補腎生血法治療慢性再障的臨床觀察及對ICAM-1表達的影響研究

王金環(huán)，谷夢宇，于孫婉琪，牛丁忍，孫岸弢，代月*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012；4.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053)

再生障礙性貧血(Aplastic anemia AA)[1]是一種骨髓衰竭性疾病，以外周血全血細胞減少以及骨髓有核細胞增生低下為特征，以貧血、感染、出血為主要臨床表現(xiàn)。近年來，AA的發(fā)病率逐年上升，其病勢纏綿，病情較重，給患者造成了巨大負擔(dān)，因此明確再障的發(fā)病機制，找到一條行之有效的治療方案，對于AA患者尤為重要[2]。眾所周知，AA的發(fā)病機制主要由3部分[3]所組成：種子學(xué)說、蟲子學(xué)說、土壤學(xué)說，即造血祖細胞功能異常；免疫機制的紊亂；造血微環(huán)境的異常。根據(jù)國內(nèi)外的最新研究表明，骨髓造血生態(tài)位(bone marrow hematopoietic niche,BMHN)的異常是AA發(fā)病的核心環(huán)節(jié)之一[4-5]，而作為骨髓造血生態(tài)位的核心環(huán)節(jié)之一，干細胞的黏附性則逐漸成為了一個新的研究熱點。

我們經(jīng)前期使用補髓生血顆粒治療慢性再障與整合素β1、β2家族黏附分子的研究，表明信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常與整合素β1、β2家族介導(dǎo)的相關(guān)離子通道與信號途徑異常密不可分，且可能與免疫超蛋白家族介導(dǎo)的信號通路與離子通道具有一定的聯(lián)系。而ICAM-1作為一免疫超蛋白家族的一員，是否與慢性再障的發(fā)病機制有著一定的聯(lián)系？這是本次研究需要探討的內(nèi)容，基于此，本研究從外周血的角度，探討使用補髓生血顆粒治療慢性再障與外周血ICAM-1表達水平的聯(lián)系，從而為慢性再障的發(fā)病機制以及用藥方向提供更多的思路與依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入55例2020年1月—2020年4月在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院病房及門診治療的，符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的CAA患者，其中腎陰虛型27例，腎陽虛型28例。腎陰虛型男17例，女10例，患者平均年齡為(41.04±9.27)歲，平均病程為(3.04±1.22)年；腎陽虛型男13例，女10例，患者平均年齡為(42.17±5.86)歲，平均病程為(2.61±0.89)年，兩組基礎(chǔ)資料比較無顯著差異(P>0.05)。同時選取20例健康志愿者作為對照組。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照張之南、沈悌等編寫的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》(第3版)[6]：①臨床表現(xiàn)為發(fā)病較急性再障緩慢，貧血、感染、出血癥狀相對較輕；②血常規(guī)檢查示血紅蛋白下降速度較慢，網(wǎng)織紅細胞、中性粒細胞及血小板減低，但未達到重型再障程度；③多部位骨髓穿刺顯示三系或兩系減少，至少一個部位增生不良。

1.2.2 中醫(yī)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照國家中醫(yī)藥管理局《血液病重點?？茀f(xié)作組慢性髓勞(慢性再生障礙性貧血)的中醫(yī)診療方案(2017版)》[7]：①癥狀：多有面色白、心悸氣短、頭暈乏力，脈沉細無力或沉細數(shù)；②慢性再生障礙性貧血病史。

1.2.3 中醫(yī)證候分型診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則(試行)》[8]：①腎陽虛型癥狀為心悸氣短，頭暈乏力，面色蒼白，口唇、指甲色淡，腰膝酸軟，畏寒等，或伴有輕微出血或無出血癥狀，小便清長，大便溏，舌淡，脈沉細無力或虛大；②腎陰虛癥狀為心煩，衄血，潮熱盜汗，面色蒼白，口唇、指甲色淡等，或伴有低熱，口渴引飲，小便黃，大便干結(jié)，苔薄，舌尖紅，脈細數(shù)。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合中醫(yī)、西醫(yī)臨床及中醫(yī)證候分型診斷標(biāo)準(zhǔn)者；②年齡在18～60歲；③發(fā)病后進行西醫(yī)治療6個月無意義者；④無心、腦、腎及其他系統(tǒng)嚴重損害者；⑤已簽署知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

①正處于妊娠、哺乳期；②對試驗藥物或組成成分過敏者；③患有精神疾病或智力缺陷者；④正在參與其他臨床試驗者；⑤合并其他血液系統(tǒng)嚴重疾病或其他惡性疾病者；⑥并發(fā)感染或大量失血。

1.5 脫落標(biāo)準(zhǔn)

