清香型小曲白酒霉菌菌群解析與酶活特性研究

朱麗萍,楊強(qiáng),江威,李群,林斌,唐潔,陳申習(xí)

(勁牌有限公司 勁牌研究院 中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點實驗室,湖北 大冶,435000)

清香型小曲白酒作為我國主要白酒種類之一,有著清香純正、醇甜柔和、余味爽凈的獨(dú)特風(fēng)味[1-2],備受人們喜愛。其以富含淀粉質(zhì)的糧食為原料,以富含多種微生物的綠衣觀音土曲為糖化發(fā)酵劑釀造而成。綠衣觀音土曲以觀音土、米粉、米糠為主要原料,接入曲種,通過加水拌料,制成坯,入箱進(jìn)行微生物培育,開箱后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室進(jìn)行一至七燒共7輪培養(yǎng),然后烘干制成[3]。霉菌作為重要的小曲白酒釀造微生物,在白酒發(fā)酵過程中發(fā)揮著重要作用,主要表現(xiàn)在能產(chǎn)生多種活性酶[4-5],如糖化酶、纖維素酶、蛋白酶、酯化酶、果膠酶等,對降解釀造原料和推動呈香呈味物質(zhì)的形成具有重要貢獻(xiàn)[6-8]。因此解析白酒發(fā)酵過程中霉菌種群結(jié)構(gòu),有助于對其中功能菌株的發(fā)酵特性進(jìn)行研究[9-10]。

目前研究者對醬香型[11-12]、濃香型白酒[13-14]中的霉菌菌群研究較多。向玉萍等[11]從茅臺醬香型大曲中分離鑒定出55株10個屬的霉菌,并對不同種類大曲間霉菌種屬差異性進(jìn)行了分析;劉冰冰等[13]從濃香型白酒的酒醅中分離出15株霉菌,并對其產(chǎn)酶特性進(jìn)行了研究。而對清香型小曲白酒中的霉菌研究多數(shù)集中于易于分離的幾種,如根霉[15],對于難分離、難鑒定的霉菌鮮有報道,導(dǎo)致清香型小曲白酒中可以明確應(yīng)用于釀造生產(chǎn)中的功能霉菌較少[16-17]。且同一種屬的不同菌株間的生理生化特性存在一定差異,王旭亮等[18]從清香、濃香、醬香大曲中分離得到8株糖化酶活力較高的根霉,其與酵母模擬白酒酒精發(fā)酵結(jié)束后,各菌株培養(yǎng)基中的酒精含量和出酒率均不同。

近幾年高通量測序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于釀造微生物的檢測中,該技術(shù)可以對樣品中微生物信息進(jìn)行解析,適合于微生物區(qū)系、群落結(jié)構(gòu)、分布情況及生長變化規(guī)律研究,但一般只可鑒定到屬,且無法獲得菌株。經(jīng)典分離培養(yǎng)鑒定技術(shù)可鑒定到種,并分離得到活菌株,有利于對獲得的菌株進(jìn)行進(jìn)一步研究,適合于微生物生理生化特性和生產(chǎn)應(yīng)用研究。

本研究使用經(jīng)典分離培養(yǎng)鑒定法,通過優(yōu)化培養(yǎng)基,從清香型小曲白酒酒曲和酒醅中分離出20株疑似霉菌,借助分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行了種屬鑒定,并優(yōu)化了適合霉菌分離、生長的培養(yǎng)基。對部分難以確定種屬的霉菌,通過改變PCR擴(kuò)增體系及擴(kuò)增條件,成功進(jìn)行了鑒定,并還原了不同發(fā)酵階段的主要霉菌種類。同時,對霉菌產(chǎn)水解酶組成及酶活力進(jìn)行了解析。為進(jìn)一步提升清香型小曲原酒釀造品質(zhì)提供了霉菌資源。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗樣品及培養(yǎng)基

綠衣觀音土曲、糖化醅和發(fā)酵醅為2019年10～12月由勁牌有限公司提供。

PDA培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200,葡萄糖20,瓊脂20,pH自然。

察氏培養(yǎng)基(g/L)：NaNO33,K2HPO41,MgSO4·7H2O 0.5,KCl 0.5,FeSO40.01,蔗糖30,瓊脂20,pH自然或7.0～7.2。

孟加拉紅培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5,葡萄糖10,KH2PO41,MgSO4·7H2O 0.5,瓊脂20,孟加拉紅0.033。

