三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）foxl2基因功能初探及相關(guān)miRNA分析

張夢倩，張景琰，葛紅星，劉萍, ，李健, ，孟憲亮, 4*

( 1. 江蘇海洋大學(xué) 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005；2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071；3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237；4. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水生動(dòng)物基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071)

1 引言

foxl2（forkhead box protein L2）是Forkhead轉(zhuǎn)錄因子超家族的一員，是哺乳動(dòng)物卵巢發(fā)育最早的標(biāo)志性啟動(dòng)基因[1]，也是第一個(gè)被認(rèn)定在卵巢發(fā)育中發(fā)揮重要作用的常染色體基因[2]。2001年，Crisponi等[3]在對瞼裂狹小綜合征伴隨卵巢早衰患者致病基因的定位研究中，首次發(fā)現(xiàn)foxl2編碼基因與卵巢發(fā)育相關(guān)，研究結(jié)果顯示，所有被檢測的卵巢早衰患者的foxl2基因都發(fā)生了突變。通過觀察foxl2基因突變或缺失對小鼠卵巢的影響，進(jìn)一步確認(rèn)了foxl2基因在卵巢發(fā)育中的重要作用。通過基因敲除的方法，發(fā)現(xiàn)foxl2缺失的純合子（foxl2-/-）雌鼠的卵巢呈現(xiàn)小而不規(guī)則狀態(tài)，并且其中沒有初級(jí)卵泡的形成，卵巢發(fā)生退化，沒有生育能力[4-6]；foxl2的突變也會(huì)造成卵巢發(fā)育的異常，卵巢中的卵泡數(shù)量會(huì)減少，卵巢出現(xiàn)早衰[7]。在非哺乳類脊椎動(dòng)物中，foxl2基因與卵巢發(fā)育的密切相關(guān)性也已被證實(shí)[8-11]。Shi等[12]研究了牙鲆foxl2基因的多態(tài)性與其卵巢發(fā)育之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)foxl2單一位點(diǎn)的突變可以造成牙鲆卵巢指數(shù)的變化。foxl2在脊椎動(dòng)物卵巢發(fā)育中不可或缺的作用使其成為研究卵巢發(fā)育分子調(diào)控機(jī)制非常重要的候選基因[7,13]。

對脊椎動(dòng)物中的研究發(fā)現(xiàn)，foxl2的表達(dá)受到microRNA（miRNA）的調(diào)控[14]。miRNA是一類平均長度為22 bp的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，能夠與靶基因的3′非編碼區(qū)域（Untranslated Region, UTR）特異性結(jié)合，抑制翻譯或降解其mRNA，從轉(zhuǎn)錄后水平對靶基因表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控，在動(dòng)物的生長、發(fā)育、生殖等過程中都發(fā)揮重要作用[15]。研究表明，miR-133b可以靶向調(diào)控小鼠foxl2的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)其卵巢發(fā)育過程[16]。近些年，miRNA對卵巢發(fā)育的調(diào)控作用已成為甲殼動(dòng)物生殖生物學(xué)研究的新熱點(diǎn)。研究表明，miR-9能夠通過調(diào)控ERK信號(hào)通路關(guān)鍵基因進(jìn)而調(diào)節(jié)擬穴青蟹（Scylla paramamosain）的卵巢發(fā)育[17]。此外，miRNA還參與了切除眼柄誘導(dǎo)三疣梭子蟹卵巢成熟的過程。

目前，在無脊椎動(dòng)物中有關(guān)foxl2的研究剛剛起步，僅在海膽（Strongylocentrotus purpuratus）、太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）、櫛孔扇貝（Chlamys farreri）、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）、擬穴青蟹等少數(shù)物種中獲得了相應(yīng)foxl2基因的cDNA序列。在對櫛孔扇貝的研究發(fā)現(xiàn)，干擾foxl2表達(dá)后，卵巢發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)顯著下調(diào)。而在擬穴青蟹中，敲降foxl2后，卵黃蛋白原基因（vtg）的表達(dá)顯著上調(diào)[18]。上述研究表明，該基因在貝類和甲殼類卵巢發(fā)育中均發(fā)揮作用，但其功能可能存在差異。鑒于其在卵巢發(fā)育中具有重要作用，開展foxl2表達(dá)調(diào)控研究可能會(huì)為研發(fā)生殖調(diào)控技術(shù)提供重要參考。然而，有關(guān)無脊椎動(dòng)物foxl2表達(dá)調(diào)控的研究較為罕見。

