桑葉多酚對鮮切生菜的保鮮效果

張宏琛,余琳,石慧

(西南大學 食品科學學院,重慶,400715)

新鮮果蔬加工成鮮切果蔬,能夠最大限度地保留果蔬的原汁原味,具有自然、新鮮、衛(wèi)生、方便等特點,深受消費者喜愛。近幾年來,國內外的鮮切果蔬銷售加工市場迅猛發(fā)展[1]。在鮮切果蔬加工過程中會引入非生物(如低溫、物理剪切磨損、不恰當?shù)臍庹{比等)與生物因素脅迫,非生物因素脅迫將促使果蔬組織中的生理代謝引起改變,例如,呼吸作用增強及其途徑的改變、次生代謝物累積、水分流失、乙烯合成增加等,最終導致果蔬組織的衰老[2],而生物因素脅迫則主要引起組織腐爛。此外,病原菌還能在果蔬受損時定植于其表面進行繁殖,在人類食用后引起食源性疾病,對人類健康造成威脅。這些因素使得鮮切果蔬的貨架期往往較短[3-4]。

鮮切生菜是最常見的鮮切果蔬之一,富含維生素、纖維素、礦物質等多種營養(yǎng)物質。其在儲藏期間容易發(fā)生葉片周邊變黃、葉片發(fā)臭腐爛、組織軟化、褐變等現(xiàn)象,造成感官品質下降[5]。近幾年來,鮮切生菜保鮮劑的研究主要集中在物理保鮮(如低溫、氣調包裝、臭氧、電解水等)和化學保鮮劑(如有機酸、赤霉素等),而生物保鮮劑(如天然植物提取物、可食性涂膜等)的應用研究仍然較少[6]。生物保鮮劑擁有天然、安全、無毒害等優(yōu)點,既不會對果蔬造成明顯的組織損傷也不存在潛在的安全隱患,應用前景十分廣闊。

植物多酚是從植物體內提取出的具有生理活性的次生代謝物,能夠減少心血管疾病的發(fā)病率[7],預防結腸癌[8]、肥胖癥[9]、糖尿病[10]等。除此之外,從植物體內提取出的多酚復合物被證明具有一定的抗氧化[11]、抗褐變[12]、抗菌[13]等作用,據(jù)此可以作為一種天然的生物保鮮劑。羅立娜等[14]用茶多酚處理油梨果實,結果表明茶多酚能夠很好地保持果實硬度與質量,同時也降低了果實中褐變相關酶,如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化物酶(peroxidase,PPO)的活性,降低了果實的腐爛率。

桑葉中含有豐富的多酚、多糖、精油等生物學活性物質,具有抗糖尿病[15]、降低心血管疾病風險[16]、抗氧化[17]等作用。目前桑葉較多的用作養(yǎng)蠶,還未被完全充分地開發(fā)利用和加工,出現(xiàn)了大量桑葉資源過剩的現(xiàn)象,浪費了寶貴資源。與其他植物多酚類似,桑葉多酚也具有抗氧化[18]、抑菌[19]等生物學活性。馮淦熠等[20]對桑葉多酚的提取工藝進行了優(yōu)化并測定了其在體外的抗氧化能力,結果表明DPPH自由基清除率隨著桑葉多酚的濃度增高而增大。

目前,對于桑葉多酚或桑葉提取物的研究較多地專注于其抗氧化與抗菌活性等研究層面,但其作為生物保鮮劑應用于鮮切果蔬的報道仍然較少。因此,本研究旨在研究桑葉多酚對鮮切生菜室溫儲藏期間保鮮效果的影響。測定了5種桑葉多酚對常見的食源性致病菌大腸桿菌O157:H7與單增李斯特菌的最小抑菌濃度(minimal inhibit concentration,MIC),從中選擇效果最好的2種桑葉多酚進行后續(xù)實驗。測定了MIC(5 mg/mL)的2種桑葉多酚對鮮切生菜重量損失率、褐變度、葉綠素含量、總酚含量、菌落總數(shù)的影響,從抑菌、抗褐變的角度對其保鮮效果進行綜合評價。從而對桑葉多酚作為天然鮮切果蔬生物保鮮劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蔬菜：生菜購自重慶市北碚區(qū)永輝超市;本研究中所用的菌株為大腸桿菌O157∶H7 NCTC12900,英國國立標準菌種收藏所;單增李斯特菌 ATCC 19115,美國典型培養(yǎng)物保藏中心。大腸桿菌 O157∶H7 NCTC12900菌株不能產生志賀毒素Stxl和Stx2,因此屬于脫毒型菌株。胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(tryptose soya agar,TSA)、Luria-Bertani肉湯培養(yǎng)基(luria-bertani,LB)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(tryptone soy broth,TSB),青島海博生物技術有限公司;福林酚,上海生工生物科技有限公司;丙酮、碳酸鈉、氯化鈉、無水乙醇,所有試劑均為分析純,重慶市鈦興化工試劑廠;大孔樹脂,范德(北京)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

