地黃飲子對APP/PS1小鼠工作記憶及海馬超微結構影響的研究

李全，張健，王琪，周妍妍*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)即老年性癡呆，是一種以認知功能障礙進行性加重為臨床表現(xiàn)的退行性神經(jīng)病[1-2]，其病理改變主要以β-淀粉樣蛋白(amyloid-β, Aβ)沉積、Tau蛋白過度磷酸化所導致的神經(jīng)纖維纏結(neurofibrillary tangle，NFT)為特征[3]。中醫(yī)認為腎精虧虛、痰蒙腦竅是AD的基本病機，地黃飲子出自《黃帝素問·宣明論方》，有補腎、化痰、開竅之功用，現(xiàn)代臨床、實驗研究發(fā)現(xiàn)地黃飲子防治神經(jīng)退行性疾病有著顯著的療效[4]。課題組前期實驗研究證實地黃飲子APP/PS1雙轉基因癡呆小鼠具有提高學習記憶能力、抑制氧化應激[5]及神經(jīng)炎癥等作用[6]，為進一步探討地黃飲子對APP/PS1雙轉基因癡呆小鼠工作記憶及海馬超微結構的影響，故而進行了本次實驗研究。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

選取6月齡的雄性APP swe/PS1dE9雙轉基因癡呆小鼠60只，體質量(25±4)g，同月齡同背景的陰性小鼠30只，體質量(23±5)g，購自常州卡文斯實驗動物有限公司(江蘇)，編號：SCXK(蘇)2016-0010，于室溫(22±3)℃、相對濕度(45±5)%的SPF級實驗動物飼養(yǎng)室中適應性飼養(yǎng)，自由飲食、自由飲水。

1.2 實驗藥物

地黃飲子藥物組成：熟地黃、山茱萸、肉蓯蓉、石斛、麥冬、五味子、石菖蒲、遠志、茯苓、肉桂、炮附子和巴戟天各20 g，生姜、大棗、薄荷各5 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院提供，將上述飲片浸泡1 h、煎煮1 h后濾出藥液,再次加水煎煮1 h，將2次藥液混合分裝, 4 ℃冷藏備用。

1.3 主要實驗試劑及設備

多聚甲醛、戊二醛(北京雷根)；鹽酸戊巴比妥鈉(上海斯信)；甲苯胺藍(美國SIGMA)。Y迷宮、Su-P erMaze行為學測試軟件(上海欣軟)；透射電鏡(日本HITACHI)；倒置光學顯微鏡(日本NIKON)；超薄切片機(德國LEICA)。

2 實驗方法

2.1 動物分組及給藥

2.2 Y迷宮實驗

Y迷宮行為學測試于實驗第1、2、3個月地黃飲子或蒸餾水灌胃結束后進行。正式實驗開始前進行適應性訓練，將小鼠放入迷宮中央?yún)^(qū)任其自由活動8 min，每只小鼠活動結束后用75%消毒酒精噴撒宮臂以消除小鼠氣味，適應周期為1 d。正式實驗時，將小鼠頭部朝向起始臂末端擋板，將其放入起始臂自由探索8 min，同時記錄進臂總次數(shù)；計算小鼠正確自發(fā)交替率，小鼠身體完全進入宮臂記為有效進臂次數(shù)，每3次進入不同的宮臂則記為一次正確的自發(fā)交替，自發(fā)交替率=[正確進臂次數(shù)/(總進臂次數(shù)-2)]×100%，試驗周期為1 d[7]。

2.3 透射電鏡檢測

透射電鏡檢測于行為學實驗結束后進行，從各實驗月份的空白組、模型組、地黃組隨機選取3只小鼠，以1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，以4%多聚甲醛(pH=7.4)、生理鹽水心臟灌流至肝臟變?yōu)榘咨?，斷頭取腦并依照腦立體定位圖譜剝離海馬后放入2.5%戊二醛中下固定2 h，將海馬組織樣本修飾成1 mm3小塊，丙酮梯度脫水、包埋、半薄切片處理后甲苯胺藍染色，倒置光鏡定位后制作超薄切片,經(jīng)醋酸雙氧鈾、枸椽酸鉛雙染色[8]，透射電鏡1 200～4 000倍觀察小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞超微結構并抓拍照片。

2.4 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件將所得數(shù)據(jù)處理分析，數(shù)據(jù)結果以均數(shù)±標準誤表示，對實驗所得數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 地黃飲子對APP/PS1小鼠自發(fā)交替率的影響

3.1.1 實驗第1個月地黃飲子對APP/PS1小鼠自發(fā)交替率的影響

實驗第1個月的各組小鼠進臂總次數(shù)無差異，不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與B1組相比，M1組小鼠正確自發(fā)交替率顯著降低，具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與M1組相比，D1組小鼠正確自發(fā)交替率顯著提高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 給藥1個月Y迷宮測試結果比較

3.1.2 實驗第2個月地黃飲子對APP/PS1小鼠自發(fā)交替率的影響

實驗第2個月的各組小鼠進臂總次數(shù)無明顯差異，不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與B2組相比，M2組小鼠正確自發(fā)交替率顯著降低，具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與M2組相比，D2組小鼠正確自發(fā)交替率顯著提高，具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 給藥2個月Y迷宮測試結果比較

3.1.3 實驗第3個月地黃飲子對APP/PS1小鼠自發(fā)交替率的影響

應做到真正合理有效的利用現(xiàn)有的資源，結合水利信息工程建設自身的特點，有針對性地制訂與其相關的標準，逐步實現(xiàn)水利信息化建設的標準。

實驗第3個月的各組小鼠進臂總次數(shù)無明顯差異，不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與B3組相比，M3組小鼠正確自發(fā)交替率顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與M3組相比，D3組小鼠正確自發(fā)交替率顯著提高，具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表3。