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）隸屬于甲殼亞門（Crustacea），十足目（Decapoda），梭子蟹科（Portunidae），梭子蟹屬（Portunus），廣泛分布于中國、韓國、日本等河口和沿海水域，是我國重要的海水養(yǎng)殖種類。近些年，梭子蟹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，2018年養(yǎng)殖產(chǎn)量已達(dá)11.38×104t[19]。然而，由于對三疣梭子蟹生殖調(diào)控的認(rèn)知不足，未能建立起高效的生殖調(diào)控技術(shù)，高質(zhì)量苗種的產(chǎn)量無法滿足需求，嚴(yán)重限制了養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，亟需深入開展三疣梭子蟹生殖調(diào)控機(jī)理研究。本研究克隆了三疣梭子蟹foxl2（Ptfoxl2）基因的cDNA全長序列；分析了其在不同組織、不同發(fā)育時(shí)期以及切除眼柄后的表達(dá)模式；研究了干擾該基因表達(dá)對vtg基因表達(dá)的影響；預(yù)測了靶向foxl2的miRNA，并在細(xì)胞水平進(jìn)行了驗(yàn)證；分析了miRNA在不同發(fā)育時(shí)期以及切除眼柄后的表達(dá)特征。研究結(jié)果有助于深入理解三疣梭子蟹生殖調(diào)控機(jī)制，為研發(fā)生殖調(diào)控新技術(shù)提供參考。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用三疣梭子蟹取自山東省昌邑市海豐水產(chǎn)養(yǎng)殖有限責(zé)任公司昌邑實(shí)驗(yàn)基地。選取附肢完整且無明顯傷痕的雌性三疣梭子蟹，體重為52～261 g。在實(shí)驗(yàn)室條件下暫養(yǎng)7 d。水溫為（20±2）℃、鹽度為31±1、pH為7.6±0.3，持續(xù)充氧。每天17:00投喂鮮活菲律賓蛤仔，8:00清除箱底排泄物及食物殘?jiān)蟾鼡Q1/3～1/2等溫度的新鮮海水。

2.2 Ptfoxl2 cDNA全長克隆

根據(jù)三疣梭子蟹性腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中foxl2基因片段序列[20]，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)foxl23′和5′特異性引物（表1）。利用Trizol試劑提取三疣梭子蟹組織總RNA，采用Nanodrop微量分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量以及完整性。按照SMART RACE Amplification Kits說明書，利用cDNA 末端快速擴(kuò)增（Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE）所需的cDNA模板，使用Advantage 2 PCR Kit進(jìn)行3′和5′末端擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、凝膠回收試劑盒得到擴(kuò)增的目的片段，用pMD18-T載體連接所得目的片段，并轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂板過夜培養(yǎng)，菌落檢測后進(jìn)行測序分析。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物的序列Table 1 The sequences of the primers used in this study

2.3 序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用VecScreen（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/）去除載體序列，由Contig express軟件進(jìn)行序 列 拼 接、ORFFinder（https://www.ncbi.nlm. nih.gov/orffinder/）進(jìn)行開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）預(yù)測及氨基酸翻譯。利用ExPASy（http://web.expasy.org/compute_pi/）進(jìn)行分子量及等電點(diǎn)的預(yù)測，利用Interpro Scan（http://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html）進(jìn)行蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域分析。使用Bioedit軟件對三疣梭子蟹foxl2氨基酸序列與從GenBank中下載的其他物種的foxl2氨基酸序列進(jìn)行比對。

2.4 Ptfoxl2基因的表達(dá)分析

2020年9月至2021年1月，收集三疣梭子蟹卵巢發(fā)育不同時(shí)期的樣本。將梭子蟹在實(shí)驗(yàn)室條件下暫養(yǎng)7 d。將樣本卵巢組織分為兩份，一份保存于液氮中，另一份采用4%多聚甲醛固定。參考吳旭干等[21]對卵巢組織分期方法，在顯微鏡下觀察三疣梭子蟹樣品的組織學(xué)特征，并將卵巢分為5個(gè)時(shí)期。