YX280A 高壓滅菌鍋,上海三申醫(yī)療器械有限公司;SW-CJ-FD 超凈工作臺,蘇州安泰空氣技術有限公司;Mill-Q 純水系統(tǒng),Merck Millipore;BCD-549 W 普通冰箱,青島海爾股份有限公司;DHP—9272電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海齊欣科學儀器有限公司;721 N型可見分光光度計,上海生工生物科技有限公司;1510型酶標儀,賽默飛世爾儀器有限公司;TCP2-B 全自動色差儀、5810R 冷凍高速離心機,Eppendorf;SQP 電子天平、PB-10 pH計,Sartorius;研缽,范德(重慶)生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 桑葉與鮮切生菜的制備

從西南大學桑葉園采摘嘉陵20、嘉陵40、紅果、納溪和湖桑桑葉。將新鮮的桑葉置于50 ℃的烘箱中,干燥12 h,并用粉碎機將其粉碎成粉末,最后將桑葉粉末置于-80 ℃冰箱中儲存直至使用。

從重慶市北碚區(qū)永輝超市購得無物理損傷的生菜。將生菜最外層枯黃的葉片丟棄掉,然后摘除剩余葉片備用。將生菜浸泡在次氯酸鈉溶液(體積分數(shù)0.02%)中3 min,然后用蒸餾水反復沖洗葉片3次,然后用剪刀將葉片剪切成2 cm×2 cm菜葉碎片。將得到的菜葉碎片浸泡于MIC的桑葉多酚溶液中5 min,然后置于生物安全柜中風干。取樣品10 g置于食品自封袋中,于常溫下進行貯藏。分別在0、1、2、3、4 d測定鮮切生菜的各項貯藏品質指標。

1.3.2 桑葉多酚的提取

取6 g桑葉粉末,加入體積分數(shù)70%乙醇,混合均勻后置于超聲環(huán)境下提取,超聲時間60 min,超聲功率400 W,超聲溫度50 ℃,提取液經(jīng)過濾,立即置于旋轉蒸發(fā)儀中減壓濃縮,用容量瓶定容到一定體積后得桑葉總多酚粗提液,離心20 min(4 000×g),取上清液,獲得桑葉多酚粗提液[21]。將40 g預先處理好的大孔吸附樹脂裝入3 cm×30 cm 的層析柱中,緩緩加入先前獲得的桑葉多酚粗提液,靜置過夜,然后用蒸餾水沖洗柱子,洗脫一些不要的水溶性化合物,直至洗滌水澄清;用酸化的60%乙醇[pH=(4±0.1)]洗脫大孔樹脂吸附的多酚類物質,直至洗脫液沒有顏色,將收集的洗脫液置于旋轉蒸發(fā)儀中減壓濃縮,收集濃縮液,立即置于真空冷凍干燥機中干燥,最后用真空包裝袋包裝桑葉多酚粉末并儲存于-80 ℃冰箱。

1.3.3 MIC的測定

取出在-80 ℃冰箱保存的菌種,用接種環(huán)取少量劃線于TSA板上,37 ℃培養(yǎng)16 h后取出,于4 ℃保存?zhèn)溆?。在超凈工作臺內,用接種環(huán)分別挑取1環(huán)大腸桿菌O157∶H7和單增李斯特菌單菌落接種于20 mL已滅菌的LB培養(yǎng)基和TSB培養(yǎng)基中,于搖床中孵育16 h(37 ℃,120 r/min),得到菌濃度約為109CFU/mL大腸桿菌O157∶H7和單增李斯特菌菌懸液,再將菌液進行10倍梯度稀釋到105CFU/mL,備用。

