞壁中 β-葡聚糖含量。為驗(yàn)證這一功能,在ΔCwh41突變體中缺失編碼 β-1,3葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶基因Gel1或Gel2的基因,構(gòu)建雙突變體ΔGel1ΔCwh41或ΔGel2ΔCwh41,其生長表型與單突變體 ΔCwh41 相似,表明 Gel1和 Gel2是主要受ΔCwh41 中N-糖基化加工缺陷影響的蛋白質(zhì)。通過定點(diǎn)突變?nèi)コ送蛔凅wΔGel1Gel1-NMΔGel2Gel2-NM中Gel1p或Gel2p上所有潛在的N-糖基化位點(diǎn)后,其表現(xiàn)出與單一突變體ΔGel1或ΔGel2相似的表型。因此,N-糖基化對于 Gel1p 或 Gel2p 發(fā)揮功能必不可少[19]。

煙曲霉Gel7p是一種帶有N-末端連接碳水化合物的錨定蛋白,主要通過GPI錨定結(jié)合到細(xì)胞膜和細(xì)胞壁上,不受N-糖基化的影響,這表明在N-糖鏈加工缺陷的突變體中,Gel7可能參與維持N-糖鏈加工缺陷突變體細(xì)胞壁的完整性,特別是在高溫條件下。在突變菌株 ΔCwh41或 ΔGel1ΔCwh41中進(jìn)一步敲除Gel7,導(dǎo)致其異常分生,細(xì)胞壁 β-1,3-葡聚糖含量顯著減少,萌發(fā)延遲;與野生株相比,ΔGel7在37 ℃時(shí) β-葡聚糖和甲殼素的含量分別下降了21.5%和11.1%,50 ℃時(shí)β-葡聚糖和甲殼素的含量分別下降了25.6%和26.2%[20]。同時(shí)Gel7是煙曲霉分生孢子發(fā)生所必需的,Gel7p與Gel1p和Gel2p的序列相似,包括催化區(qū)FF(A/S)GNEV(用于催化酸堿)和F(F/L)(S/A)EYGCN(用于親核殘基)的兩個(gè)保守的天冬氨酸殘基,表明Gel7p也具有 β-1,3-糖基轉(zhuǎn)移酶活性[21]。在菌絲萌發(fā)階段Gel2和Gel7的表達(dá)量顯著提高,在菌絲生長階段它們的表達(dá)則被抑制;Gel1則在菌絲生長階段被誘導(dǎo)表達(dá),表明在菌絲生長發(fā)育過程中Gel1、Gel2和Gel7的表達(dá)均受到一定程度的調(diào)節(jié),其在不同時(shí)期表現(xiàn)出不同的功能。據(jù)此可推測,Gel7是煙曲霉分生孢子發(fā)生所必需的,同時(shí)在ΔGel7中可明顯誘導(dǎo)出Gel1～Gel6,表明Gel家族之間存在著密切的聯(lián)系。

2.2 副球孢子菌Paracoccidioides β-1,3-葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶Gel家族

副球孢子菌ParacoccidioidesGel家族Gel1p(XP_002794189)和Gel2p(XP_002793109)屬于GH72-亞家族,Gel4p(XP_002792932)屬于GH72+亞家族。Gel1p、Gel2p和Gel4p具有相同的保守序列,其N-端相連的信號肽序列以及C端相連的GPI錨定區(qū)域與GH72蛋白家族中存在的保守結(jié)構(gòu)域相同。其中Gel3p還包含1個(gè)Cys-Box的結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域包含6個(gè)保守的半胱氨酸殘基[12]。研究結(jié)果表明,Gel1p與細(xì)胞壁合成密切相關(guān),Gel2p可能在細(xì)胞質(zhì)中合成,與細(xì)胞壁形成相關(guān)。遺傳互補(bǔ)研究顯示,Gel2p能夠恢復(fù)ΔGas1突變體中Gas1p活性的缺失,提示其參與維持真菌細(xì)胞壁的完整性;而Gel1p則無類似的功能。然而,Gel1p可恢復(fù)ΔGas1突變體中的端粒沉默,表明Gel1p可能參與了擬南芥中的轉(zhuǎn)錄沉默。而Gel4p具有恢復(fù)釀酒酵母ΔGas1突變表型的能力,表明其在真菌的細(xì)胞壁生物合成和形態(tài)變化過程中起積極作用[22]。

2.3 酵母β-1,3-葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶Gel家族

酵母細(xì)胞壁中含量最豐富的多糖為β-1,3-葡聚糖,主要由1個(gè)催化亞基FKS和至少1個(gè)調(diào)節(jié)亞基Rho-1組成的葡聚糖合成酶復(fù)合體(glucan synthase complex,GSC)催化合成[23]。在細(xì)胞膜外空間,GH72家族酶催化β-1,3-葡聚糖的線性伸長以及延長分支點(diǎn)形成糖鏈側(cè)支[24]。

