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    變應性鼻炎患者外周血PBMC中miR-146a和STAT5b的表達及臨床意義

    2022-04-18 09:26:16王忠勛楊超曹永華
    海南醫(yī)學 2022年7期
    關鍵詞:鼻部變應性中重度

    王忠勛,楊超,曹永華

    陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院耳鼻喉科,陜西 西安 712000

    過敏性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是一種常見的過敏性疾病,受過敏原影響,在多種細胞因子的參與下,涉及IgE 介導的介質釋放的鼻黏膜炎癥反應,病情嚴重者伴有哮喘[1-2]。微小RNAs(microRNAs,miRNAs)是一種廣泛存在于生命中的正常調控機制,參與癌癥、代謝疾病、神經系統(tǒng)疾病、傳染病和自身免疫性疾病過程,廣泛存在于患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)、血漿和血清中[3]。根據(jù)生理狀況、疾病類型和病程,miRNA 分子的類型和數(shù)量會發(fā)生變化。miR-146 可以調節(jié)適應性免疫反應和T 細胞活化[4]。JAK-STAT(Janus 激酶-信號轉導和轉錄激活因子)是一種進化保守的信號通路,可以參與過敏性鼻炎、哮喘等炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)生[5]。信號傳導及轉錄激活蛋白(signal transducer and activator of transcription,STATs)位于自身免疫和炎癥性疾病發(fā)病機制中細胞因子下游,也與變應性鼻炎的發(fā)病有關。STAT5b 屬于信號轉導和轉錄激活因子家族,研究發(fā)現(xiàn)其異常激活和過度表達與腫瘤的發(fā)生存在關聯(lián),但與AR的關系尚不清楚[6]。本研究主要探討AR 患者PBMC 中微小RNA-146a(miR-146a)及信號轉導和轉錄激活因子5b (STAT5b)的表達水平及其臨床意義。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料 選取2017年1月至2020年12月在陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院治療的87 例變應性鼻炎患者納入觀察組。納入標準:(1)診斷符合《變應性鼻炎診斷和治療指南》中的標準[7];(2)年齡≥18 歲;(3)近1 個月內未使用抗過敏藥物或鼻部噴劑等藥物。排除標準:(1)伴有鼻息肉、鼻竇炎等其他鼻部疾??;(2)有肝腎功能障礙、惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)性疾病等其他嚴重疾??;(3)合并有結核、HIV 感染。同時選取在我院治療的鼻中隔偏曲患者80 例作為對照組。納入標準:(1)無鼻息肉、鼻竇炎及變應性癥狀;(2)變應原皮試無陽性反應,血清特異性IgE 陰性;(3)年齡≥18 歲。排除標準:(1)近1個月內接受過激素、抗組胺及免疫治療者;(2)合并有自身免疫性疾病、惡性腫瘤、肝腎功能障礙等其他疾病。兩組患者的一般資料比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性,見表1。本研究經我院倫理委員會批準,患者及家屬知情并簽署同意書。

    表1 兩組患者的一般資料比較

    1.2 觀察指標與檢測方法 (1)外周血單個核細胞的提?。悍謩e抽取兩組患者外周靜脈血4 mL進行抗凝。PBMCs 通過密度梯度離心,分離的乳白色PBMCs層加入1 mL PBS稀釋得到BMCs懸液。(2)采用PT-PCR 檢測PBMC 中miR-146a 表達:①BMCs 總RNA的提取:將兩組患者的PBMCs懸液使用Trizol法提取總RNA后加入35 μL RNase-free水在60℃水浴下5~10 min,使用核酸紫外分析儀檢測RNA 濃度,保證OD260/280為1.8~2.0,電泳檢測RNA含量。②逆轉錄合成反應體系:將兩組患者的PBMCs 中提取的總RNA 用RNase-free水稀釋至2 ng/μL的濃度。RNA模板2 μL,RT引物2 μL,5×RT緩沖液5 μL,dNTP(2.5 mm)2 μL,40 U/μL RNase Inhibitor 0.5 μL,20 U/μLRT 酶0.5 μL,ddH2O24 μL。以β-actin 為內參基因,cDNA 為模板進行逆轉錄。反應系統(tǒng):cDNA 2 μL,2×SYBR Green qPCR 混合物10 μL,正向引物1 μL,反向引物1 μL,焦碳酸二乙酯6 μL的二乙氧基碳酸氫鹽(DEPC)水,總反應量20 μL,重復3 次,反應條件:95℃10 min;95℃15 min;60℃1 min;40 循 環(huán),72℃30 s。 使 用qRT-PCR 儀擴增操作,使用2-ΔΔCT方法計算miR-146a表達的相對表達。(3)Western blot檢測STAT5b表達:將蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物加入到RIPA 緩沖液中,按照蛋白質提取程序提取PBMC 蛋白后,10%SDS-PAGE 電泳分離,電泳轉移至PVDF 膜,PVDF 膜封閉后一抗孵育:抗-STAT5b 和抗GAPDH,洗膜,然后二抗孵育2 h,洗膜,顯影分析結果。GAPDH 作為內參蛋白。