改良PDA培養(yǎng)基[19](g/L)：PDA培養(yǎng)基/L,牛肉膏2,酵母粉2,KH2PO42.5,吐溫-20 1.5 mL。

YPD培養(yǎng)基(g/L)：酵母膏10,蛋白胨20,葡萄糖20,瓊脂20。

以上培養(yǎng)基在121 ℃滅菌20 min,冷卻至50～60 ℃,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%青霉素,搖勻倒平板。

1.1.2 實驗材料

土壤基因組DNA提取試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

104C ECLIPSE E200顯微鏡,日本尼康有限公司;SF-CF-2A超凈工作臺,鄭州南北儀器設(shè)備有限公司;WD-9413B凝膠成像系統(tǒng),北京六一電泳儀器廠;2720 PCR儀,賽默飛世爾科技公司;HH-S恒溫水浴鍋,上海索譜儀器有限公司;Neofuge 18R高速冷凍離心機(jī),上海Heal Force公司;721型分光光度計,尤尼柯上海儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 取樣方法

酒曲：每份曲樣200 g左右,存放于4 ℃冰箱中。

糖化醅、酒醅：毛鋪三分廠釀造三車間,跟蹤同一批次1個糖化池、4個發(fā)酵槽車,共計取3批次。收集糖化0、6、12、18 h和終點的糖化醅,每種糖化醅收集1份,每份250 g;收集發(fā)酵0、1、2、3、4、5、7、9、11、14 d的酒醅,每天每個發(fā)酵槽車收集1份,每份250 g,樣品存放于4 ℃。糖化池取樣位置如圖1所示，4.2 m×2.0 m的中格為取樣格，每個取樣格內(nèi)有5個點，先取中心點作為糖化0 h的樣品，余下4點為6、12、18 h和終點的樣品。每個取樣點收集中層的樣品(約0.3 m深)。4個取樣格即為4個平行。

圖1 糖化池取樣位置(俯視圖)Fig.1 Sampling location of the saccharification tank(top view)

發(fā)酵槽車取樣位置如圖2所示，實心點即為取樣的實際位置。每個取樣點收集中層的樣品(約0.5～0.6 m深)。4個發(fā)酵槽車即為4個平行。

圖2 發(fā)酵槽車取樣位置(側(cè)視圖)Fig.2 Sampling location of the fermentation tank car(side view)

1.2.2 真菌分離

準(zhǔn)確稱取樣品5 g加入95 mL無菌水中,150 r/min振蕩20～30 min,配制成菌懸液。分別取1 mL混合液至盛有9 mL滅菌水的試管中,依次制作成10-1、10-2、10-3、10-4梯度菌液,取200 μL的不同稀釋液涂布于上述5種培養(yǎng)基中,放置于30 ℃培養(yǎng),2～5 d后形態(tài)觀察。

1.2.3 菌落形態(tài)觀察

將在PDA上活化菌株,然后分別接種到孟加拉紅、YPD、PDA培養(yǎng)基上,將平板倒置在30 ℃溫箱中培養(yǎng),觀察第5天的菌落形態(tài)特征,主要記錄其菌落形態(tài)、生長速度、氣生菌絲疏密和產(chǎn)色素情況等,記錄并拍照。

1.2.4 顯微形態(tài)觀察

取無菌蓋玻片,以傾斜約45°方式插入PDA培養(yǎng)基中,每皿插入3～4片,30 ℃溫箱中倒置培養(yǎng)5 d,取蓋玻片在顯微鏡下觀察包括菌絲顏色及形態(tài)、孢子形態(tài)在內(nèi)的顯微形態(tài)特征,記錄并拍照[20]。

1.2.5 分子生物學(xué)鑒定

真菌模板的制備：使用土壤中微生物基因提取試劑盒提取法提取模板DNA。

PCR反應(yīng)體系為30 μL：PremixTaq(EX Taq Version 2.0)15 μL,DNA模板2 μL,引物1 μL,采用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′),dd H2O 12 μL。

PCR擴(kuò)增程序為：95 ℃ 5 min;95 ℃ 45 s,52 ℃ 45 s,72 ℃ 110 s,循環(huán)35次;72 ℃ 10 min,4 ℃保溫。

瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,送往武漢華大基因科技股份有限公司完成測序。測序結(jié)果與美國國家生物信息技術(shù)中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行BLAST比對。采用基因序列分析軟件DNAMAN和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹軟件MEGA 6,與GenBank數(shù)據(jù)庫中相關(guān)屬種基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.6 酶活力測定方法

酸性蛋白酶測定參照國標(biāo)GB 1886.174—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 食品工業(yè)用酶制劑》的方法測定蛋白酶活力;糖化酶測定方法采用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)法[21];纖維素酶測定方法采用DNS法[22];果膠酶測定方法采用DNS法[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 霉菌的初篩結(jié)果分析