釀酒酵母Gas多基因家族含有編碼GH72家族蛋白的5個(gè)基因Gas1～Gas5。Gas1p和Gas2p屬于GH72+亞科,而Gas3p、Gas4p和Gas5p屬于GH72-亞科。序列分析發(fā)現(xiàn),釀酒酵母中5個(gè)同源Gas蛋白Gas1～Gas5蛋白共享一個(gè)分泌信號序列和一個(gè)名為NtD的N-末端結(jié)構(gòu)域,但各蛋白具有不同的C-末端延伸。另外僅在Gas1p和Gas2p中存在類似于碳水化合物結(jié)合域CBM43的Cys-Box結(jié)構(gòu)域,其對于Gas蛋白的功能和穩(wěn)定性必不可少。鑒于在所有 Gas 蛋白和所有 GH72 家族成員中保守的兩個(gè)谷氨酸殘基已被證明對催化至關(guān)重要,推測NtD 為Gas家族的主要催化結(jié)構(gòu)域[25]。

Gas1p是一種GIP錨定蛋白,主要定位于細(xì)胞膜上,在營養(yǎng)生長過程中表達(dá),在細(xì)胞壁組裝中起關(guān)鍵作用。Gas1p的缺失導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)發(fā)生缺陷和細(xì)胞壁葡聚糖分支交聯(lián)比例的減少[26]。目前已經(jīng)證明酵母蛋白Gas1p、Phr1p和Phr2p具有與煙曲霉Gel1p、Gel2p蛋白和白色念珠菌的ScGas1、CaPhr1和CaPhr2蛋白相同的催化殘基和體外活性,此外,AfGel1、AfGel2和CaPhr1可以恢復(fù)釀酒酵母Gas1缺失突變體的缺陷表型[19]。轉(zhuǎn)錄組分析表明,Gas1+Gas5基因?qū)υ跔I養(yǎng)生長過程中表達(dá),在減數(shù)分裂和產(chǎn)孢過程中受到抑制,而Gas2+Gas4基因則相反,其在孢子形態(tài)發(fā)生過程中起著重要的作用[27]。在營養(yǎng)生長過程中,Gas1p和Gas5p是細(xì)胞壁形成所必需的,其中Gas1p起主要作用,而Gas5p只起輔助作用。Gas2p和Gas4p是形成孢子壁所必需的,其機(jī)制是使孢子內(nèi)壁層和外壁層相互連接,二者的缺失會導(dǎo)致無法正常形成孢子[28]。Gas3p作為釀酒酵母中一種高度甘露糖化發(fā)育調(diào)劑蛋白,但未呈現(xiàn)相關(guān)活性,在營養(yǎng)生長和孢子形成期間弱表達(dá)[29-30]。

粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)基因組中存在4個(gè)編碼 β-1,3-葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶的基因Gas1+、Gas2+、Gas4+和Gas5+，包含保守轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域[31]，同時(shí)還含有CBM43以及富含Ser或Cys的結(jié)構(gòu)域，并在C-末端存在GPI部分結(jié)合位點(diǎn)的疏水區(qū)[25]。在營養(yǎng)生長過程中，只有Gas1+、Gas2+和Gas5+表達(dá)，且其隨細(xì)胞周期變化呈周期性變化，提示各基因在細(xì)胞營養(yǎng)生長周期的不同階段發(fā)揮不同的功能。例如，Gas1+和Gas5+的轉(zhuǎn)錄水平在有絲分裂期間最高，而Gas2+轉(zhuǎn)錄水平在分裂前期較高；而在營養(yǎng)生長期Gas4+的表達(dá)水平最低，但在孢子形成期間顯著增加[32]。此外，Gas1+在維持細(xì)胞的完整性和活力以及細(xì)胞形態(tài)發(fā)生等過程均起到重要作用；ΔGas1突變體在沒有滲透穩(wěn)定劑的情況下無法存活并不能經(jīng)歷細(xì)胞裂解。在敲除Gas1后，細(xì)胞裂解發(fā)生在活躍的生長區(qū)域(極點(diǎn)和隔區(qū))，不裂解的細(xì)胞表現(xiàn)為形態(tài)發(fā)生缺陷，即兩極變寬或內(nèi)側(cè)區(qū)域變寬，提示Gas1p是裂殖酵母營養(yǎng)生長所必需。相反，ΔGas2突變體和ΔGas5突變體，甚至雙ΔGas2ΔGas5突變體，在所有培養(yǎng)溫度均可正常生長，并未顯示出明顯的生長缺陷[19]

2.4 稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae) β-1,3-葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶Gel家族

