基于ICP-MS結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的不同品牌醬香型白酒鑒別方法

卓俊納,吳衛(wèi)宇,何霜,趙金松,3*

1(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院,四川 宜賓,644000) 2(四川國檢檢測有限責(zé)任公司,四川 瀘州,646000)3(四川省酒業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司,四川 瀘州,646500)

白酒是我國特有的傳統(tǒng)酒種，與白蘭地、威士忌、伏特加、金酒、朗姆酒合稱為世界六大蒸餾酒[1]，它擁有獨(dú)特的釀造工藝和獨(dú)特的酒體風(fēng)味，因此深受消費(fèi)者的喜愛。其中，醬香型白酒是中國傳統(tǒng)白酒的代表之一[2]，由于其“2次投糧，9次蒸煮，8次發(fā)酵，7次取酒”的特殊釀造工藝[3-4]造就了其“醬香突出、幽雅細(xì)膩、酒體醇厚、回味悠長、空杯留香持久”的風(fēng)味特點(diǎn)[5-6]。近年來，醬香型白酒的市場規(guī)模不斷擴(kuò)大。隨著人們對白酒的深入研究，白酒中的無機(jī)元素越來越受到人們的重視[7]。無機(jī)元素與白酒的品質(zhì)息息相關(guān)，且會對引用者的身體健康造成影響[8-10]。無機(jī)元素含量過高不僅會影響白酒的色澤、口感，且會對人體的身體機(jī)能形成一定干擾和影響，造成慢性中毒，危害健康[11]。GB 2762—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》對白酒中的鉛有了更低的限量(0.5 mg/kg)。白酒中無機(jī)元素主要有兩種，一是原料谷物種植過程中，受空氣、土壤等因素的影響而出現(xiàn)的無機(jī)元素；二是釀酒生產(chǎn)過程中，水源、釀酒設(shè)備以及儲存容器帶入白酒的無機(jī)元素，造成白酒重金屬的污染[12]。

檢測白酒中無機(jī)元素的方法有原子吸收光譜法[13]、原子熒光光譜法[14]、電感耦合等離子發(fā)射光譜[15]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)[16]等，其中ICP-MS可針對不同元素予以測定，且此法操作簡單，測定速度較快，精準(zhǔn)度較高，能夠進(jìn)行同位素分析和有機(jī)物中金屬元素的形態(tài)分析[17]，可全面應(yīng)用于環(huán)境[18]、食品[19]檢測乃至法庭科學(xué)[20]等行業(yè)。隨著檢測技術(shù)的不斷成熟，需根據(jù)不同待測物找到有效的數(shù)據(jù)處理和分析方法。郭金喜等[21]利用ICP-MS/MS測定新疆黑枸杞紅酒22種微量元素，并對3種新疆黑枸杞紅酒15個樣品進(jìn)行分析，提取其中的5種成分來評判新疆黑枸杞紅酒中微量元素的分布。楊雯懿等[1]采用ICP-MS/MS測定4個地區(qū)18種白酒中14種元素的含量，并結(jié)合主成分分析(principal component analysis，PCA)和聚類分析(hierarchical cluster analysis，HCA)完成對白酒類別的初步甄別，不同地方釀造的白酒無機(jī)元素含量差異顯著。綜上所述，利用檢測技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)能對數(shù)據(jù)隱含的更深層次的信息進(jìn)行有效挖掘和分析[22]。

本實(shí)驗(yàn)以4個不同品牌的52種醬香型白酒為研究對象，采用ICP-MS檢測白酒中16種無機(jī)元素的含量，并結(jié)合HCA、PCA以及偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)等辦法分析不同品牌醬香型白酒中無機(jī)元素的差異，可為醬香型白酒快速分類以及鑒別提供科學(xué)有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 樣品、試劑與儀器

1.1.1 樣品

4個品牌共計(jì)52個酒樣,包括仙潭酒業(yè)酒樣11個(X1～X11);羽豐酒業(yè)酒樣11個(Y1～Y11);普照酒業(yè)酒樣13個(P1～P13);紅軍杯酒業(yè)酒樣17個(H1～H17);驗(yàn)證酒樣2個(Z1、Z2,均為普照酒業(yè)酒樣),所有酒樣均由相應(yīng)酒廠提供。

1.1.2 試劑與儀器

試劑：Ca、Na、K、Mg、Cu、Fe、Mn、Zn、Sr、Al、As、Cd、Cr、Ni、Pb和Se單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液,國家有色金屬及電子材料分析測試中心;硝酸(65%分析級),德國Merck公司;超純水(18.2 MΩ),實(shí)驗(yàn)室自制。