選用5種不同培養(yǎng)基對清香型小曲白酒酒曲和酒醅中的霉菌進(jìn)行分離篩選,共計篩選得到46株菌落形態(tài)不同的疑似霉菌,5種培養(yǎng)基中觀察到疑似霉菌的種類,統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。

表1 不同培養(yǎng)基中篩選得到的疑似霉菌菌種數(shù)Table 1 The number of suspected mold species screened from different media

對5種培養(yǎng)基中的疑似霉菌菌落觀察發(fā)現(xiàn),PDA、YPD和孟加拉紅3種培養(yǎng)基中的菌落顏色較鮮艷,各菌落間形態(tài)差異較大,相同生長時間內(nèi)菌落直徑較大。而改良PDA培養(yǎng)基中加入鹽類和吐溫-20,其菌株生長速度較PDA培養(yǎng)基中慢,且菌絲蔓延的情況得到了很好的抑制,但菌株形態(tài)種類明顯減少,菌絲變短且多聚成小絮狀。察氏培養(yǎng)基通過加入高含量的鹽,以抑制雜菌生長,但明顯也影響霉菌的生長,培養(yǎng)3 d仍無明顯菌落長出,至5 d有部分菌落長出,且菌落顏色較淺,菌絲短而稀疏。

故選擇PDA、YPD和孟加拉紅培養(yǎng)基,對46株疑似霉菌進(jìn)行復(fù)篩。

2.2 霉菌復(fù)篩結(jié)果分析

根據(jù)同一種菌株在不同培養(yǎng)基中菌落形態(tài)不同的特點,將46株菌株分別點接到PDA、YPD和孟加拉紅培養(yǎng)基上,平板倒置在30 ℃下培養(yǎng)觀察5 d,根據(jù)3種培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、顏色和菌落大小等因素將46株進(jìn)一步歸屬為20個種類,編號為M1～M20,結(jié)果如圖3所示。

圖3 二十種疑似霉菌菌株菌落形態(tài)Fig.3 Colonial morphology of 20 suspected mold strains注：從左至右依次為孟加拉紅、PDA、YPD

初篩時20種菌株,在PDA中生長的有9種,在YPD中生長的有9種,在孟加拉紅中生長的有3種,在改良PDA中生長的有2種,在察氏培養(yǎng)基中生長的有4種。僅在1種培養(yǎng)基中生長的菌株情況為：PDA上有3種,YPD上有4種,察氏培養(yǎng)基上有2種,結(jié)果如表2所示。

表2 不同培養(yǎng)基中篩選得到的疑似霉菌菌種數(shù)Table 2 Comparison of the number of suspected mold species obtained in different media

通過復(fù)篩可知PDA、YPD有利于霉菌的篩選,其中YPD中霉菌生長菌落較大,顏色鮮艷,復(fù)篩菌種數(shù)多,僅在該培養(yǎng)基上生長的菌種多,為較好的霉菌篩選培養(yǎng)基。察氏培養(yǎng)基雖然生長較慢,但復(fù)篩菌種數(shù)為4種,且有2種菌株僅在該培養(yǎng)基上生長,是很好的霉菌初篩培養(yǎng)基。故PDA、YPD和察氏培養(yǎng)基可作為霉菌良好的篩選培養(yǎng)基。

2.3 復(fù)篩菌株的顯微形態(tài)觀察結(jié)果分析

復(fù)篩得到的20株疑似霉菌,使用插片法觀察菌株的顯微形態(tài),在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后觀察到的顯微形態(tài),結(jié)果如圖4所示。

圖4 二十株菌株的顯微形態(tài)圖Fig.4 Microscopic morphologies of 20 strains

根據(jù)顯微形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)菌種M1和M15疑似根霉,M2疑似毛霉,M3和M5疑似毛白地霉,M4疑似酵母菌,M7、M9、M10、M16、M19疑似青霉,M8、M11～M14、M17、M18疑似曲霉,M20疑似為枝孢霉,M6為待定菌株。為科學(xué)確定菌株種屬類別,對以上20株菌種進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

2.4 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果分析

對復(fù)篩獲得的20株疑似霉菌,提取菌株DNA為模板,并進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,除菌株M7和M16外,均有條帶。將PCR產(chǎn)物驗證成功的菌株,送往華大基因有限公司進(jìn)行測序。結(jié)果顯示,絕大部分峰圖較理想,波峰與波谷清晰,峰與峰之間的距離均勻,底部基本未見雜峰。而M1、M4、M12號菌株底部套峰貫穿整個峰圖,降低了BLAST比對結(jié)果的可靠性。

