Hp陽性胃潰瘍患者Hp根除前后的腸道菌群特征研究

魯艷妮，周清文

長安醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 西安 710016

胃幽門螺旋桿菌(H. pylori，Hp)屬于革蘭氏陰性菌，耐酸屬性使其成為胃內(nèi)優(yōu)勢菌種，定植于胃黏膜上皮，分泌多種毒素，引起胃部損傷[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約超過50%的人感染Hp，國內(nèi)有19 個省市人群HP感染率超過50%[2-3]。Hp 引起的胃潰瘍無法自愈，嚴(yán)重者會引起胃出血，甚至發(fā)生胃癌，因此Hp的根除治療在胃腸疾病中至關(guān)重要[3]。人體腸道內(nèi)有10萬億個細(xì)菌與人類共生，它們可以利用蛋白質(zhì)殘?jiān)铣扇梭w必需氨基酸，參與糖脂代謝，在控制體重、提高消化能力、抵御感染、促進(jìn)微量元素吸收等方面有著重要作用[4]。人體腸道內(nèi)微生物之間互相制約，相互依存，在人體內(nèi)形成一種復(fù)雜的生態(tài)平衡[5]。有研究表明在根除Hp 治療過程中，會改變口腔及胃腸道菌群組成，并提高耐藥菌定植于腸道的概率，患者腸道微生態(tài)受到長時間影響后可能需要4 年時間才能恢復(fù)到正常水平[6]。目前關(guān)于Hp 陽性染胃潰瘍患者腸道菌群分布特征報(bào)道較少。本研究通過檢測Hp 陽性胃潰瘍患者腸道菌群分布，進(jìn)一步闡述患者治療前后腸道微生態(tài)環(huán)境的變化，為臨床Hp感染胃潰瘍治療奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年4 月至2020 年3 月長安醫(yī)院收治的122 例Hp 陽性胃潰瘍患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①胃鏡檢查顯示明顯潰瘍病灶伴隨黏膜水腫及皺襞不集中，符合《胃腸道疾病內(nèi)鏡診斷與治療學(xué)》[7]中胃潰瘍診斷標(biāo)準(zhǔn)；②符合《第五次全國幽門螺桿菌感染處理共識報(bào)告》[8]，通過胃黏膜活檢后組織切片染色及14C 尿素呼氣試驗(yàn)判斷Hp 陽性；③患者免疫系統(tǒng)正常，可以耐受Hp 根除治療；④1 個月內(nèi)未服用抗生素、質(zhì)子泵抑制劑(PPI)、益生菌等影響腸道微生物分布的藥物者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往抗生素藥物過敏者；②合并患有其他胃腸功能疾病，需要進(jìn)行胃部手術(shù)者；③嚴(yán)重內(nèi)部感染，寄生蟲感染者；④肝腎功能不全者；⑤妊娠及哺乳期婦女；⑥無法完成治療后隨訪者。122 例患者中男性58 例，女性64 例；年齡48～60 歲，平均(48.63±12.24)歲。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核通過，患者均知情并簽署知情同意書。

1.2 胃鏡檢查及胃黏膜取樣 患者提前禁食12 h，檢查前喉嚨部局部麻醉，選取左臥位，患者檢查過程中檢查過程中保持深呼吸，切勿咬胃管。通過活檢鉗鉗取5 塊胃黏膜組織用于切片檢查，分別取自如下位置：2 塊來自胃竇，2 塊來自胃體，1 塊取于胃角。所有取樣標(biāo)記部位后液氮凍存，用于Hp陽性檢查。

1.3 HP 治療方法 參照《消化內(nèi)科疾病診療指南》[9]給予質(zhì)子泵抑制劑、胃黏膜保護(hù)劑等常規(guī)治療，并進(jìn)行含鉍四聯(lián)療法(艾司奧美拉唑鎂腸溶片20 mg(江蘇濟(jì)川藥業(yè)有限公司)，1粒/次，2次/d，早晚餐前半小時口服；膠體果膠鉍膠囊200 mg(浙江得恩德制藥有限公司)，1 粒/次，3次/d；阿莫西林膠囊1000 mg(深圳高卓藥業(yè)有限公司)，1粒/次，2次/d，早晚餐后口服；克拉霉素緩釋膠囊500 mg(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，2次/d，早晚餐后口服。14 d為一個療程，治療Hp感染胃潰瘍，及時記錄患者在治療過程中的不良反應(yīng)。治療結(jié)束及結(jié)束后4周胃黏膜切片病理學(xué)檢查顯示陰性并且14C 尿素呼氣試驗(yàn)結(jié)果＜100(dmp/mmol)，即判定Hp根除。