    1.3 鼻部癥狀評分[8]對流涕、噴嚏、鼻塞、眼癢和咽癢等癥狀進行評價,每項癥狀評分為0~3分,其中0分為無癥狀,1 分為癥狀較輕,2 分為癥狀明顯,且影響日?;顒?,3 分為癥狀嚴重,影響患者睡眠和日?;顒?。各項評分之和,≤6 分為輕度,>6 分為中重度患者。

    1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料首先行正態(tài)分布檢驗,符合正態(tài)分布則以均數(shù)±標準差(±s)表示,組間比較采用t檢驗,計數(shù)資料采用例(%)表示,組間比較采用χ2檢驗;采用Pearson 分析miR-146a、STAT5b 相對表達量與鼻部癥狀評分的相關性。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 兩組患者PBMC 中的miR-146a、STAT5b 表達水平比較 觀察組患者PBMC 中的miR-146a 和STAT5b相對表達量明顯低于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。

    表2 兩組患者PBMC中的miR-146a和STAT5b表達水平比較(±s)

    表2 兩組患者PBMC中的miR-146a和STAT5b表達水平比較(±s)

    組別觀察組對照組t值 P值例數(shù)8780 miR-146a 2.15±0.983.65±1.00-9.7850.001 STAT5b 0.58±0.181.53±0.34-22.8190.001

    2.2 不同臨床特征AR 患者的miR-146a 表達水平比較 觀察組中重度患者PBMC中miR-146a相對表達量明顯低于輕度患者,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而不同性別、年齡、體質量指數(shù)和變應原患者PBMC 中的miR-146a 比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表3。

    表3 不同臨床特征AR患者的miR-146a表達水平比較(±s)

    表3 不同臨床特征AR患者的miR-146a表達水平比較(±s)

    臨床資料性別男女年齡(歲)≤30>30體質量指數(shù)(kg/m2)<24≥24變應原混合真菌其他病情程度輕度中重度例數(shù)50375829553253343948 miR-146a相對表達量2.18±0.952.11±0.992.13±0.912.19±0.872.11±0.942.22±0.982.16±0.912.13±0.872.41±0.971.94±0.92 t值0.334-0.294-0.5180.1532.313 P值0.7390.7690.6060.8790.023

    2.3 不同臨床特征AR 患者的STAT5b 表達水平比較 觀察組中重度患者PBMC 中STAT5b 相對表達量明顯低于輕度患者,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而不同性別、年齡、體質量指數(shù)和變應原患者PBMC 中STAT5b 比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表4。

    表4 不同臨床特征AR患者的STAT5b表達水平比較(±s)

    表4 不同臨床特征AR患者的STAT5b表達水平比較(±s)

    臨床資料性別男女年齡(歲)≤30>30體質量指數(shù)(kg/m2)<24≥24變應原混合真菌其他病情程度輕度中重度例數(shù)50375829553253343948 STAT5b相對表達量0.60±0.140.55±0.160.56±0.160.62±0.140.56±0.130.61±0.160.59±0.120.56±0.130.79±0.200.41±0.16 t值1.55-1.716-1.5871.1019.848 P值0.1250.0900.1160.2740.001