此外，M3組與M1組小鼠相比正確自發(fā)交替率顯著降低，具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，M3組與M2組小鼠相比正確自發(fā)交替率顯著降低，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而各給藥月份地黃組小鼠正確自發(fā)交替率無明顯差異，不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 給藥3個月Y迷宮測試結果比較

3.2 地黃飲子對APP/PS1雙轉基因小鼠不同時期病理特征的影響

3.2.1 實驗1個月地黃飲子對APP/PS1小鼠病理特征的影響

鏡下觀察B1組小鼠海馬CA1區(qū)可見神經(jīng)細胞數(shù)目較多、結構完整、分布密集，見圖1A。與B1組相比，M1組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞結構相對完整，但內(nèi)質網(wǎng)減少且伴有不同程度的擴張，線粒體腫脹，線粒體嵴呈畸形樣改變，鏡下觀察細胞電子密度不均，散見少量的溶酶體與脂褐素，見圖1B。與M1組相比，D1組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞結構完整，線粒體輕度腫脹，結構相對完整，形態(tài)較為規(guī)則，見圖1C。

3.2.2 實驗2個月地黃飲子對APP/PS1小鼠病理特征的影響

至實驗第2個月，B2組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞器結構完整，見圖1D。M2組與B2組相比小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞染色質邊集，可見細胞凋亡現(xiàn)象，見圖1E。而地黃飲子組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞數(shù)量較多且分布密集，結構完整，可見少數(shù)脂褐素，見圖1F。

3.2.3 實驗3個月地黃飲子對APP/PS1小鼠病理特征的影響

至實驗第3個月，B3組小鼠海馬CA1區(qū)少數(shù)線粒體輕度腫脹，鏡下可見散在少量溶酶體，見圖1G。與B3組相比，M3組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞破裂、分散，細胞固化萎縮后可見凋亡小體，內(nèi)質網(wǎng)減少且伴有不同程度的擴張，線粒體腫脹、破裂，溶酶體與脂褐素并見，見圖1H。而D3組小鼠CA1區(qū)線粒體形態(tài)結構規(guī)則，與空白組神經(jīng)元細胞鏡下形態(tài)已較為接近，見圖1I。

圖1 各實驗月份各組小鼠海馬CA1區(qū)超微結構

4 討論

AD是一種起病隱匿并且呈進行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，AD病在中醫(yī)上被歸為“癡呆”“呆癥”范疇，腎精虧虛，痰蒙腦竅是其基本病機，經(jīng)典名方地黃飲子在方劑學中被歸為陰陽雙補之劑[9]，具有補腎、化痰、開竅之功效，符合AD的中醫(yī)發(fā)病機制，無論是古代醫(yī)家還是現(xiàn)代醫(yī)家運用地黃飲子防治老年性癡呆都有著顯著療效，故本實驗選用地黃飲子探討其對APP/PS1雙轉基因癡呆小鼠工作記憶及海馬超微結構的影響。

通過對Y迷宮實驗結果的分析發(fā)現(xiàn)，各實驗月份的各組小鼠的進臂總次數(shù)并無明顯差異(P>0.05)，說明小鼠視力及運動能力正常，排除體力及視力對小鼠探索迷宮的影響。隨著實驗月份的增加，模型組APP/PS1小鼠自發(fā)交替率逐漸降低，尤其是M3組與M1、M2組相比，APP/PS1小鼠工作記憶能力顯著降低；而經(jīng)地黃飲子干預的APP/PS1小鼠自發(fā)交替率逐漸上升，這表明地黃飲子能夠提高APP/PS1小鼠的工作記憶能力，并且隨著給藥時間的增加呈逐漸上升的趨勢。

本課題組基于前期HE染色、尼氏染色、免疫熒光染色等實驗[10]，探討了光鏡下APP/PS1小鼠海馬區(qū)的病理改變，為進一步觀察APP/PS1小鼠海馬區(qū)的超微結構改變，本實驗采用了透射電鏡呈像技術。經(jīng)透射電鏡鏡下觀察顯示，隨著實驗月份的增加，模型組小鼠海馬CA1區(qū)線粒體逐漸發(fā)生腫脹、變形、破裂，神經(jīng)細胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，并隨著小鼠月齡的增加凋亡小體逐漸增多；而經(jīng)地黃飲子干預的APP/PS1小鼠海馬CA1區(qū)線粒體只是輕度腫脹，同時神經(jīng)細胞也未發(fā)生凋亡現(xiàn)象，并且隨著給藥時間的增加神經(jīng)細胞形態(tài)結構已與空白組相接近。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)在B3組小鼠海馬CA1區(qū)線粒體出現(xiàn)了輕度的腫脹、變形的改變，這表明即使是陰性空白組小鼠也會隨著月齡的增長線粒體結構出現(xiàn)改變，而地黃飲子能夠顯著保護神經(jīng)細胞，抑制細胞的凋亡，改善線粒體形態(tài)結構，這與課題組既往研究[11]的地黃飲子含藥腦脊液可減輕細胞的受損程度，提高細胞活力，抑制細胞凋亡的實驗結果相符。

綜上，各實驗月份的各組小鼠的病理學改變與行為學改變相一致，APP/PS1小鼠隨著月齡增加工作記憶能力呈進行性下降，線粒體發(fā)生腫脹變形，并且至小鼠9月齡時出現(xiàn)大量的凋亡小體；地黃飲子可改善APP/PS1小鼠隨月齡增長而下降的工作記憶能力，并抑制神經(jīng)細胞凋亡，改善線粒體形態(tài)結構。