1.4 胃潰瘍愈合判斷 治療前后取患者胃黏膜判定潰瘍病理分期[7]：胃潰瘍疾病進(jìn)程主要分為A 期(潰瘍活動期)、H 期(黏膜愈合期)和S 期(潰瘍瘢痕期)。A 期分為A1期和A2期，A1期主要表現(xiàn)黏膜高度水腫，底部有黃色和白色的濃苔；A2期潰瘍有愈合趨勢，潰瘍的周圍出現(xiàn)紅暈，黃白苔開始減少。H期分為H1期和H2期，H1期黏膜開始愈合，潰瘍縮小，再生上皮形成的紅暈向潰瘍面聚集；H2期，黏膜愈合期的再生上皮將潰瘍的底部被再生上皮完全覆蓋，潰瘍已經(jīng)到達(dá)愈合期。S 期分為S1期和S2期，S1期主要是指的是潰瘍愈合后形成紅色的瘢痕；S2期指紅色瘢痕消退，變成白色瘢痕期，潰瘍完全愈合。胃鏡結(jié)果顯示潰瘍處于H1～S2期，即判定潰瘍愈合。

1.5 糞便檢查及腸道微生物DNA 提取 于Hp根除前1 d、治療結(jié)束后1 d、治療結(jié)束后4 周分別采集患者新鮮糞便10 g 混合于0.9%生理鹽水10 mL，1200 r/min 5 min離心3次，去除粗顆粒，收集上清后，9000 r/min 離心3 min，取沉淀懸浮于緩沖液中，用于微生物DNA提取。取200 μL 菌體樣品，加入1 mL 抑制劑，渦旋混合后70℃加熱，12000 r/min 離心3 min取上清，加入蛋白酶K，整個操作過程按照QIAamp DNA Stool Mini Kit 試劑盒(德國QIAGEN 公司)說明書，提取樣本細(xì)菌基因組并檢測DNA含量。

1.6 腸道菌群鑒定與分布 進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析PCR條帶，根據(jù)是否存在非特異性擴(kuò)增判斷不同菌群引物特異性好壞，以用于后續(xù)熒光定量PCR(RT-qPCR)擴(kuò)增。遵照RT-qPCR試劑盒(北京天根生物有限公司)說明進(jìn)行操作，根據(jù)公式copies/μL=(6.02×1014×質(zhì)粒濃度ng/μL)/(質(zhì)粒分子量×660)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒拷貝數(shù)，將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)稀釋10 倍，分別以101～109為質(zhì)粒模板進(jìn)行RT-qPCR，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq 10 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，DNA5 μL，ddH2O 3 μL。反應(yīng)條件：95℃8 min；95 ℃變性10 s，58℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，重復(fù)50 個循環(huán)。待測樣本微生物DNA反應(yīng)體系與反應(yīng)條件與上述相同，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每個樣本拷貝數(shù)，上下游引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)描述，兩兩樣本比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以四分位數(shù)間距M(P25，P75)表示，組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)，組內(nèi)兩兩比較采用Z 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hp根除及潰瘍愈合情況 根據(jù)Hp感染和根除診斷標(biāo)準(zhǔn)，治療結(jié)束后共112 例顯示Hp 陰性，10 例顯示Hp陽性，根除率達(dá)91.80%。胃鏡結(jié)果顯示，治療前A1期105 例，A2期17 例；治療后符合胃潰瘍愈合判斷標(biāo)準(zhǔn)的共117 例，分別為：H1期18 例，H2期32 例，S1期59 例，S2期8 例，潰瘍愈合率達(dá)95.90%；治療后未達(dá)愈合標(biāo)準(zhǔn)的共5 例，均為A2期。治療過程中6 例患者出現(xiàn)輕度腹瀉及惡心，均可耐受并自行緩解。

