黃原膠寡糖對體外腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的影響

徐靜靜,孫武,詹曉北*,張洪濤,朱莉,高敏杰

1(糖化學與生物技術教育部重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122)2(無錫格萊克斯生物科技有限公司,江蘇 無錫,214125)

人體腸道內有1014個共生微生物,它們形成人體最大的、最復雜的微生態(tài)系統(tǒng),在調節(jié)宿主健康和疾病方面發(fā)揮著重要的作用[1-2]。膳食是影響腸道微生物群組成的關鍵可改變因素,膳食干預已成為調節(jié)微生物群組成和代謝活性的潛在有效策略[3]。

抗消化的寡糖(non-digestible oligosaccharides,NDOS)介于單糖和多糖之間,通常由≤10個單糖組成。近年來,越來越多的NDOS被用作益生元,調節(jié)腸道微生物結構及其代謝產(chǎn)物,進而改善人類健康[4-5],如低聚半乳糖、低聚果糖和低聚木糖等[6-7]。NDOS被腸道微生物群降解,可促進特定微生物的生長并產(chǎn)生短鏈脂肪酸;短鏈脂肪酸主要由乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽組成,它們在能量穩(wěn)態(tài)[8]、腸道屏障功能[9]、脂質和碳水化合物代謝[10]中發(fā)揮重要的生理功能。

黃原膠常由油菜黃單胞菌以低成本大量生產(chǎn),是美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準的安全的食品添加劑。黃原膠寡糖是潛在的可商業(yè)化的寡糖,之前的研究通過黃原膠酸水解制備得到純度為94%的黃原膠寡糖,黃原膠寡糖由葡萄糖、甘露糖和葡萄糖醛酸組成,摩爾比為42.72∶36.73∶19.47,其聚合度范圍為2～8。該黃原膠寡糖具有抵抗模擬唾液和胃腸液消化的能力,可以穩(wěn)定轉運到大腸[11]。在3個健康人的混合糞菌的體外發(fā)酵中黃原膠寡糖可增加產(chǎn)丁酸相關細菌的豐度和短鏈脂肪酸的水平[11-12],然而其對個體的腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的動態(tài)調控過程仍不清楚。腸道反應器通過動態(tài)地模擬人體腸道的微生物發(fā)酵環(huán)境而逐漸引起關注。本實驗室自主研發(fā)了新型模擬胃腸道反應器[13],該胃腸道反應器的構造情況、控制系統(tǒng)以及其功能特性已驗證了進行動態(tài)發(fā)酵的可行性[14]。本研究通過3個健康人糞便微生物的體外靜態(tài)分批發(fā)酵和1個健康人糞便微生物的體外胃腸道反應器動態(tài)發(fā)酵共同探究黃原膠寡糖對糞便微生物結構及其代謝產(chǎn)物的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黃原膠寡糖,本實驗室提供[11];果寡糖,Sigma公司;TIANamp糞便基因組DNA提取試劑盒,天根生化科技有限公司;Silica gel 60 F254薄層層析板,北京安捷飛科技有限公司;其他試劑,國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HYQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱,上海躍進醫(yī)療器械有限公司;7890A氣相色譜儀,美國安捷倫科技有限公司;DHG-Ⅲ鼓風干燥箱,上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;BGR新型模擬胃腸道反應器,本實驗室提供[13]。

1.3 實驗方法

1.3.1 薄層色譜法(thin-layer chromatography,TLC)

TLC用于評價黃原膠寡糖的降解。將發(fā)酵上清液(2 μL)點在10 cm×10 cm的薄層層析板上,然后將薄層層析板轉移到鼓風干燥箱中,在60 ℃下干燥3 min。將薄層層析板放在V(正丙醇)∶V(水)=7∶3的展開劑中展開100 min。然后將薄層層析板轉移到鼓風干燥箱中,在60 ℃下干燥3 min。將干燥的薄層層析板浸入地黃酚試劑(900 mg地黃酚、25 mL水、375 mL乙醇、50 mL濃硫酸)中染色,并立即在105 ℃下加熱4 min顯色。