MIC是指能夠抑制細菌生長、繁殖的最低藥物濃度[22]。通過二倍肉湯稀釋法,將桑葉多酚提取物溶于無菌水,倍比稀釋,得到樣品質量濃度分別為10、5、2.5、1.25、0.625和0.312 5 mg/mL。分別加入105CFU/mL的大腸桿菌O157∶H7和單增李斯特菌的菌懸液,37 ℃過夜培養(yǎng) 12 h,觀察菌液生長情況,菌液透明澄清時所對應的樣品濃度即為MIC。

1.3.4 重量損失率的測定

使用分析天平進行精確稱量并計算,通過將生菜樣品儲存一定時間后的質量除以樣品原始質量并乘以100%來計算重量損失率的百分比。

1.3.5 褐變度的測定

取生菜樣品2 g,加入95%乙醇6 mL,研磨均勻,8 000 r/min 離心10 min,取上清液于420 nm處測定吸光度,即為樣品褐變度。

1.3.6 葉綠素含量的測定

稱取0.5 g生菜樣品,加入2.0 mL丙酮研磨,收集研磨液后再加入2.0 mL丙酮反復沖洗研缽并收集沖洗液,匯總后再加入離心管中,8 000 r/min離心10 min。取上清液,以丙酮作為空白對照,分別在645、663 nm 測定吸光度值,按公式(1)(2)(3)計算葉綠素含量。

ρa=12.72A663-2.59A645

(1)

ρb=22.88A645-4.67A663

(2)

(3)

式中：ρa,葉綠素a質量濃度,mg/L;ρb,葉綠素b質量濃度,mg/L;V,提取液總體積,mL;m,取樣質量,g。

1.3.7 總酚含量的測定

取5 g生菜樣品于研缽中,加入45 mL 50%乙醇,研磨,然后在4 ℃下以5 000 r/min離心10 min,取上清液。將0.5 mL上清液、1 mL福林酚試劑和2 mL質量分數(shù)10%碳酸鈉溶液混合,在室溫下避光靜置1 h,并在760 nm處使用分光光度計測量吸光度。用沒食子酸標準曲線計算總酚含量?？偡雍?沒食子酸當量)單位表示為g/kg。

1.3.8 菌落總數(shù)的測定

將5 g生菜樣品與45 mL 0.85%無菌生理鹽水混合搖勻,然后用0.85%無菌生理鹽水進行梯度稀釋,分別稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6。在無菌條件下,將樣品稀釋液滴到營養(yǎng)瓊脂平板上以進行菌落計數(shù),并在37 ℃下培養(yǎng)24 h。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與整理。采用Origin 9.0做誤差圖并分析結果。采用SPSS 20對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-way ANOVA),用Duncan氏法進行多重差異顯著性比較。所有試驗均重復3次。

2 結果與分析

2.1 不同品種桑葉多酚的MIC值

將所選菌種在試管中培養(yǎng)后,通過試管中菌液的澄清度來判定5種桑葉多酚的MIC,結果見表1。

表1 不同品種桑葉多酚的MIC值 單位：g/L

5種桑葉多酚對2種菌的抑制作用不同。納溪桑葉多酚、嘉陵40桑葉多酚、湖桑桑葉多酚：大腸桿菌O157∶H7=單增李斯特菌;嘉陵20桑葉多酚、紅果桑葉多酚:大腸桿菌O157∶H7<單增李斯特菌。上述結果表明,納溪和嘉陵20 桑葉多酚相比嘉陵40、紅果和湖桑對2種菌種的抑制作用更強,且嘉陵20對單增李斯特菌的MIC為2.5 g/L,抑菌效果最好。FEI等[23]研究報道橄欖葉多酚提取物對阪崎腸桿菌(CronobactersakazakiiATCC29544,C.sakazakiiATCCBAA-894)MIC為0.625～1.25 g/L,認為橄欖葉多酚具有較強抗菌活性是與其含有的羥基基團有關。在之前的研究中,對2個品種(人工培育品種嘉陵20、野生品種納溪)的桑葉多酚的各類多酚單體進行了分析,結果表明不同品種的多酚單體組成不一且含量各異,嘉陵20比納溪含有更高的抑菌活性多酚單體物質,如綠原酸、咖啡酸、香豆酸、蘆丁、異槲皮素等[24]。由此推測,5種桑葉多酚對不同的病原菌具有不同的MIC值,原因是它們的多酚單體組成與含量不同。因此,該研究結果提供了一種理論上的可能性,即桑葉多酚可以作為一種天然食品殺菌劑,以減少食品中大腸桿菌O157∶H7和單增李斯特菌引起的食品安全問題以及食品加工環(huán)境中的污染。從中選出效果較好的納溪和嘉陵20進行后續(xù)的保鮮效果測定實驗。