儀器：ICP-MS NexION2000電感耦合等離子體質(zhì)譜儀,美國PE公司;MARS 6微波消解儀,美國CEM公司;SIGMA 3-18KS高速離心機(jī)、BS224S萬分之電子天平,賽多利斯;DZF—6090真空干燥箱,上海一恒科學(xué)儀器;超純水機(jī),美國Milli-Q公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

吸取5 mL酒樣于微波消解管,然后再將其放入石墨趕酸器中蒸發(fā),蒸發(fā)溫度80 ℃。當(dāng)蒸發(fā)剩余2 mL時,繼續(xù)加入5 mL的硝酸,蓋好蓋子保存1 h,按照表1中的參數(shù)進(jìn)行微波消解。

表1 微波消解程序Table 1 Microwave digestion program

消解完成后置于超聲水浴中放置10 min,再用超純水定容至50 mL,搖勻備用。同時做空白試驗(yàn)。

1.2.2 ICP-MS工作條件

檢測樣品前使用1 μg/L的調(diào)諧液調(diào)諧儀器,滿足儀器程序要求的靈敏度、背景、氧化物、雙電荷和穩(wěn)定性指標(biāo),調(diào)諧后ICP-MS的工作參數(shù)為：RF功率1 250 W,霧化器流量0.97 L/min,輔助氣流量1.2 L/min,等離子體氣流量15 L/min,采樣深度0 nm,樣品錐孔徑0.88 mm,截取錐孔徑1.1 mm,超截取錐孔徑1.0 mm,采集駐留時間50 ms,霧室溫度2 ℃,采集次數(shù)3次。

1.2.3 測定方法

為了消除質(zhì)譜干擾,本文采用氨氣反應(yīng)模式(NH3DRC)和氦氣碰撞模式(He KED)消除干擾,并通過在線加入72Ge、103Rh、185Re作為內(nèi)標(biāo),分區(qū)段監(jiān)測多元素的質(zhì)譜行為。鑒于各元素本身特征與濃度等存在顯著差距,故將K、Na、Ca、Mg、Al配成一組混標(biāo),系列質(zhì)量濃度為：0、0.2、1.0、5.0、10.0、15.0、20 mg/L。Cu、Fe、Mn、Zn、Sr配成一組混標(biāo),系列質(zhì)量濃度為：0、0.05、0.20、0.6、1.0、1.5、2.0 mg/L。As、Cd、Cr、Ni、Pb、Se配成一組混標(biāo),系列質(zhì)量濃度為：0、0.5、2.0、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/L。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

1.3.1 原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化

對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行z-score標(biāo)準(zhǔn)化。將原數(shù)據(jù)減去該變量的平均數(shù),然后除以該變量的標(biāo)準(zhǔn)差。以消除原始數(shù)據(jù)間的量綱影響,使數(shù)據(jù)更具可比性。

1.3.2 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 24.0、SIMCA 14.1對數(shù)據(jù)進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)分析,Excel 2013、Origin 2021軟件對測定數(shù)據(jù)進(jìn)行整理統(tǒng)計(jì)和畫圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 白酒樣品元素的測定

采用ICP-MS測定樣品中Al、Ca、Fe、K、Mg、Na、Pb、As、Cd、Ni、Cr、Se、Cu、Mn、Sr、Zn等16種主要元素的含量,具體數(shù)據(jù)見表2,箱型圖見圖1。由于品牌不同,各酒樣無機(jī)元素含量也不同,為確保最終數(shù)據(jù)的科學(xué)性與精準(zhǔn)性,首先需要對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

表2 各品牌白酒元素濃度范圍 單位：μg/L

圖1 52組白酒樣品中的元素含量箱形圖Fig.1 Box plot of elements content in the 52 analyzed Baijiu samples

2.2 PCA

PCA可借助線性變換法得出最少個數(shù)的綜合變量，達(dá)到降維的目的，其信息損失量少，能在保證信息完整度的前提下，支持多個指標(biāo)的轉(zhuǎn)化和同步分析。每個主成分都是原始變量的線性組合，且各主成分間不相關(guān)[23]。

2.2.1 無機(jī)元素的相關(guān)性分析

使用相關(guān)系數(shù)矩陣對數(shù)據(jù)進(jìn)行適應(yīng)性檢驗(yàn),從表3可以看出16種無機(jī)元素呈顯著正相關(guān),表明酒樣中的無機(jī)元素間的相關(guān)性較強(qiáng),能用PCA方法對其進(jìn)行處理。

2.2.2 無機(jī)元素的因子分析

在PCA的前提下,采集公因子,并針對性的展開分析,具體數(shù)據(jù)見表4。以累積方差貢獻(xiàn)值>80%且特征值>1為原則,選擇公因子數(shù)為3個時,累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為82.776%,16種元素的有關(guān)參數(shù)都顯示在其中,選擇前3個主成分,并基于這一結(jié)果對52種酒樣的分布規(guī)律予以說明。