2.2 Hp 根除前后胃潰瘍患者腸道菌群特征 與治療前比較，治療結(jié)束時大腸埃希菌屬、糞腸球菌數(shù)量均升高，長雙歧桿菌、脆弱擬桿菌數(shù)量均降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，嗜酸乳酸菌數(shù)量無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；治療結(jié)束后4 周各菌群數(shù)量無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與治療結(jié)束時比較，治療結(jié)束后4周大腸埃希菌、糞腸球菌數(shù)量均降低，長雙歧桿菌、脆弱擬桿菌數(shù)量均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，嗜酸乳酸菌數(shù)量無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2和圖1。

表2 Hp陽性胃潰瘍患者Hp根除前后腸道菌群特征(log copies/g，n=112)

圖1 Hp陽性胃潰瘍患者Hp根除前后腸道菌群比較

3 討論

研究表明，Hp是胃潰瘍患者的主要致病因素，Hp不僅損傷胃黏膜，還會促進(jìn)胃酸分泌，進(jìn)一步加重胃潰瘍[10]。人體腸道微生態(tài)環(huán)境與人類健康息息相關(guān)，在免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)發(fā)育、抵抗病原侵襲等方面發(fā)揮重要作用[11]。有研究報(bào)道雙歧桿菌、乳酸桿菌等可以合成人體生長發(fā)育必須的B族維生素、煙酸等[12]。此外，腸道菌群可以利用宿主體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)合成神經(jīng)遞質(zhì)、氨基酸等化合物，對機(jī)體發(fā)出調(diào)節(jié)信號[13]。研究表明腸道菌群參與多種胃腸疾病的發(fā)生發(fā)展，如萎縮性胃炎、抵抗性腹瀉、結(jié)腸癌等，在機(jī)體消化系統(tǒng)疾病中起重要作用[14]。

治療后112 例顯示Hp 陰性，根除率達(dá)91.80%；胃潰瘍愈合117例，潰瘍愈合率達(dá)95.90%，潰瘍愈合分期如下：H1期18例，H2期32例，S1期59例，S2期8例，治療過程中出現(xiàn)的輕度不良反應(yīng)包括腹瀉及惡心，均可自行緩解。提示四聯(lián)法治療可以有效安全地根除Hp，并幫助患者愈合潰瘍傷口。目前在根除Hp 治療方案中，質(zhì)子泵抑制劑(PPI)和鉍劑聯(lián)合兩種抗生素為首選治療方法，鉍劑協(xié)同PPI減少胃酸分泌，防止?jié)兠孢M(jìn)一步擴(kuò)大，抗生素抑菌消炎促進(jìn)傷口愈合[15]。治療結(jié)束時大腸埃希菌屬、糞腸球菌數(shù)量均比治療前升高，長雙歧桿菌、脆弱擬桿菌數(shù)量比治療前降低，嗜酸乳酸菌數(shù)量無明顯變化；治療結(jié)束后4周大腸埃希菌、糞腸球菌數(shù)量均比治療結(jié)束時降低，長雙歧桿菌、脆弱擬桿菌數(shù)量均比治療結(jié)束時升高，嗜酸乳酸菌數(shù)量無明顯變化；治療結(jié)束后4 周各菌群數(shù)量相比治療前無明顯變化。提示Hp 根除治療后對腸道菌群多樣性產(chǎn)生影響，引起腸道微生態(tài)環(huán)境失衡，停藥4周后腸道菌群分布開始恢復(fù)。研究表明，在Hp 根除治療過程中，患者常出現(xiàn)惡心，腹瀉等胃腸功能失調(diào)癥狀，PPI在減少胃酸分泌的同時會影響胃酸抑制細(xì)菌的能力，導(dǎo)致外來細(xì)菌更易侵入機(jī)體，從而改變腸道微生態(tài)環(huán)境[16]。有研究報(bào)道，抗生素藥物的使用會影響有益菌的定植和生長，引起細(xì)菌耐藥性，改變腸道優(yōu)勢菌群種類和數(shù)量，導(dǎo)致腸道微生態(tài)發(fā)生變化，引起患者胃腸功能紊亂[17-18]。本研究結(jié)果顯示治療后Hp 根除率較高，但治療結(jié)束后腸道菌群數(shù)量發(fā)生變化，腸道微生物定植力受到一定影響，治療結(jié)束后4 周腸道菌群有一定恢復(fù)趨勢。

綜上所述，本研究通過檢測治療前后腸道菌群分布反映Hp 陽性胃潰瘍患者腸道微生態(tài)變化，為臨床治療Hp感染胃潰瘍提供更多思路。