通過與酵母中編碼Gas蛋白的基因序列相似性比對,現(xiàn)已推測出M.oryzae中含有5種Gelp,分別是Gel1p(MGG_07331.7)、Gel2p(MGG_06722.7)、Gel3p(MGG_08370.7)、Gel4p(MGG_11861.7)和Gel5p(MGG_03208.7)。該Gel家族含有一個(gè)N-端信號肽,其后是一個(gè)催化的GH72結(jié)構(gòu)域(GH72 Pfam：PF03198),一個(gè)連接C-端低復(fù)雜度區(qū)域,Ser/Thr為29%～40%和一個(gè)公認(rèn)的GPI錨點(diǎn)[33]。而Gel3p和Gel4p還包含一個(gè)X8結(jié)構(gòu)域(PF07983)。據(jù)此,Gel3和Gel4屬于GH72+亞家族,而Gel1、Gel2和Gel5屬于GH72-亞家族。

ΔGel1ΔGel3ΔGel4M.oryzae突變體的細(xì)胞壁呈顯著變化,其中β-1,3-葡聚糖的聚合度比野生型菌株更高,分支更少。該突變體在基因表達(dá)的整體模式、超分支表型和無孢子形成方面均表現(xiàn)出顯著的差異,缺失3個(gè)Gel編碼基因ΔGel1ΔGel3ΔGel4的突變體不能引起稻瘟病,并且表現(xiàn)出超支菌絲和無孢子發(fā)育表型,表明Gelp在真菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)修飾中起著重要作用,下調(diào)β-1,3-葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶的活性可顯著干擾細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)完整性和靈活性。分析ΔGel3ΔGel4M.oryzae突變體的細(xì)胞壁多糖結(jié)構(gòu)也顯著變化,其中β-1,3-連接的葡萄糖殘基比例增加,末端葡萄糖和在分支點(diǎn)(1,3,6-Glcp)的殘基比例較低。這些數(shù)據(jù)表明,Gel3p與Gel4p在β-1,3-葡聚糖鏈的延伸過程中發(fā)揮作用,并參與分支結(jié)構(gòu)的形式。

2.5 白假絲酵母(Candida albicans) β-1,3-葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶Gel(Phr/Pga)家族

在Candidaalbicans中,Phr家族含有編碼GH72家族蛋白的5個(gè)基因Phr1～Phr3、Pga4、Pga5。其中Phr1p、Phr2p和Pga5p是GH72+亞家族的成員,Phr3p和Pga4p是GH72-亞家族的成員。

進(jìn)化分析結(jié)果表明，Phr1和Phr2是Gas1的同源基因，Phr3與Gas4同源，Phr1和Phr2缺失顯著影響C.albicans的細(xì)胞形態(tài)；Pga4和Pga5則分別與Gas5和Gas2同源。目前，Phr家族功能的研究主要集中在Phr1p、Phr2p和Pga4p。結(jié)果表明，培養(yǎng)基成分、溫度和細(xì)胞形態(tài)對Phr1的轉(zhuǎn)錄水平影響不顯著[34]；但在pH為7.5～8.0條件下，Phr1表達(dá)水平最高；而Phr2的表達(dá)水平變化趨勢與Phr1相反，其在pH 4.0時(shí)最高，隨著pH的增加而降低[35]。與Phr1和Phr2不同，其他家族成員的表達(dá)完全不受環(huán)境pH的影響。Phr3被認(rèn)為是該家族中唯一包含內(nèi)含子并編碼缺乏可識別的GPI附著位點(diǎn)的蛋白質(zhì)的基因[36]。通常認(rèn)為，Phr3p和Pga5p與孢子形成有關(guān)，因此，在C.albicans繁殖和生長過程中，Phr3和Pga5并未發(fā)揮出相應(yīng)的功能；另外，研究顯示，缺失Prh3、Pga4或Pga5并未顯著影響C.albicans的生長、形態(tài)或毒力，而Phr1、Phr2和煙曲霉菌的Gel1、Gel2被證明與小鼠感染模型致病密切相關(guān)[37-38]

3 真菌β-1,3-葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶的催化機(jī)制

為了探究 β-1,3-葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶的延長與分支糖鏈的功能,在釀酒酵母中鑒定出GH72家族糖基轉(zhuǎn)移酶Gas1p和GH17家族糖基轉(zhuǎn)移酶Bgl2p分別參與 β-1,3-葡聚糖分支。之前的研究表明,在 β-1,3-葡聚糖上引入 β-1,6-鍵是由GH17家族Bgl/Bgt蛋白完成的,其可從 β-1,3-寡糖的還原端切割葡萄糖單元,將酶結(jié)合的低聚糖轉(zhuǎn)移到受體 β-1,3-寡糖或非還原端的C-6或內(nèi)部葡萄糖單元的C-6上形成分支[39]。