1.3.2 體外靜態(tài)糞便菌群發(fā)酵方法

新鮮的健康人糞便是從3名健康捐贈者(1名男性和2名女性,年齡在35～50歲,BMI在24.60～29.24 kg/m2)中用無菌的糞便收集管收集,然后放進厭氧產(chǎn)氣袋中,置于冰上。健康捐贈者在糞便樣本捐贈之前至少2個月沒有服用益生菌或益生元。將這3個新鮮的糞便分別用滅菌的0.1 mol/L PBS稀釋以獲得10%質量分數(shù)的糞便漿液,并在無菌條件下通過4層紗布海綿過濾以除去食物殘留物?；A營養(yǎng)培養(yǎng)基(g/L)包含NaCl 0.1,K2HPO40.04,KH2PO40.04,NaHCO32.0,L-半胱氨酸鹽酸鹽 0.5,膽鹽 0.5,MgSO40.01,CaCl20.01,血紅素 0.025,維生素K 0.002,蛋白胨 2.0,酵母提取物 2.0,刃天青0.001,Tween 80 1 mL?；A營養(yǎng)培養(yǎng)基用作空白對照;將果寡糖以0.5%的質量分數(shù)添加到基礎營養(yǎng)培養(yǎng)基中作為陽性對照組;將黃原膠寡糖以0.5%的質量分數(shù)添加到基礎營養(yǎng)培養(yǎng)基中。然后在8 h內將3名捐贈者糞便漿液分別以體積分數(shù)10%接種到以上培養(yǎng)基中。每組在3個平行容器中于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中孵育48 h。發(fā)酵液以12 000 r/min離心3 min,細菌沉淀用于檢測菌群變化,上清液用于檢測乙酸,丙酸和丁酸變化。

1.3.3 體外動態(tài)胃腸道反應器發(fā)酵方法

用無菌糞便收集管采集1名健康捐贈者(1名男性,年齡為45歲,BMI為27.86 kg/m2)的糞便,然后放進厭氧產(chǎn)氣袋中,置于冰上。健康捐贈者在糞便樣本捐贈之前至少2個月沒有服用益生菌或益生元。將新鮮糞便用滅菌的0.1 mol/L PBS稀釋以獲得10%質量分數(shù)的糞便漿液,并在無菌條件下通過4層紗布海綿過濾以除去食物殘留物。基礎發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)成分為：淀粉5,阿拉伯半乳聚糖 1.0,果膠 2.0,木聚糖 1.0,酵母提取物 3.0,胰蛋白胨 1.0,酪蛋白 2.0,L-半胱氨酸 0.5,KCl 1.0,NaCl 0.5,K2HPO40.5,KH2PO40.5,CaCl2·6H2O 0.15,MgSO4·7H2O 0.01,氯化血紅素 0.025,膽汁鹽 0.4,FeSO4·7H2O 0.005,吐溫80 1 mL,維生素混合液1 mL,pH值為5.8。其中維生素混合液(g/L)成分為：甲萘醌 1.0,D-生物素 2.0,維生素B12 0.5,泛酸 10.0,煙酰胺 5.0,對氨基苯甲酸 5.0,硫胺素 4.0。在實驗期將淀粉換成等量的5 g/L黃原膠寡糖,即為黃原膠寡糖培養(yǎng)基。

向腸道反應器(bionic gastrointestinal reactor,BGR)中裝入160 mL基礎發(fā)酵培養(yǎng)基(反應器的總體積為230 mL),用4.0和6.8的pH校準液對pH電極進行校準,然后在115 ℃條件下滅菌20 min。待反應器自然冷卻至室溫,于超凈工作臺內向基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中以體積分數(shù)10%接入糞便漿液。接種后,將BGR轉移至固定位置,然后胃腸道反應器聯(lián)通循環(huán)水裝置,通過以規(guī)則的時間間隔將溫水泵入玻璃夾套和柔性軟管之間的空間,實現(xiàn)模擬腸道蠕動,溫水使模型內腔處于37 ℃。將pH值設置為5.8(模擬近端結腸的pH值),并通過pH傳感器結合泵入NaOH溶液(0.5 mol/L)使pH值自動調節(jié)在5.8左右。每隔8 h向BGR徐徐通入10 min N2以排出BGR中的氧氣使系統(tǒng)保持厭氧狀態(tài)。