霉菌M7和M16 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測無條帶,可能內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)引物在該P(yáng)CR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序下,無法與其DNA模板結(jié)合進(jìn)行擴(kuò)增,可改變擴(kuò)增引物;M1、M4、M12號菌株測序結(jié)果出現(xiàn)套峰,說明測序反應(yīng)產(chǎn)物不純,有不止一種測序反應(yīng)產(chǎn)物存在,可提高退火溫度,提高反應(yīng)的特異性。

為詳細(xì)鑒定微生物種屬,了解微生物種群結(jié)構(gòu),對未成功鑒定的菌株M1、M4、M7、M12、M16進(jìn)行擴(kuò)增引物和退火溫度的實驗探索。選用18S rRNA引物[18S-P1(5′-CCAGGCTTTACACTTTATGC-3′)和18S-P2(5′-GCGATTAAGTTGGGTAACGC-3′)]和ITS引物;選用退火溫度為56 ℃和52 ℃。通過設(shè)計3個實驗方案,方案1：引物18S-P和退火溫度56 ℃;方案2：引物18S-P和退火溫度52 ℃;方案3：引物ITS和退火溫度56 ℃。電泳結(jié)果如圖5所示,選取方案1中的M1、M4、M12、M16菌株和方案2中的M7菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,送往華大基因有限公司進(jìn)行測序,均測序成功。

將測序結(jié)果通過BioEdit軟件進(jìn)行剪切,并輸入NCBI Gen Bank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性檢索,獲得近似序"列及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果,綜合分析形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果,如表3所示。

表3 酒曲和酒醅中分離霉菌鑒定結(jié)果Table 3 Identification results of molds isolated from Xiaoqu and fermented grains

通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定,20株菌中有3株為酵母,17株為霉菌,其中霉菌屬于14個種8個屬,分別是曲霉屬、青霉屬、根霉屬、毛霉屬、共頭霉屬、橫梗霉屬、籃狀菌屬、枝孢霉屬。其中M3～M5菌株鑒定結(jié)果為酵母,但其菌落形態(tài)類似霉菌,菌落直徑較大,有菌絲蔓延現(xiàn)象,顯微形態(tài)中M3和M5菌株有菌絲結(jié)構(gòu),故在霉菌形態(tài)鑒定過程中,需注意毛孢子菌、白地霉等的鑒別。M6菌株顯微形態(tài)較為特殊,但結(jié)果鑒定為印度毛霉菌。

對分離的20株菌,采用系統(tǒng)發(fā)育樹軟件MEGA6,與GenBank數(shù)據(jù)庫中相關(guān)菌株基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,結(jié)果見圖6。

從系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹看,青霉屬與曲霉屬聚在一起,根霉屬、毛霉屬、共頭霉和橫梗霉屬聚在一起,這對菌株產(chǎn)酶性能的研究有較大指導(dǎo)意義?；@狀菌屬是青霉的有性型,M19籃狀菌屬與青霉屬、曲霉屬聚在一起,符合真菌分類的規(guī)則。

2.5 菌種來源

統(tǒng)計霉菌的樣品來源,還原不同發(fā)酵階段的主要霉菌種類(主要霉菌的數(shù)量為1×105～1×107CFU/g),在酒曲中包括M9產(chǎn)黃青霉、M12橫梗霉、M14黃曲霉、M15米根霉、M16微皺籃狀菌、M18棒曲霉;在糖化過程中包括霉菌M2戴爾根霉、M6印度毛霉菌、M7微皺籃狀菌、M8爪甲曲霉、M10產(chǎn)黃青霉、M12橫梗霉、M15米根霉、M16微皺籃狀菌;在發(fā)酵初期(0～3 d)存在M1單孢共頭霉、M11黃曲霉、M13米曲霉、M14黃曲霉;在發(fā)酵前期(4～5 d)M14黃曲霉、M17阿姆斯特洛達(dá)姆曲霉、M18棒曲霉;發(fā)酵6 d后未篩選出霉菌。因本實驗是通過培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)分離得到各個階段的霉菌種類,該結(jié)果可以表示為在該階段較為優(yōu)勢霉菌種類或該階段易于培養(yǎng)的霉菌種類。糖化階段的霉菌主要來自于酒曲中,由于開放式的發(fā)酵環(huán)境,M6印度毛霉菌、M7微皺籃狀菌、M8爪甲曲霉可能來自于環(huán)境中,而部分霉菌未在糖化階段篩選出來,可能還未形成較優(yōu)勢霉菌種類,如：M14黃曲霉和M18棒曲霉;在發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌種主要為曲霉屬,多個曲霉屬菌種在不同的發(fā)酵階段生長成較優(yōu)勢霉菌菌種,而M1單孢共頭霉、M17阿姆斯特洛達(dá)姆曲霉可能由酒糟和環(huán)境中帶入。發(fā)酵6～14 d未篩選出霉菌,說明在發(fā)酵第6天后,霉菌存在較少甚至沒有,可能是由于隨著發(fā)酵深入,酒醅中酸類物質(zhì)的積累,如乙酸、乳酸等,抑制了霉菌的生長[24]。