①治療過程中并發(fā)嚴重不可控制的并發(fā)癥，如暈厥、休克等；②轉(zhuǎn)變?yōu)橹匦驮僬锨也豢煽刂普?；③未?guī)律服藥者。

1.6 治療方法

1.6.1 基礎(chǔ)治療

①免疫抑制；②促造血治療；③護肝治療。

1.6.2 補腎生血治療

治療組根據(jù)分型不同給與補髓生血顆粒Ⅰ、Ⅱ號方，腎陰虛型使用補髓生血顆粒Ⅰ號方(方含熟地黃20 g，仙靈脾 20 g，五味子20 g，黃芪40 g，紅參10 g，山萸肉15 g，枸杞子15 g，桑葚子15 g，補骨脂15 g，菟絲子15 g，女貞子15 g，雞血藤15 g)，腎陽虛型使用補髓生血顆粒Ⅱ號方(方含附子5 g，黃芪40 g，巴戟天15 g，補骨脂15 g，仙靈脾15 g，鹿茸15 g，紅參15 g，仙茅15 g，熟地黃15 g，山藥15 g，首烏15 g，枸杞子15 g，雞血藤15 g)。由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥廠制備成沖劑，每袋15 g，含生藥40 g，批準(zhǔn)文號：[黑衛(wèi)藥制字(1997)0048號]成人每次1袋，每日3次溫水沖服。服藥期間囑患者節(jié)飲食、適起居、免作勞，調(diào)情志。

1.6.3 支持治療

若患者治療期間(1)出現(xiàn)嚴重出血，輸注血小板懸液及相應(yīng)止血措施；(2)出現(xiàn)嚴重貧血，應(yīng)給予輸血治療；(3)出現(xiàn)嚴重感染，給予抗生素等相應(yīng)治療；(4)服藥期間盡量避免接種疫苗。

1.7 試驗方法和檢測指標(biāo)

1.7.1 試驗方法

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)雙抗夾心法檢測人外周血血清ICAM-1表達水平。

(1)標(biāo)本采集：囑治療組患者及健康志愿者空腹，清晨前往醫(yī)院，靜脈采血3 mL，置于真空采集管，室溫狀態(tài)下自然凝固10～20 min后，以2 500 r/min的頻率離心15 min獲得血清，吸取1～2 mL離心后血清置于離心管并放于低溫冰箱內(nèi)存貯。

(2)檢測流程：①設(shè)空白孔及樣品孔，空白孔不添加酶標(biāo)試劑②；在酶標(biāo)包被板上進行標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣；③封膜后于37 ℃環(huán)境下進行溫育，時間為30 min；④使用稀釋后的洗滌液洗滌5次；⑥再次加酶、溫育并洗滌；⑦加入顯色劑，避光顯色；⑧在450 nm的波長下使用酶標(biāo)儀測量吸光度，使用計算機進行數(shù)據(jù)處理與分析。

1.7.2 檢測指標(biāo)

對入組患者治療前后及志愿者外周血血清中的ICAM-1表達水平進行檢測。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS25.0軟件處理數(shù)據(jù)，若符合正態(tài)分布且為計量資料，采用t檢驗，組內(nèi)比較用配對t檢驗，組間比較用獨立樣本t檢驗，用χ2檢驗檢驗計數(shù)資料，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床療效

脫落后(脫落原因：未規(guī)律服藥)治療組患者共50例，其中臨床治愈6例，占12%；顯效21例，占42%；有效18例，占36%；無效5例，占10%，臨床總有效率為90%，提示使用補腎生血之補髓生血顆粒對慢性再障患者有較好的臨床療效。比較兩證型的臨床總療效Z值為-2.019(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示腎陽虛的臨床總療效優(yōu)于腎陰虛型，這與朱丹溪的“陽虛易治，陰虛難調(diào)”理論不謀而合，見表1。

表1 慢性再生障礙性貧血患者兩證型臨床總療效比較[例(%)]

2.2 中醫(yī)癥狀積分比較

治療組兩型患者治療后中醫(yī)證候總積分組內(nèi)比較Z值為-4.562和-4.217，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；腎陰虛型與腎陽虛型進行組間比較Z值為0.675，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明補髓生血顆粒可以改善慢性再障患者的中醫(yī)證候積分，且腎陽虛型優(yōu)于腎陰虛型，見表2。

表2 慢性再生障礙性貧血患者中醫(yī)證候總積分對比分)

2.3 外周血ICAM-1表達水平比較

使用LSD檢驗進行兩證型患者治療前ICAM-1的表達水平分析，P=0.927>0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；治療前治療組兩證型與健康對照組分別比較，P<0.001，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；治療后兩證型、兩證型與對照組相比較，P=0.032<0.05、P<0.001，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。提示補髓生血顆粒能改善慢性再障患者外周血黏附分子ICAM-1的表達水平，且腎陽虛型改善程度優(yōu)于腎陰虛型，可用于預(yù)測患者預(yù)后，見表3。