2.2 兩種桑葉多酚對鮮切生菜保鮮效果的評價

2.2.1 桑葉多酚處理對鮮切生菜重量損失率的影響

重量損失率是評價生菜外觀品質的重要指標之一。新鮮生菜的含水量高達97% ～ 98%,鮮切處理后加速了它們的蒸騰作用和呼吸作用,因此在儲藏過程中容易損失水分,導致菜葉失水萎蔫,質量下降。由圖1可知,無菌水、納溪和嘉陵20桑葉多酚處理的生菜質量變化的趨勢基本一致,重量損失率隨著貯藏時間的增加逐漸變大。貯藏期間,經(jīng)過納溪和嘉陵20桑葉多酚處理的生菜的重量損失率減少,顯著低于對照組(P<0.05)。在儲藏最后1 d,對照組的重量損失率增加到5.82%。這說明,桑葉多酚處理可以有效保持鮮切生菜的水分和營養(yǎng)成分,減少儲藏期間質量損失。

圖1 桑葉多酚處理對鮮切生菜重量損失率的影響Fig.1 Effect of mulberry leaf polyphenols treatments on weight loss rate of fresh-cut lettuce

2.2.2 桑葉多酚處理對鮮切生菜葉綠素含量的影響

葉綠素是植物進行光合作用的重要色素物質。在儲藏期間,鮮切生菜的葉綠素無法進行光合作用,隨著儲藏時間的延長,葉綠素酶會逐漸分解葉綠素而使綠色消退,葉綠素含量逐漸下降,從而導致生菜葉子的黃化。因此葉綠素含量是維持鮮切生菜儲藏品質的重要指標。如圖2所示,在儲藏期間各處理組生菜葉的葉綠素都有不同程度地下降,其中無菌水處理組的下降速率大于納溪和嘉陵20桑葉多酚處理組。其中,在儲藏第1天,納溪桑葉多酚處理組和嘉陵20桑葉多酚處理組之間差異性不顯著(P>0.05),第2天開始,納溪桑葉多酚處理組和嘉陵20桑葉多酚處理組之間存在顯著性差異(P<0.05),說明2種桑葉多酚都可有效地減少葉綠素的分解,且經(jīng)納溪桑葉多酚處理后效果最明顯。

圖2 桑葉多酚處理對鮮切生菜葉綠素含量的影響Fig.2 Effect of mulberry leaf polyphenols treatment on chlorophyll content of fresh-cut lettuce

2.2.3 桑葉多酚處理對鮮切生菜褐變度的影響

褐變度通常被認為是一種間接的度量指標,用來反映由褐變反應生成的可溶性色素化合物含量,從而反映果蔬褐變程度。儲藏期間鮮切生菜褐變度的變化情況如圖3所示,各處理鮮切生菜的褐變度隨儲藏時間的延長而增大,其中對照組中無菌水的褐變度急劇上升,處理組納溪和嘉陵20桑葉多酚之間不存在顯著性差異(P>0.05)。在儲藏第1天,無菌水、納溪和嘉陵20桑葉多酚處理的鮮切生菜的褐變度分別是2.75、2.69和2.69。在儲藏末期,無菌水、納溪和嘉陵20桑葉多酚處理的鮮切生菜的褐變度分別是2.81、2.78和2.79。結果表明,桑葉多酚可以附著在切口表面,在一定程度上隔絕了環(huán)境中的氧氣,從而抑制了褐變的產生,因此MIC的桑葉多酚溶液可以抑制鮮切生菜切口褐變,維持鮮切生菜鮮亮的外觀。同時,隨著儲藏時間的延長,雖然桑葉多酚處理組低于對照組,但是桑葉多酚抑制褐變的強度減弱。由于多酚類物質是褐變相關酶的底物,因此很有可能會促進鮮切生菜的褐變。MARTN-DIANA等[25]研究報道0.5 g/100 mL茶多酚有效地防止抗壞血酸和類胡蘿卜素的流失,過量的茶多酚(1 g/100 mL)促進了生菜的褐變。