BGR中糞便菌群經(jīng)過16 h發(fā)酵后達到穩(wěn)定階段,然后進行2 h饑餓處理使培養(yǎng)基中的碳源(淀粉)消耗殆盡,此時記錄為初始發(fā)酵時間(0 h)。然后以2 mL/min的速度用泵排出40 mL BGR中培養(yǎng)基,之后以2 mL/min的速度泵入40 mL黃原膠寡糖培養(yǎng)基,進入實驗期。每隔12 h補料40 mL黃原膠寡糖培養(yǎng)基,每隔12 h取樣,如此連續(xù)發(fā)酵48 h。發(fā)酵結束后,將得到的每個樣品12 000 r/min離心3 min,細菌沉淀用于檢測菌群變化,上清液用于檢測乙酸,丙酸和丁酸變化。使用TLC檢測發(fā)酵液上清液中黃原膠寡糖的降解。

1.3.4 短鏈脂肪酸濃度的檢測方法

通過使用氣相色譜法(gas chromatography,GC)分析短鏈脂肪酸的濃度,包括乙酸,丙酸和丁酸。將1 mL發(fā)酵液的上清液轉移至新的離心管中。將250 μL HCl溶液和1 mL乙醚添加至上清液,以終濃度為1 mmol/L 2-甲基丁酸作為內標,并將試管渦旋3 min。收集上層的有機組分并用無水硫酸鈉脫水,收集上清液并使其通過0.22 μm孔徑的過濾器。使用配備有HP-INNOWAX色譜柱的GC分析短鏈脂肪酸的濃度。烘箱溫度為60 ℃,并在4 min內升至190 ℃;進樣器溫度設置為220 ℃,檢測器溫度設置為250 ℃;將5 μL樣品以1∶20的分流比注入GC儀器,氮氣用作載氣,流速為1.5 mL/min。根據(jù)內標法計算短鏈脂肪酸的濃度。

1.3.5 糞便菌群組成的檢測方法

通過QIAamp DNA Stool Mini Kit提取細菌基因組DNA。使用通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴增16S rRNA基因的V3～V4區(qū)。使用TruSeq-DNA PCR-Free樣品制備試劑盒生成測序文庫,并通過MiSeq PE250平臺進行焦磷酸測序。分別使用FLASH(1.2.7版)和Qiime(1.9.1版)進行配對末端讀段的組裝和質量控制。Uparse(v7.0.1001)將具有>97%相似性的序列修剪分配給相同的操作分類單位(operational taxonomic units,OTU)。Silva數(shù)據(jù)庫(heep://www.arb-silva.de/)基于mothur算法用于注釋生物分類信息。使用R軟件進行冗余分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均重復3次,結果表示為平均值±標準偏差。使用Origin軟件作圖,采用SPSS軟件進行Tukey’s test,P<0.05表示統(tǒng)計學分析中差異顯著。

2 結果與分析

2.1 體外糞便菌群發(fā)酵中黃原膠寡糖的消耗

通過體外靜態(tài)分批發(fā)酵和動態(tài)的胃腸道反應器發(fā)酵,探究黃原膠寡糖對健康人腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的影響。在健康人糞便菌群發(fā)酵過程中,黃原膠寡糖的降解通過TLC方法進行檢測。如圖1-a所示,在體外靜態(tài)糞便菌群發(fā)酵中,果寡糖和黃原膠寡糖經(jīng)過3個健康人的糞便菌群發(fā)酵48 h后基本完全降解。在黃原膠寡糖的體外動態(tài)糞便菌群發(fā)酵中,本文呈現(xiàn)了BGR中的一組典型數(shù)據(jù)。如圖1-b所示,黃原膠寡糖在24～36 h的發(fā)酵過程中開始被部分降解,并且優(yōu)先降解黃原膠寡糖中低分子質量的成分;黃原膠寡糖在36～48 h的發(fā)酵過程中被完全降解。以上結果表明黃原膠寡糖在糞便菌群發(fā)酵48 h后可被完全降解,并且主要在24～48 h的發(fā)酵過程中被降解。MOON等[15]指出阿拉伯低聚糖的緩慢發(fā)酵可能使得短鏈脂肪酸在整個結腸內發(fā)揮有益的健康影響。FU等[16]指出在結腸遠端發(fā)酵的碳水化合物可能是改善人類結腸遠端出現(xiàn)的大多數(shù)結腸癌病例的有效策略。因此,黃原膠寡糖的延遲降解可能有助于黃原膠寡糖在結腸遠端發(fā)揮作用。