表3 慢性再生障礙性貧血患者兩證型治療前后外周血ICAM-1表達水平對比

3 討論

對于再障的治療方面，近年來西醫(yī)多采用造血干細胞移植、免疫抑制、促造血治療以及輸血等支持療法，但其副作用較大且較為昂貴，多不被患者所接受；而作為傳統(tǒng)文化的瑰寶，中醫(yī)傳統(tǒng)思想認為，髓為腎之所化，正如《內(nèi)經(jīng)》所云：“腎主骨生髓”，且“精血同源”，故現(xiàn)代中醫(yī)醫(yī)家們多將慢性再障之發(fā)病之根定位于腎，采用補腎生血法進行治療，并在補腎法的基礎(chǔ)上分支為不同流派。如團隊學(xué)術(shù)帶頭人孫偉正教授主張補腎生血養(yǎng)髓法，以腎為核心；高萍教授等[9]則主張采取補益脾腎之法治療再生障礙性貧血；梁冰教授等[10]強調(diào)除補益脾腎法之外，亦要重視補益肝腎；以上諸位醫(yī)家或從腎出發(fā)，或從脾腎出發(fā)，或從肝腎論治，無論哪種療法，均取得了并且取得了不錯的臨床療效[11]。故本研究僅選取腎虛型再障患者加以試驗研究。另一方面，補髓生血顆粒為團隊帶頭人孫偉正教授的有效經(jīng)驗方，孫教授團隊針對此藥物的前期試驗研究充足，已經(jīng)有效的證明了其有效性及科學(xué)性[12-14]，且設(shè)置健康對照組，有利于探析健康人與再障患者細胞間黏附分子表達水平的差異，從而進一步分析細胞間黏附分子與再生障礙性貧血發(fā)病機制之間的聯(lián)系，故本次課題研究采用健康對照組進行對照研究。

補髓生血顆粒是國家級名中醫(yī)孫偉正教授的有效經(jīng)驗方，本方以補腎填精養(yǎng)血為總體治療大法，以六味地黃湯為底方進行加減化裁。方中熟地黃為君，補腎填精；配合山萸肉為臣，增強補腎生血之功效，同時利用山萸肉收澀之特點行以固攝，從而使腎精補而不散；方中還添加鹿茸之血肉有情之品用于益精血、填筋骨；佐以人參、黃芪、枸杞等大補氣血，氣血雙補從而相互為用；值得一提的是，方中除補腎養(yǎng)血之底方外，還依據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)的進展添加了相關(guān)藥物，如調(diào)解機體免疫之豬苓[15-17]、白花蛇舌草[18]，升血小板與白細胞之雞血藤[19]，真正做到了中醫(yī)傳統(tǒng)文化與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的結(jié)合，從而古今并用顯奇效。

正如植物的茁壯生長依賴于肥沃的土地一樣，骨髓造血細胞的正常發(fā)育同樣也離不開一個好的造血微環(huán)境，而作為骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分，骨髓基質(zhì)細胞是由骨髓間充質(zhì)干細胞所組成的，骨髓間充質(zhì)干細胞又可分泌多種造血因子，為造血干細胞的正常增殖分化提供重要的營養(yǎng)支持。ICAM-1作為一種細胞間黏附分子，是細胞膜表面的糖蛋白，廣泛存在于造血與非造血組織中，其中在血管內(nèi)皮細胞膜表面的表達水平最高[20]。整合素LFA-1為ICAM-1的配體，在細胞黏附作用的發(fā)生過程中，配體與受體相互作用，調(diào)控骨髓基質(zhì)細胞與骨髓造血干細胞之間的黏附性，從而起到調(diào)控造血干細胞遷移與黏附的作用[21]，控制著整個造血生態(tài)位中的穩(wěn)定與平衡。此外，有研究表明，抗ICAM-1抗體能破壞造血干細胞在骨髓基質(zhì)細胞上聚集成堆，影響造血干細胞的歸巢[22]。綜上可見，ICAM-1可以介導(dǎo)造血干細胞歸巢[23]，并可有效增強骨髓間充質(zhì)干細胞與骨髓造血干細胞之間的黏附性，是骨髓造血生態(tài)位的調(diào)節(jié)因子[24]。本次使用補髓生血顆粒治療慢性再障的外周血ICAM-1表達水平對比發(fā)現(xiàn)，治療組治療前后相比，患者治療后的ICAM-1表達水平明顯低于治療前；治療前治療組與對照組相比，慢性再障患者ICAM-1的表達水平明顯低于健康志愿者；治療后治療組與對照組相比，慢性再障患者ICAM-1的表達水平仍然低于健康志愿者。提示慢性再障患者的外周血ICAM-1表達水平低于正常人，使用補腎生血法之補髓生血顆粒治療慢性再障，能夠有效地提高其外周血ICAM-1表達水平，具有較好療效。

綜上所述，使用補髓生血顆粒治療慢性再障能改善其臨床癥狀，提升外周血血象，增強外周血ICAM-1表達水平，且陽虛型療效優(yōu)于陰虛型，可用于預(yù)測慢性再障患者的預(yù)后。補髓生血顆粒在提升外周血ICAM-1表達水平治療慢性再障上，可能是以下兩種機制：(1)通過增強骨髓間充質(zhì)干細胞與骨髓造血干細胞黏附性，介導(dǎo)造血干細胞歸巢等方面來改善骨髓造血生態(tài)位；(2)通過促進黏附分子的表達，從而促使骨髓間充質(zhì)干細胞分泌更多的造血因子，糾正骨髓造血。提示慢性再障的發(fā)病機制可能與外周血ICAM-1的異常表達相關(guān)，糾正異常表達的黏附分子，這可能是慢性再障的一種新型治療思路。