血清let- 7 a水平對(duì)喉癌手術(shù)患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

陳皓，張珂，李紅娟

安陽(yáng)市第六人民醫(yī)院耳鼻喉科，河南 安陽(yáng) 455000

喉癌是指發(fā)生于喉部上皮的惡性腫瘤，其早期臨床表現(xiàn)為聲音沙啞、咽喉異物感、血痰等[1]。喉癌約占全身惡性腫瘤的8.0%，手術(shù)是喉癌直接而有效的治療方法，雖然近年來(lái)手術(shù)聯(lián)合放療、化療和生物治療等綜合治療方法使喉癌患者的近期預(yù)后有所改善，但其遠(yuǎn)期生存率并未獲得有效提高[2]。研究顯示，喉癌手術(shù)患者的3年生存率為71.79%，5年生存率僅為57.69%，一旦出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其生存率將會(huì)大大下降[3]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類內(nèi)源性小分子非編碼RNA，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[4]。let-7a作為miRNA中的重要一員，可與原癌基因ras、高遷移率族蛋白A2、c-myc的3'末端非翻譯區(qū)相結(jié)合，抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過(guò)程[5]。研究發(fā)現(xiàn)，let-7a水平在肝癌、口腔癌和食管癌等惡性腫瘤組織中均顯著降低[6-8]。也有研究顯示，喉癌患者血清let-7a水平顯著下調(diào)，且let-7a水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，表明let-7a有助于喉癌的早期診斷和術(shù)后病情監(jiān)測(cè)[9]。但是有關(guān)血清let-7a水平對(duì)喉癌手術(shù)患者預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)分析85例喉癌手術(shù)患者的臨床資料，旨在探討血清let-7a水平對(duì)喉癌手術(shù)患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年6月至2017年6月于安陽(yáng)市第六人民醫(yī)院接受手術(shù)治療的喉癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)后病理檢查確診為喉癌；②術(shù)前未接受放療、化療及免疫治療；③隨訪3年或術(shù)后3年內(nèi)因喉癌進(jìn)展而死亡；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②具有風(fēng)濕免疫相關(guān)疾病病史；③未按照醫(yī)囑正規(guī)治療或因復(fù)發(fā)而再次手術(shù)。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入85例患者。其中，男48例，女37例；年齡35～80歲，平均（54.50±7.61）歲；根據(jù)第8版國(guó)際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control，UICC）TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行分期[10]：Ⅰ期25例，Ⅱ期37例，Ⅲ期16例，Ⅳ期7例。根據(jù)術(shù)后3年內(nèi)是否死亡將患者分為死亡組（n=21）和生存組（n=64）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，所有患者均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 資料收集及l(fā)et- 7 a水平檢測(cè)

收集患者的性別、年齡、腫瘤類型、分化程度、T分期及TNM分期等臨床資料。采用無(wú)RNA酶的離心管收集患者的血液樣本5 ml，3000 r/min離心10 min，靜置0.5～1.0 h待樣本全部凝固。吸取1.5 ml上清液置于新的無(wú)RNA酶的離心管中，-80℃保存待檢，所有標(biāo)本均在2個(gè)月內(nèi)完成檢測(cè)。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測(cè)血清let-7a水平。按照Trizol試劑盒（購(gòu)自上海名勁生物科技有限公司）說(shuō)明書(shū)提取總RNA，并采用Super-Script?Ⅲ試劑盒（購(gòu)自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司）將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用qRT-PCR MasterMix試劑盒（購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司）及SYBR GreenⅠ染料（購(gòu)自廈門(mén)致善生物科技有限公司）進(jìn)行qRT-PCR，檢測(cè)血清let-7a水平。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，50℃復(fù)性15 s，75℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參基因，let-7a引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)結(jié)束后收集并整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，分析 Ct值，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算 let-7a相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Logistic回歸模型進(jìn)行多因素分析；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析let-7a水平對(duì)喉癌手術(shù)患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 喉癌手術(shù)患者預(yù)后影響因素的單因素分析