表3 白酒中無機(jī)元素的相關(guān)性矩陣Table 3 Correlation matrix of inorganic elements in Baijiu

表4 PCA特征值和總體方差描述Table 4 Principal component analysis characteristics and total variance explained

以主成分PC1為X軸,分別以PC2、PC3為Y軸,建立每個白酒樣品的得分圖(圖2)。

a-PC1,PC2;b-PC1,PC3圖2 不同品牌醬香型白酒PCA散點(diǎn)圖Fig.2 PCA scattering plot of Maotai-flavor Baijiu

由圖2-a所示,羽豐酒業(yè)酒樣分布在第4象限,與仙譚、普照、紅軍杯酒業(yè)相比差異明顯,但其點(diǎn)相對離散,在主成分1上的得分范圍較廣。紅軍杯酒樣的分布集中在第3象限,且點(diǎn)相對聚集,與其余3個品牌的酒樣區(qū)分明顯。羽豐與普照酒業(yè)酒樣均分布在第1、2象限,雖然其分布存在部分交叉,但也能較好區(qū)分。如圖2-b所示,4種品牌白酒能夠有效區(qū)分,但其區(qū)分度不及圖2-a。雖然普照被仙譚、羽豐、紅軍杯從3個方向包圍,但是在圖中并沒有交點(diǎn),也能較好的分類預(yù)測。因?yàn)榍?組分的方差貢獻(xiàn)率為82.776%,解釋了4種品牌白酒樣品的大部分差異,所以PCA能將4種品牌白酒有效區(qū)分。

2.3 HCA

HCA是基于樣本數(shù)據(jù)自帶的相似度的基礎(chǔ)上自發(fā)匯聚的一種技術(shù),是一種無監(jiān)督模式識別方法[24]。采用SPSS 24.0對不同品牌的52種白酒樣品進(jìn)行HCA。然后,基于歐氏距離平方為測量準(zhǔn)則,得出的詳細(xì)HCA結(jié)果顯示(圖3),4個品牌的52個醬香型白酒分為2大類和6個小類。

由于白酒中各元素濃度受較多因素影響,同一品牌,不同品種、批次樣品的無機(jī)元素含量也存在差異,因此個別酒樣(P1、P3、P4、Y3)被單獨(dú)分類,但是絕大部分酒樣能按照品牌單獨(dú)聚集為一類,表明不同品牌白酒之間無機(jī)元素的含量存在較大差異,因此以16種元素為原始變量可以將不同品牌醬香型白酒進(jìn)行正確歸類,PCA和HCA可以相互驗(yàn)證。

圖3 白酒中無機(jī)元素含量系統(tǒng)聚類Fig.3 Phylogenetic clustering of Baijiu based on inorganic elements

2.4 PLS-DA

變量之間的關(guān)聯(lián)使得研究難度不斷提高。而相比于其他回歸模型的特征以及參數(shù)，PLS-DA對于其他變量的兼容性較強(qiáng)，因此能夠?qū)⒂泄簿€性的數(shù)據(jù)同步歸類與建模。不僅如此，當(dāng)樣本數(shù)量低于變量數(shù)量時，仍然有著很高的操作性，而且在辨識度方面也更具優(yōu)勢[25]。

由圖4可見,PLS-DA能夠有效區(qū)分不同品牌酒樣,X軸的負(fù)半軸酒樣皆來自羽豐酒業(yè),Y軸正半軸酒樣皆來自仙譚酒業(yè),普照酒業(yè)酒樣明顯集中于第4象限,且酒樣散點(diǎn)距離較遠(yuǎn),紅軍杯酒業(yè)酒樣明顯集中于第1象限,且散點(diǎn)分布集中。結(jié)果表明,PLS-DA散點(diǎn)圖能夠更加直觀、準(zhǔn)確地區(qū)別不同品牌的醬香型酒樣,其分類結(jié)果與HCA、PCA結(jié)果相似,都對研究樣品進(jìn)行有效鑒別和分類。

圖4 不同品牌醬香型白酒PLS-DA散點(diǎn)圖Fig.4 PLS-DA scatter plot in different brands of Maotai-flavor Baijiu samples