根據(jù)三疣梭子蟹foxl2序列設(shè)計(jì)特異性引物（表1），參照AG SYBR Green Pro Taq HS qPCR試劑盒說明書對三疣梭子蟹不同組織、不同發(fā)育時(shí)期foxl2基因相對表達(dá)量進(jìn)行分析。反應(yīng)體系（20 μL）：10 μL SYBR Green Pro Taq HS Premix II (2×)、0.4 μL ROX Reference Dye II、0.8 μL 10 μmol/L的 正 反 向 引 物、6.0 μL DEPC水和2.0 μL cDNA稀釋液。反應(yīng)程序：95℃ 30 s；95℃ 5 s、60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。foxl2相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

2.5 切除眼柄實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)選用處于卵巢III-IV期三疣梭子蟹雌蟹為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，切除眼柄方法采用燒紅鑷子緊捏眼柄基部3 s。將切除雙側(cè)眼柄后的三疣梭子蟹養(yǎng)殖于室內(nèi)循環(huán)水系統(tǒng)，為防止其打斗，每個(gè)10 L的養(yǎng)殖缸內(nèi)僅放置1只梭子蟹。切除眼柄后1 d、3 d、6 d分別取3只三疣梭子蟹，解剖收集卵巢組織，樣品均在液氮中速凍，并保存于-80℃超低溫冰箱用于后續(xù)基因表達(dá)分析。

2.6 RNA干擾實(shí)驗(yàn)

采用New England Biolabs公司的HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis試劑盒合成RNA干擾實(shí)驗(yàn)（RNA interference，RNAi）所需的Ptfoxl2dsRNA，所用引物序列見表1。該實(shí)驗(yàn)以處于卵巢快速發(fā)育期（III-IV期）的雌蟹（體重為（206.7±5.8）g）為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以注射綠色熒光蛋白（GFP）dsRNA的個(gè)體為對照組，以注射Ptfoxl2dsRNA的個(gè)體為干擾組。GFP dsRNA和Ptfoxl2dsRNA的注射劑量均為2 μg/g體重，注射部位為第三步足基部。注射24 h和48 h后，對照組和干擾組分別取3個(gè)個(gè)體，解剖收集卵巢組織，液氮速凍，保存于-80℃超低溫冰箱用于后續(xù)基因表達(dá)分析。

2.7 Ptfoxl2相關(guān)miRNA預(yù)測和驗(yàn)證

通過miRanda和RNAhybrid軟件預(yù)測潛在靶向Ptfoxl23′UTR區(qū)域的miRNA。通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)，對預(yù)測miRNA對Ptfoxl2的調(diào)控作用進(jìn)行驗(yàn)證。將miRNA類似物和陰性對照類似物（由通用生物股份有限公司合成），與包含有野生型和突變型miRNA結(jié)合位點(diǎn)3′UTR序列的pmirGLO質(zhì)粒，分別共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，使用Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega）測定螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性相對值。

2.8 Ptfoxl2相關(guān)miRNA的表達(dá)分析

利用miRcute miRNA提取分離試劑盒（天根生化科技有限公司）提取三疣梭子蟹不同組織、不同發(fā)育時(shí)期及切除眼柄后卵巢組織的miRNA，使用miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒（天根生化科技有限公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測試劑盒（天根生化科技有限公司）檢測miRNA在三疣梭子蟹不同組織、不同時(shí)期以及切除眼柄后的相對表達(dá)量。反應(yīng)體系（20 μL）：10 μL 2×miRcute Plus miRNA PreMix、0.4 μL正 反 向引物、2.0 μL miRNA第一鏈 cDNA、7.2 μL ddH2O。反應(yīng)程序：95℃ 15 s；95℃ 20 s、60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。兩組之間比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組之間比較應(yīng)用單因素方差分析。以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 Ptfoxl2基因cDNA全長序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析

序列分析表明，Ptfoxl2基因cDNA全長2 502 bp（OK413951），3′端和5′端基因片段長度分別為211 bp和701 bp，包含1 590 bp的開放閱讀框，共編碼529個(gè)氨基酸（圖1）。在線分析發(fā)現(xiàn)，Ptfoxl2基因包含1個(gè)Forkhead結(jié)構(gòu)域（228～323 aa）。通過BLAST同源性比對分析，發(fā)現(xiàn)三疣梭子蟹Ptfoxl2氨基酸序列與擬穴青蟹Ptfoxl2的同源性最高，為96%；與中華絨螯蟹、斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）的同源性分別為86%、85%，且都含有Forkhead結(jié)構(gòu)域（圖2）。