2.2 黃原膠寡糖對糞便菌群主要代謝產(chǎn)物的影響

乙酸、丙酸和丁酸是腸道微生物發(fā)酵碳水化合物的主要終產(chǎn)物,在宿主健康中發(fā)揮重要的作用[17]。如圖2所示,在體外靜態(tài)糞便菌群發(fā)酵48 h后,與空白相比,黃原膠寡糖可顯著增加乙酸、丙酸、丁酸和總短鏈脂肪酸的濃度,濃度分別為31.30、11.57、5.19和48.07 mmol/L;與果寡糖相比,盡管黃原膠寡糖的丙酸和總短鏈脂肪酸產(chǎn)量低于果寡糖,但是黃原膠寡糖的丁酸產(chǎn)量顯著高于果寡糖的丁酸產(chǎn)量,是果寡糖丁酸產(chǎn)量的2.66倍。此外,與空白相比,黃原膠寡糖和果寡糖的發(fā)酵液pH值均明顯下降,其中果寡糖的pH值下降最多,這與果寡糖的總短鏈脂肪酸產(chǎn)量最高相對應。

如圖3所示,在0～24 h的發(fā)酵過程中,黃原膠寡糖對乙酸、丙酸、丁酸的產(chǎn)量影響不大;在36～48 h的發(fā)酵過程中,乙酸、丙酸、丁酸和總短鏈脂肪酸的產(chǎn)量和NaOH的消耗量均顯著增加,這與黃原膠寡糖在24～48 h的發(fā)酵過程中降解的結果一致。在發(fā)酵48 h時,乙酸、丙酸、丁酸和總短鏈脂肪酸的濃度分別達到49.44、28.64、1.65和79.72 mmol/L,與0 h相比,分別增加1.67、1.40、6.25和1.58倍。

a-乙酸;b-丙酸;c-丁酸;d-總短鏈脂肪酸;e-pH圖2 在體外靜態(tài)糞便菌群發(fā)酵中短鏈脂肪酸濃度和pH的變化Fig.2 Changes in short-chain fatty acid levels,and pH in vitro static batch fermentation注:值為平均值±標準偏差(n=3);*表示P<0.05(下同)

結果表明在體外靜態(tài)和動態(tài)糞便菌群發(fā)酵中黃原膠寡糖均可顯著增加乙酸、丙酸、丁酸和總短鏈脂肪酸的產(chǎn)量,尤其是丁酸的產(chǎn)量。已有研究指出具有β(1→4)糖苷鍵的二糖比具有α(1→2,1→3,1→4,1→5)和 β(1→1,1→2,1 →3,1→5)糖苷鍵的二糖產(chǎn)生更多的丁酸鹽[18],這暗示黃原膠寡糖發(fā)酵中丁酸產(chǎn)量的增加可能與黃原膠寡糖中的β(1→4)糖苷鍵相關。丁酸在糖異生和脂肪生成代謝途徑中發(fā)揮有益的作用[19]。例如丁酸可改善大鼠原代脂肪細胞中激素調節(jié)的脂質代謝和胰島素刺激的葡萄糖攝取[20]。以上結果說明黃原膠寡糖可能通過增加丁酸的產(chǎn)量,參與改善宿主健康。

2.3 黃原膠寡糖對糞便菌群結構的影響

通過16S rRNA測序檢測糞便菌群組成的變化。在體外靜態(tài)和動態(tài)糞便菌群發(fā)酵中,根據(jù)97%的序列相似性分別檢測到482和555個OTU。如圖4所示,在體外靜態(tài)和動態(tài)糞便菌群發(fā)酵中,擬菌門(Bacteroidota)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)為優(yōu)勢菌門。在體外靜態(tài)糞便菌群發(fā)酵中,與空白相比,黃原膠寡糖可降低糞便菌群中Firmicutes/Bacteroidota的比例,黃原膠寡糖的動態(tài)發(fā)酵呈現(xiàn)相似的降低的Firmicutes/Bacteroidota的比例(圖5)。多個研究表明[21],肥胖動物和人類的腸道微生物群表現(xiàn)出更高的厚壁菌門/擬桿菌門比率,建議將該比率作為潛在的生物標志物,不過這仍需更多的證據(jù)。以上結果暗示黃原膠寡糖可能通過降低腸道菌群中Firmicutes/Bacteroidota的比例改善宿主腸道菌群結構。