圖3 桑葉多酚處理對鮮切生菜褐變度的影響Fig.3 Effect of mulberry leaf phenols treatment on browning degree of fresh-cut lettuce

2.2.4 桑葉多酚處理對鮮切生菜總酚含量的影響

由苯丙烷途徑合成的酚類化合物可以被PPO氧化成醌類,醌類會自發(fā)聚合成褐色色素,導致組織褐變。如圖4所示,不同桑葉多酚處理后,總酚含量在儲藏4 d內呈先增加后下降的趨勢,在第2天達到峰值。納溪和嘉陵20桑葉多酚處理的鮮切生菜的總酚含量在儲藏過程中增加的量低于對照組。這些結果表明,桑葉多酚處理可以減少總酚類物質的積累,從而延緩褐變。納溪和嘉陵20桑葉多酚抑制褐變的原因是由于它能抑制活性氧的形成和各種氧化酶的活性。這可能是由于外源酚物質處理抑制了生菜中束縛態(tài)酚物質的釋放。

圖4 桑葉多酚處理對鮮切生菜總酚含量的影響Fig.4 Effect of mulberry leaf polyphenols treatment on total phenols content of fresh-cut lettuce

2.2.5 桑葉多酚處理對鮮切生菜菌落總數(shù)的影響

菌落總數(shù)是用來判定食品被微生物污染的程度及衛(wèi)生質量,菌落總數(shù)在一定程度上標志著食品衛(wèi)生質量的優(yōu)劣。在室溫(25 ℃)條件下,納溪和嘉陵20桑葉多酚均對鮮切生菜有一定的抑菌保鮮效果。如圖5所示,從菌落總數(shù)變化情況來看,經(jīng)桑葉多酚處理的鮮切生菜的總細菌數(shù)顯著低于對照組(P<0.05),儲藏第2天,只有無菌水處理的鮮切生菜的菌落數(shù)為4.98 lg CFU/g,高于4 lg CFU/g。納溪和嘉陵20桑葉多酚處理的鮮切生菜菌落數(shù)均低于4 lg CFU/g,分別是3.86和3.11 lg CFU/g。在儲藏第4天,經(jīng)過無菌水、納溪和嘉陵20桑葉多酚處理的鮮切生菜的菌落總數(shù)分別增加到6.83、5.74和5.27 lg CFU/g。這些結果表明,2種桑葉多酚都可有效抑制鮮切生菜上細菌的生長,而且嘉陵20桑葉多酚的抗菌活性顯著高于納溪桑葉多酚(P<0.05)。這可能是由于酚類物質可以抑制蛋白質合成,與磷脂分子相互作用來改變細胞膜的結構,增強通透性,使細菌細胞遭受不可逆損傷,造成細胞死亡[26]。嘉陵20桑葉多酚的抗菌活性較好,桑葉多酚中不同含量的單體具有不同的抗菌活性,這可以解釋納溪和嘉陵20桑葉多酚之間的抗菌活性差異。

圖5 桑葉多酚處理對鮮切生菜菌落總數(shù)的影響Fig.5 Effect of mulberry leaf polyphenols treatment on bacterial counts of fresh-cut lettuce

因此,在后續(xù)研究中可以利用嘉陵20桑葉多酚良好的抗菌性將其作為天然抗菌劑應用于食品安全不同領域的研究。

3 結論

5個品種提取的桑葉多酚均對大腸桿菌O157∶H7與單增李斯特菌具有抑菌效果,其中納溪、嘉陵20效果最好,納溪對大腸桿菌O157∶H7與單增李斯特菌的MIC均為5 mg/mL,嘉陵20分別為5、2.5 mg/mL。在保鮮效果測定實驗中,相比于對照組,鮮切生菜經(jīng)過MIC(5 mg/mL)的納溪、嘉陵20處理后,均顯著延緩了品質劣變。2種桑葉多酚均能夠有效維持水分、保留營養(yǎng)成分、抑制葉綠素的降解、延緩褐變、抑制總酚的合成、降低菌落總數(shù)。其中,納溪的保鮮能力更好,而嘉陵20抗菌性能更好。因此,桑葉多酚有望成為一種新型的天然生物保鮮劑。