圖1 Ptfoxl2基因cDNA全長序列以及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of Ptfoxl2 gene

圖2 4種甲殼動(dòng)物foxl2氨基酸序列多重比對Fig. 2 Multiple alignments of the amino acid sequences of foxl2 in four crustacean species

3.2 Ptfoxl2基因表達(dá)分析結(jié)果

利用Real-time PCR技術(shù)，分析了foxl2基因在三疣梭子蟹不同組織的表達(dá)分布特征。結(jié)果顯示，Ptfoxl2在所有被測組織中均有表達(dá)，其在卵巢組織中的表達(dá)量最高（p＜0.05），其次為腦神經(jīng)節(jié)、肝胰腺、胃、胸神經(jīng)節(jié)等組織，在血淋巴中的表達(dá)量最低（圖3A）。通過對Ptfoxl2在卵巢發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，該基因在不同時(shí)期的表達(dá)存在顯著差異（p＜0.05），其在V期卵巢組織表達(dá)量最高，其次為III期、IV期，在II期卵巢中表達(dá)量最低（圖3B）。切除眼柄后Ptfoxl2表達(dá)分析結(jié)果表明，切除眼柄后第1天、第3天、第6天，該基因在卵巢組織的表達(dá)量均顯著下降（p＜0.05）（圖3C）。

圖3 Ptfoxl2基因在三疣梭子蟹不同組織（A）、不同卵巢發(fā)育時(shí)期（B）以及切除眼柄后（C）的表達(dá)Fig. 3 The expression of Ptfoxl2 in different tissues (A), in different ovarian developmental stages (B) and after eyestalk ablation (C)

3.3 Ptfoxl2干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與注射GFP dsRNA組三疣梭子蟹相比，注射Ptfoxl2dsRNA的個(gè)體在24 h和48 h后，卵巢Ptfoxl2的表達(dá)均出現(xiàn)了顯著下調(diào)（p＜0.05）（圖4A），干擾效率分別為60.24%和53.15%。qRT-PCR結(jié)果顯示，注射Ptfoxl2dsRNA組vtg基因的表達(dá)顯著上調(diào)（p＜0.05）（圖4B）。

圖4 注射Ptfoxl2 dsRNA 和GFP dsRNA后卵巢Ptfoxl2（A）和vtg（B）基因的表達(dá)Fig. 4 Relative expression of Ptfoxl2 (A) and vtg (B) in ovary after injecting Ptfoxl2 dsRNA and GFP dsRNA

3.4 Ptfoxl2相關(guān)miRNA的預(yù)測和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示，miR-9以及本實(shí)驗(yàn)在前期研究中新識(shí)別到的2個(gè)miRNA—novel-52和novel-68可能與Ptfoxl23′UTR結(jié)合。通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)，對miRNA與Ptfoxl2靶向調(diào)控作用進(jìn)行了驗(yàn)證（圖5）。結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染novel-52類似物和pmirGLO-Ptfoxl2-3′UTR組以及共轉(zhuǎn)染novel-68類似物和pmirGLO-Ptfoxl2-3′UTR組螢火蟲相對熒光素酶活性未出現(xiàn)顯著變化（p＞0.05），而共轉(zhuǎn)染miR-9類似物和pmirGLO-Ptfoxl2-3′UTR組螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性比值顯著降低（p＜0.05），表明miR-9能夠與Ptfoxl2基因3′UTR靶向結(jié)合。

圖5 共轉(zhuǎn)染野生型和突變型質(zhì)粒和miRNA類似物后熒光素酶的相對活性Fig. 5 Luciferase activity of the reporter plasmid containing wild-type or mutant target site after co-transfection of plasmid and miRNA mimics