    2.4 miR-146a、STAT5b 相對表達量與鼻部癥狀評分的相關性 觀察組患者PBMC 中miR-146a 和STAT5b 相對表達量與鼻部癥狀評分呈負相關(r=-0.544、-0.577,P<0.05),miR-146a 和STAT5b 呈正相關(r=0.645,P<0.05),見圖1。

    圖1 miR-146a、STAT5b相對表達量與鼻部癥狀評分的相關性

    3 討論

    變應性鼻炎全球發(fā)病率較高,患者癥狀為持續(xù)性鼻癢、打噴嚏、流鼻涕等,是哮喘發(fā)作的危險因素[9-10]。變應性鼻炎的治療方法主要是進行過敏原特異性免疫療法來有效恢復人體免疫力,但該方法的治療時間較長,可能出現(xiàn)全身性超敏反應[11-12]。隨著人們對變應性鼻炎疾病認識的加深,他們發(fā)現(xiàn)免疫失衡不足以解釋變應性鼻炎炎癥反應[13]。研究發(fā)現(xiàn),調節(jié)性T 細胞(regulatory T cell,Treg)數(shù)量的變化或功能喪失在過敏性疾病的發(fā)病機制中起著重要作用[14]。近年來,miRNA 的功能為AR發(fā)生機制和治療方法提供思路,其中miR-146 是Treg 細胞中表達量最高的miRNA 之一,其參與調節(jié)免疫系統(tǒng)和絲氨酸-蘇氨酸激酶(ROCK1),增加轉化細胞的轉移和侵襲[15]。

    JAK-STAT 與多種炎癥和自身免疫性疾病有關,受到激活時會發(fā)生酪氨酸磷酸化和二聚化,形成特殊的信號傳遞結構,向細胞核傳遞細胞因子信號,參與免疫調節(jié)和免疫細胞的產生[16]。先前的實驗表明,STAT5b 也在Treg 細胞中起著重要作用[17-18]。筆者認為miR-146a通過調節(jié)STAT5b 來參與AR的發(fā)生和發(fā)展。STAT5a 和5b 亞型具有高度同源性,但STAT5b的敲除會使Treg 細胞的功能維持受影響,而STAT5a則不會引起對細胞的影響[19],因此,本研究針對STAT5b進行研究。

    本研究結果顯示,觀察組外周血PBMC 中miR-146a 和STAT5b 相對表達量明顯低于對照組(P<0.05)。這與已有研究結果[20]一致,筆者猜測miR-146a調節(jié)STAT5b 的表達使Treg 分化,患者外周血Treg 細胞減少,影響患者免疫調節(jié)功能,導致變應性鼻炎的發(fā)生。miR-146a和STAT5b表達水平與變應性鼻炎的疾病活動度有關。本研究中,觀察組中重度患者外周血PBMC 中miR-146a 和STAT5b 相對表達量明顯低于 輕 度 患 者(P<0.05),進 一 步 驗 證miR-146a 和STAT5b 水平與患者病情密切相關。推測miR-146a可能通過調節(jié)STAT5b 信號級聯(lián)發(fā)揮負調節(jié)功能,參與外周血Treg 細胞的分化和功能維持在變應性鼻炎的發(fā)生發(fā)展中起重要調節(jié)作用。

    本研究通過相關性分析證明miR-146a 可以正向調控STAT5b的表達以影響Treg細胞的分化。然而,本研究不能證實miR-146a是否是級聯(lián)反應中STAT5b的表達和激活所必需的,還需要進一步對機制進行驗證。

    目前臨床中缺少外周血PBMC 中miR-146a 和STAT5b 的表達水平與變應性鼻炎病情嚴重程度之間的關系研究,本研究具有一定的創(chuàng)新性,證實在變應性鼻炎的發(fā)病過程中,免疫功能增強和炎性細胞因子激活起重要作用,STAT5b 可以調節(jié)外周血Treg 細胞的分化,為變應性鼻炎的臨床治療提供新思路和新靶點,具有一定的研究價值。但本研究缺少相應機制的研究,缺乏實驗結果的支持,存在一定的局限性,需要進一步探究。

    綜上所述,變應性鼻炎患者外周血PBMC 中miR-146a 含量和STAT5b 表達水平下調,與患者病情程度呈負相關,同時兩者間存在正相關關系。

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