2.5 不同品牌醬香型白酒無機(jī)元素含量差異原因分析

本次試驗(yàn)利用16種共有無機(jī)元素,多種化學(xué)計(jì)量學(xué)方法能將4個不同品牌的酒樣有效分類。同時,在HCA、PCA和PLS-DA中,52個酒樣按照品牌進(jìn)行了很好地分類,造成這種現(xiàn)象的原因可能有以下幾個方面:(1)釀酒原料不同[26]。由于醬香型白酒“高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒以及生產(chǎn)周期長、貯存期長、用曲量大”的獨(dú)特釀造工藝[5],在生產(chǎn)過程中會使釀酒原料(糧食、水等)中特有的無機(jī)元素保留在酒體中。不同釀酒原料中所含的無機(jī)元素種類及含量均不同,因此同一香型的白酒,就算生產(chǎn)工藝相同,使用原料不同也會造成酒樣中無機(jī)元素的含量不同。(2)生產(chǎn)設(shè)備不同[27]。生產(chǎn)設(shè)備的常規(guī)金屬元素(Fe、Al等)以及部分重金屬(Pb、Cr等)會遷移進(jìn)入酒體。白酒生產(chǎn)過程中連接管、冷凝管等設(shè)備的材料多種多樣(錫、鋁、不銹鋼等)，也可能影響白酒中的無機(jī)元素含量。(3)儲存容器不同[28]。白酒在貯存過程中,容器中的金屬元素也會不同程度地進(jìn)入酒體,影響白酒品質(zhì)。不同酒廠儲存白酒的容器各不相同,如紅軍杯酒業(yè)主要是不銹鋼罐儲存,而仙譚酒業(yè)主要使用陶壇罐與不銹鋼罐,因此造成了不同品牌酒樣中無機(jī)元素含量的差異。

2.6 方法驗(yàn)證

為進(jìn)一步探究不同品牌醬香型白酒中無機(jī)元素的差異,利用重要性因子(variable importance projection,VIP)值量化無機(jī)元素對酒樣分類的貢獻(xiàn),篩選重要特征物質(zhì)。VIP值是PLS-DA模型變量的變量權(quán)重值,可用于衡量各代謝物積累差異對各組樣本分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力,VIP≥1為常見的差異代謝物篩選標(biāo)準(zhǔn)[29]。圖5為醬香型白酒無機(jī)元素的VIP值分布圖,VIP值越大,該無機(jī)元素對不同品牌醬香型白酒差異貢獻(xiàn)越大。

圖5 醬香型白酒無機(jī)元素的VIP值Fig.5 VIP value of inorganic elements in Maotai-flavor Baijiu samples

為篩選對不同品牌醬香型白酒差異具有重要貢獻(xiàn)的無機(jī)元素,篩選貢獻(xiàn)度較大、VIP>1的4種無機(jī)元素進(jìn)行分析,包括Na(2.352 31)、Ca(1.874 76)、Al(1.652 26)、K(1.291 57)?；贗CP-MS結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)建立的不同品牌醬香型白酒區(qū)分模型,將樣品Z1、Z2作為驗(yàn)證酒樣,測定Z1、Z2中VIP>1的4種無機(jī)元素(Na、Ca、Al、K)的含量,結(jié)果見表5。

表5 驗(yàn)證酒樣無機(jī)元素質(zhì)量濃度 單位：μg/L

將驗(yàn)證酒樣的無機(jī)元素?cái)?shù)據(jù)帶入進(jìn)行分析,結(jié)果如圖6所示,淡藍(lán)色點(diǎn)即為驗(yàn)證酒樣。結(jié)果表明,雖然驗(yàn)證樣品Z1、Z2只有4個無機(jī)元素?cái)?shù)據(jù),但仍然能與普照酒業(yè)酒樣很好地歸類到一起。本方法能夠快速、準(zhǔn)確地對不同品牌醬香型白酒進(jìn)行識別,也說明不同品牌醬香型白酒中的無機(jī)元素含量具有一定的分布規(guī)律且能夠通過本方法進(jìn)行辨別。

圖6 驗(yàn)證酒樣PLS-DA散點(diǎn)圖Fig.6 PLS-DA scatter plot for verifying Baijiu samples

3 結(jié)論

本文采用ICP-MS測定了4種品牌52個白酒樣品中的16種元素含量。分析數(shù)據(jù)經(jīng)z-score標(biāo)準(zhǔn)化后,對所有樣品進(jìn)行HCA、PCA和PLS-DA。HCA、PCA能將4個不同品牌的酒樣進(jìn)行有效分離。以52種酒樣的16種無機(jī)元素含量數(shù)據(jù)建立PLS-DA模型,所建立的模型也能將4個品牌的酒樣區(qū)分開。結(jié)合VIP值對造成差異性的關(guān)鍵無機(jī)元素進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)Na、Ca、Al、K等是造成不同品牌醬香型白酒差異性的主要無機(jī)元素,且在方法驗(yàn)證中驗(yàn)證酒樣與實(shí)驗(yàn)酒樣也能很好的按照品牌歸類,表征了不同品牌醬香型白酒無機(jī)元素差異性。因此,利用ICP-MS的檢測技術(shù)結(jié)合多種化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法能對不同品牌的醬香型白酒進(jìn)行有效的分類和鑒定,且建立的PLS-DA模型能使分類與鑒定更加快捷與高效。