3.5 Ptfoxl2相關(guān)miRNA的表達(dá)分析結(jié)果

組織表達(dá)分布結(jié)果顯示，miR-9在三疣梭子蟹各組織中均有表達(dá)，其在鰓、卵巢和胃中的表達(dá)量顯著高于其他組織（p＜0.05），其次為肌肉、胸神經(jīng)節(jié)，腦神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)量最低（圖6A）。miR-9在不同發(fā)育時(shí)期卵巢組織中的表達(dá)量存在顯著差異（p＜0.05），隨著卵巢發(fā)育其表達(dá)量先上升后下降，在IV期達(dá)到最高，在V期表達(dá)量出現(xiàn)顯著降低（圖6B）。切除眼柄后，卵巢組織中miR-9的表達(dá)量出現(xiàn)顯著變化（p＜0.05），在第1天表達(dá)量出現(xiàn)顯著上調(diào)，在第3天達(dá)到最高值，在第6天開始降低（圖6C）。

圖6 miR-9在三疣梭子蟹不同組織（A）、不同卵巢發(fā)育時(shí)期（B）以及切除眼柄后（C）的表達(dá)Fig. 6 The expression of miR-9 in different tissues (A), in different ovarian developmental stages (B) and after eyestalk ablation (C)

4 討論

本研究克隆了三疣梭子蟹foxl2基因cDNA全長序列，預(yù)測氨基酸序列包含1個(gè)高度保守的Forkhead結(jié)構(gòu)域和1個(gè)核定位信號(hào)序列。同源性分析顯示，Ptfoxl2與其他蟹類foxl2序列具有較高的同源性，其中與擬穴青蟹同源性高達(dá)96%，提示Ptfoxl2可能與擬穴青蟹foxl2（Spfoxl2）功能具有相似性。但是，Ptfoxl2與Spfoxl2組織表達(dá)分布存在差異[18]。雖然Ptfoxl2與Spfoxl2都在卵巢組織中高表達(dá)，但Ptfoxl2在所檢測的組織中均有表達(dá)，而Spfoxl2僅在卵巢、精巢和肝胰腺中表達(dá)，表明Ptfoxl2的功能可能具有多效性。

大量研究發(fā)現(xiàn)，foxl2在脊椎動(dòng)物卵巢顆粒細(xì)胞分化、卵巢發(fā)育和功能維持等方面具有重要作用。目前，foxl2基因序列已在數(shù)種無脊椎動(dòng)物中克隆獲得，但針對其功能的研究卻鮮有報(bào)道。Liu等[22]發(fā)現(xiàn)，foxl2在櫛孔扇貝中的表達(dá)呈明顯的性別二態(tài)性，在卵巢中的表達(dá)遠(yuǎn)高于精巢，推測該基因在卵巢發(fā)育中發(fā)揮作用。Wei等[23]發(fā)現(xiàn)，海灣扇貝幼貝中foxl2的表達(dá)與雌激素的水平呈正相關(guān)，推測該基因通過調(diào)控雌激素水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)性腺分化過程。在對中華絨螯蟹的研究發(fā)現(xiàn)，foxl2在卵巢成熟期表達(dá)量顯著上調(diào)，與DDX20和FTZ-F1結(jié)合，抑制卵巢中vtg基因的表達(dá)。在不同組織中的表達(dá)分析結(jié)果顯示，Ptfoxl2在卵巢組織中的表達(dá)量最高，顯著高于其他組織，暗示其可能參與了三疣梭子蟹卵巢發(fā)育調(diào)控過程。該基因在卵巢發(fā)育過程中的表達(dá)模式與中華絨螯蟹相似，同樣在卵巢近成熟期和成熟期表達(dá)量顯著升高。該時(shí)期卵黃發(fā)生以外源性卵黃合成為主，即在肝胰腺內(nèi)合成，通過血淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)到卵巢組織，而卵巢內(nèi)的卵黃合成減少。此外，干擾Ptfoxl2表達(dá)后，卵巢組織vtg基因的表達(dá)顯著上調(diào)，這與擬穴青蟹foxl2干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[18]。上述結(jié)果表明，foxl2可能在三疣梭子蟹卵巢發(fā)育中發(fā)揮重要作用，能夠顯著抑制內(nèi)源性卵黃合成。