體外靜態(tài)糞便菌群發(fā)酵中,在門水平和屬水平上,果寡糖和黃原膠寡糖發(fā)酵后的3個不同健康人來源的糞便菌群呈現(xiàn)差異的變化(圖4和圖6)。在屬水平,與空白和果寡糖相比,黃原膠寡糖在3個不同健康人的糞便菌群發(fā)酵中可同時增加Parabacteroides屬和Hungatella屬的相對豐度。此外,通過lefse分析果寡糖和黃原膠寡糖中顯著變化的菌群,發(fā)現(xiàn)與果寡糖相比,黃原膠寡糖可顯著增加Parabacteroides屬、Hungatella屬和Lachnoclostridium屬的相對豐度。

a-靜態(tài);b-動態(tài)圖6 在體外靜態(tài)和動態(tài)糞便菌群發(fā)酵中屬水平上主要的10個菌群的相對豐度變化Fig.6 Relative abundance of dominant genera(top 10) in in vitro static batch fermentation and dynamic BGR fermentation

此外,與果寡糖相比,黃原膠寡糖可顯著增加科水平上毛螺菌科(Lachnospiraceae)的相對豐度。毛螺菌科(Lachnospiraceae)和Lachnoclostridium屬被認為是腸道中產(chǎn)生丁酸鹽的細菌[16],在黃原膠寡糖的體外糞便菌群發(fā)酵中,毛螺菌科(Lachnospiraceae)和Lachnoclostridium屬的富集可能與丁酸產(chǎn)量的顯著增加相關。

體外動態(tài)糞便菌群發(fā)酵中,與0和24 h相比,黃原膠寡糖在48 h發(fā)酵時可極大的增加屬水平上Parabacteroides、Lachnospira(屬于Lachnospiraceae)和UBA1819的相對豐度。狄氏副擬桿菌(Parabacteroidesdistasonis)是Parabacteroides屬的主要成員之一,可通過在腸道中生產(chǎn)琥珀酸和次級膽汁酸減輕小鼠肥胖和代謝功能障礙[22]。毛螺菌科(Lachnospiraceae)被認為是包含產(chǎn)丁酸菌的重要的一個科,Lachnoclostridium屬和Lachnospira屬的產(chǎn)丁酸菌也屬于毛螺菌科(Lachnospiraceae)[16]。

圖7 LEfSe分析在體外靜態(tài)糞便菌群發(fā)酵中顯著變化的菌群(LDA score>4.0)Fig.7 LEfSe was used to analyze significantly differential taxa(LDA score>4.0) in vitro static batch fermentation

產(chǎn)丁酸菌在人類健康中起著至關重要的作用,包括為腸道上皮細胞提供能量、維持腸道細菌平衡和調節(jié)宿主細胞反應[23]。以上結果表明,在體外靜態(tài)和動態(tài)糞便菌群發(fā)酵中,黃原膠寡糖可明顯富集毛螺菌科(Lachnospiraceae)和Parabacteroides屬,進而改善腸道菌群結構。

3 結論

本文通過體外靜態(tài)和動態(tài)糞便菌群發(fā)酵評價黃原膠寡糖的益生元潛能。在體外靜態(tài)糞便菌群發(fā)酵中,48 h時,黃原膠寡糖基本被完全降解,顯著增加乙酸、丙酸、丁酸和總短鏈脂肪酸的產(chǎn)量(P<0.05);與果寡糖相比,黃原膠寡糖表現(xiàn)出較強的產(chǎn)丁酸能力。在體外動態(tài)糞便菌群發(fā)酵中,黃原膠寡糖主要在24～48 h的發(fā)酵過程中被降解并顯著增加乙酸、丙酸、丁酸、總短鏈脂肪酸的產(chǎn)量和NaOH的消耗量(P<0.05)。在體外靜態(tài)和動態(tài)糞便菌群發(fā)酵中,黃原膠寡糖均可降低Firmicutes/Bacteroidota的比例,增加毛螺菌科(Lachnospiraceae)和Parabacteroides屬的相對豐度,進而參與改善宿主腸道菌群結構。研究結果表明黃原膠寡糖具有一定的益生活性。