圖6 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree based on 18S rRNA and ITS sequences

2.6 霉菌酶活力測定

以分離得到的17株霉菌為實驗材料,制備成麩皮種,測定其蛋白酶、糖化酶、纖維素酶、果膠酶等酶活力大小,結(jié)果如表4所示。

測定霉菌的水解酶活力,有助于了解分析原料的分解利用情況。在糖化酶上,夏艷秋等[25]在黃酒中篩選出的黃曲霉高產(chǎn)糖化酶活力在16 196～18 352 U/(g·h),本研究中M11號黃曲霉糖化酶活力高達(dá)18 156.45 U/(g·h),其余根霉屬和曲霉屬的酶活力普遍較高,但爪甲曲霉和阿姆斯特洛達(dá)姆曲霉除外,極細(xì)枝孢霉的糖化酶活力也較高[>10 000 U/(g·h)]。在清香型小曲白酒釀造過程中通常以米根霉作為糖化發(fā)酵劑,而實驗發(fā)現(xiàn)黃曲霉及米曲霉表現(xiàn)出較高的糖化酶活力。霉菌菌株也是清香型小曲白酒釀造過程中蛋白酶的主要來源。印麗等[26]檢測茅臺鎮(zhèn)醬香型白酒核心產(chǎn)區(qū)大曲中分離霉菌的酸性蛋白酶活力在12.76～69.75 U/g,本研究中單孢共頭霉、橫梗霉和微皺藍(lán)狀菌的酸性蛋白酶活力較高(>80 U/g),其中橫梗霉在酒曲中數(shù)量較多,菌絲蔓延生長較快,有利于快速分解原料中的蛋白質(zhì)等物質(zhì)。在纖維素酶上,檢測的霉菌均能產(chǎn)纖維素酶,但酶活力均較低,多數(shù)霉菌產(chǎn)纖維素酶活力0.6～11.09 U/g。在產(chǎn)果膠酶上,僅部分霉菌產(chǎn)果膠酶,且酶活力均不高,僅戴爾根霉、印度毛霉菌的果膠酶酶活力較高(>36 U/g)。

表4 霉菌麩皮種的水解酶系Table 4 The hydrolytic enzymes in bran seed of mold

3 結(jié)論

為了解清香型小曲白酒釀造的主要霉菌種類及其主要特性和作用,本研究采用PDA、YPD、孟加拉紅、改良PDA和察氏培養(yǎng)基對酒曲和酒醅中的霉菌進(jìn)行分離篩選,共計篩選得到46種菌落形態(tài)不同的疑似霉菌。進(jìn)一步選擇PDA、YPD和孟加拉紅3種培養(yǎng)基對46株菌株進(jìn)行復(fù)篩,根據(jù)在3種培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、顏色、菌落大小等因素將46株歸類為20株疑似霉菌,結(jié)合形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)分析,20株疑似霉菌為3株酵母,17株霉菌,其中霉菌歸為14個種8個屬,分別是曲霉屬、青霉屬、根霉屬、毛霉屬、共頭霉屬、橫梗霉屬、籃狀菌屬、枝孢霉屬。還原不同發(fā)酵階段中的主要霉菌種類,糖化階段的霉菌主要來自于酒曲中,部分霉菌可能來自于環(huán)境中;在發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌種主要為曲霉屬,多個曲霉屬菌種在不同的發(fā)酵階段生長成較優(yōu)勢霉菌菌種,少量霉菌可能由酒糟和環(huán)境中帶入。另外,對霉菌產(chǎn)水解酶組成及酶活力進(jìn)行了解析,17株霉菌均能產(chǎn)生糖化酶和纖維素酶,僅部分霉菌可產(chǎn)生蛋白酶和果膠酶,且多數(shù)霉菌糖化酶和蛋白酶活力較高,纖維素酶和果膠酶的酶活力整體偏低。說明清香型小曲白酒生產(chǎn)中的霉菌類群產(chǎn)酶特性多樣,酶活力差異較大。本研究為后續(xù)提升清香型小曲白酒的發(fā)酵質(zhì)量,提供了霉菌資源。