以釀酒酵母為模型,通過建立定量測定β-1,3-葡聚糖上β-1,6-支鏈的方法,主要是通過放射性標(biāo)記底物UDP-(14C)葡萄糖,對其中分支減少的缺失突變體進(jìn)行篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與野生型菌株相比,ΔBgl2突變體和ΔGas1突變體的分支分別減少了15%和70%[18]。野生型菌株呈橢圓形,芽痕集中在一極[24]。而ΔGas1突變體表現(xiàn)出輕微的生長缺陷,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,細(xì)胞呈球形,芽痕分散[40]。ΔGas1ΔBgl2雙突變體表現(xiàn)為沒有分支,表現(xiàn)為生長速度慢、細(xì)胞形狀圓、出芽方式隨機(jī)。而ΔGas1突變體和ΔGas1ΔBgl2雙突變體細(xì)胞壁中的β-1,6-葡聚糖含量分別比野生型菌株降低了90%和98%,在細(xì)胞壁上沒有β-1,3-葡聚糖和β-1,6-葡聚糖的分支,表明 β-1,6-葡聚糖的生物合成發(fā)生在細(xì)胞壁,β-1,3-葡聚糖的衍生物是β-1,6-葡聚糖生物合成所必需的[41]。ΔBgl2突變體沒有表現(xiàn)出 β-1,3-葡聚糖分支缺陷或明顯的生長問題,這表明存在額外的替代分支機(jī)制[42]。而研究表明,GH72家族中ScGas1p、ScGas2p和AfGel4p具有雙重的β-1,3-葡聚糖伸長和分支活性,其在其C-末端都含有CBM43,同樣屬于GH72家族但缺乏CBM43的ScGas5p、AfGel1p和AfGel2p只顯示了延伸β-1,3-葡聚糖的活性。

綜上所述,在釀酒酵母中,Gas1p和Bgl2p都參與了細(xì)胞壁的β-1,3-葡聚糖的 β-1,6-分支的形成,Gas1p負(fù)責(zé)主要的分支活性,但在Gas1p和Bgl2p同時(shí)存在的情況下表現(xiàn)出最佳的分支活性,這表明它們在 β-1,3-葡聚糖分支過程中具有協(xié)同作用(如圖2所示)。Bgl2p優(yōu)先使用短鏈(≥5),而Gas1p的分支活性首先需要形成長葡聚糖(≥11)。β-1,3-葡聚糖線性伸長是前提條件,CBM43對伸長的 β-1,3-葡聚糖的定位是Gas蛋白后續(xù)分支活性所絕對需要的。

圖2 釀酒酵母細(xì)胞壁β-(1,3)-葡聚糖分支的可能機(jī)制[18]Fig.2 Predicted mechanism of S.cerevisiae cell wall β-(1,3)-glucan branching[18]

4 展望

近20年來的研究已顯著提高了對真菌葡聚糖結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識。然而,有關(guān)葡聚糖糖鏈的延伸和分支化的形成仍認(rèn)識不足。例如,GEL家族是否也具有切割β-(1→6)-葡聚糖糖鏈的功能？能否轉(zhuǎn)移β-(1→6)-糖鏈至β-(1→3)-葡聚糖糖鏈或轉(zhuǎn)移β-(1→3)-糖鏈至β-(1→6)-糖鏈,形成多分支的β-(1→3)/β-(1→6)-葡聚糖？這些過程還有待進(jìn)一步系統(tǒng)研究和全面揭示。為此,今后還可以在以下幾個(gè)方面做進(jìn)一步分析：(1)準(zhǔn)確檢測β-1,3-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶催化產(chǎn)物(中間產(chǎn)物)的結(jié)構(gòu)性質(zhì)是解析其切割和轉(zhuǎn)移糖鏈的規(guī)律和機(jī)制的基礎(chǔ);(2)β-1,3-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的生化性質(zhì)、晶體結(jié)構(gòu)等尚需進(jìn)一步準(zhǔn)確解析;(3)不同來源的真菌β-1,3-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶的催化形成β-(1→3)/β-(1→6)-分支化葡聚糖的機(jī)制的共性和區(qū)別還需系統(tǒng)對比;(4)可構(gòu)建CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)靶向敲除真菌β-1,3-葡聚糖轉(zhuǎn)移酶,通過觀察菌絲形態(tài)和細(xì)胞壁微觀結(jié)構(gòu)、葡聚糖分支化位點(diǎn)以及分支度等,明確其在葡聚糖合成和細(xì)胞壁形成過程中發(fā)揮的作用。這些研究將為真菌葡聚糖,特別是食藥用真菌多分支葡聚糖的靶向合成以及高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的開發(fā)與利用提供一定的理論依據(jù)。