迄今，關(guān)于甲殼動(dòng)物foxl2表達(dá)調(diào)控的研究還未見報(bào)道。切除眼柄是生產(chǎn)中常用的刺激甲殼類性腺成熟的方法，此方法通常認(rèn)為是通過去除眼柄中X-器官竇腺復(fù)合體分泌的性腺抑制激素（GIH）來刺激性腺成熟，但是切除眼柄會(huì)損傷親體，且會(huì)造成卵質(zhì)量下降、孵化率降低等問題[24]。近些年，為了探尋替代眼柄切除的促熟新方法，國內(nèi)外研究者針對切除眼柄誘導(dǎo)性腺發(fā)育的分子機(jī)制開展了較為深入的研究。已有研究表明，切除眼柄誘導(dǎo)卵巢成熟是一個(gè)涉及多種分子和信號(hào)通路的復(fù)雜過程。Uawisetwathana等[25]發(fā)現(xiàn)，切除斑節(jié)對蝦眼柄能夠激活性腺激素釋放激素信號(hào)通路、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟等信號(hào)通路。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，切除眼柄后，三疣梭子蟹Cdk7、Cyclin H等基因表達(dá)均出現(xiàn)顯著上調(diào)，表明切除眼柄能夠激活成熟促進(jìn)因子（Maturation-Promoting Factor，MPF），從而促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟分裂[26-27]。此外，切除眼柄會(huì)促進(jìn)三疣梭子蟹甲基法尼酯合成相關(guān)蛋白的表達(dá)，激活鈣離子信號(hào)通路[28]。本研究中，三疣梭子蟹卵巢foxl2基因的表達(dá)在切除眼柄后第1天、第3天、第6天均出現(xiàn)了顯著下調(diào)。因此，我們推測Ptfoxl2受眼柄神經(jīng)內(nèi)分泌因子的調(diào)控，參與了切除眼柄誘導(dǎo)卵巢成熟的過程。切除眼柄能夠抑制foxl2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)卵黃合成。

近些年，miRNA已被證實(shí)在甲殼動(dòng)物卵巢發(fā)育中發(fā)揮重要作用。Song等[29]發(fā)現(xiàn)，miR-2和miR-133通過調(diào)控Cyclin B的表達(dá)，控制中華絨螯蟹卵母細(xì)胞成熟過程。Jia等[30]對擬穴青蟹的研究表明，miR-277參與眼柄中卵巢發(fā)育相關(guān)重要神經(jīng)肽—卵黃抑制激素的表達(dá)調(diào)控。目前，miRNA是否參與了甲殼動(dòng)物foxl2基因的表達(dá)調(diào)控仍未知。本研究利用生物信息學(xué)方法預(yù)測了其靶基因，并通過雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)，從細(xì)胞水平進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示，miR-9能夠與Ptfoxl23′UTR靶向結(jié)合。分析顯示，miR-9在鰓、肝胰腺組織和胃中表達(dá)量較高，但在這3個(gè)組織間無顯著差異，表明miR-9可能具有多種功能。同一miRNA可能調(diào)控多個(gè)靶基因，其在不同組織中可能也發(fā)揮不同的作用[31]。在卵巢V期（成熟期），miR-9表達(dá)量顯著下調(diào)，而Ptfoxl2表達(dá)則顯著上調(diào)。此外，切除眼柄后，卵巢miR-9的表達(dá)顯著出現(xiàn)上調(diào)，而Ptfoxl2表達(dá)趨勢與之相反，進(jìn)一步表明，miR-9能夠從轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控Ptfoxl2的表達(dá)。

5 結(jié)論

本研究克隆得到Ptfoxl2基因cDNA全長序列，分析了該基因在不同組織、不同發(fā)育時(shí)期卵巢組織以及切除眼柄后的表達(dá)模式，研究了干擾其表達(dá)對卵巢組織vtg基因表達(dá)的影響，初步證實(shí)Ptfoxl2參與三疣梭子蟹卵巢發(fā)育調(diào)控，能夠抑制內(nèi)源性卵黃合成。預(yù)測了靶向Ptfoxl2的miRNA，并在細(xì)胞水平進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)合miR-9在卵巢發(fā)育不同時(shí)期以及切除眼柄后的表達(dá)分析，首次證實(shí)miRNA（miR-9）能夠從轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控Ptfoxl2的表達(dá)。研究結(jié)果為深入開展三疣梭子蟹卵巢發(fā)育調(diào)控機(jī)制，研發(fā)生殖調(diào)控新技術(shù)提供了重要參考。