隨訪3年內(nèi)，共21例（24.71%）患者死亡。死亡組和生存組患者的性別、年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。死亡組和生存組患者的腫瘤類型、分化程度、T分期、TNM分期及l(fā)et-7a水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 喉癌手術(shù)患者預(yù)后影響因素的單因素分析

2.2 喉癌手術(shù)患者預(yù)后影響因素的多因素Logistic回歸分析

以單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素作為自變量，以喉癌手術(shù)患者預(yù)后作為因變量進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，腫瘤類型、分化程度、T分期、TNM分期及l(fā)et-7a水平均是喉癌手術(shù)患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素（P＜0.05）。（表2）

表2 喉癌手術(shù)患者預(yù)后影響因素的多因素Logistic回歸分析（ n=85）

2.3 let- 7 a對(duì)喉癌手術(shù)患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清let-7a水平預(yù)測(cè)喉癌手術(shù)患者預(yù)后的曲線下面積為0.923，截?cái)嘀禐?.66，靈敏度為85.70%，特異度為84.40%。（圖1）

圖1 let- 7 a預(yù)測(cè)喉癌手術(shù)患者預(yù)后的ROC曲線

3 討論

喉癌是咽喉部常見(jiàn)的惡性腫瘤，其早期可表現(xiàn)為聲音嘶啞、喉部異物感、咯血等[11]。在中國(guó)，喉癌約占全身腫瘤的5%，約占頭頸部腫瘤的20%[12]。全球統(tǒng)計(jì)資料表明，近年來(lái)喉癌的發(fā)病率呈大幅度上升趨勢(shì)[13]。本研究對(duì)納入的85例喉癌患者隨訪3年，其中21例患者死亡，死亡率為24.71%，提示喉癌患者術(shù)后的死亡風(fēng)險(xiǎn)較大。研究發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是喉癌患者術(shù)后生存的高危因素[14-15]。因此，尋找合適的標(biāo)志物預(yù)測(cè)喉癌手術(shù)患者預(yù)后具有重要意義。

miRNA是一類長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，廣泛存在于從病毒到人類的各種真核生物中。研究顯示，人類大部分惡性腫瘤如胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌等均具有miRNA異常表型，miRNA在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡及腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[16-18]。據(jù)報(bào)道，外周血miRNA水平具有腫瘤相關(guān)性及組織特異性，使miRNA作為惡性腫瘤早期診斷與預(yù)后判斷的血清標(biāo)志物成為可能[19]。let-7a是第二個(gè)被鑒定出的miRNA，是miRNA家族中研究最多且較為重要的成員之一。let-7a轉(zhuǎn)錄的抑癌miRNA與原癌基因Ras、c-myc的mRNA遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，從而抑制Ras、c-myc的表達(dá)，也可靶向抑制高遷移率族蛋白A2的表達(dá)，從而抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[20]。報(bào)道顯示，在喉癌、肝癌、宮頸癌等諸多惡性腫瘤中均存在let-7a表達(dá)明顯下調(diào)的現(xiàn)象。馬麗娟等[9]研究指出，喉癌組織中l(wèi)et-7a水平明顯下調(diào)，且與腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。周恩等[21]研究指出，let-7a能夠抑制喉癌細(xì)胞增殖，并加速其凋亡，喉癌患者的血清let-7a水平較低，且let-7a水平與喉癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，let-7a有助于術(shù)后病情監(jiān)測(cè)。許文景等[22]研究顯示，肝細(xì)胞癌患者血清和肝癌組織中l(wèi)et-7a呈異常低水平表達(dá)，且肝癌組織中l(wèi)et-7a水平遠(yuǎn)低于癌旁組織。武燕和王?；╗23]的研究指出，宮頸癌患者的血清let-7a呈低表達(dá)。本研究中，死亡組患者的let-7a水平明顯低于生存組（P＜0.01），與上述研究報(bào)道的結(jié)果一致。也有研究發(fā)現(xiàn)，let-7a與乳腺癌[24]、肝細(xì)胞癌[25]、卵巢癌[26]等患者的預(yù)后有關(guān)。但血清let-7a水平能否用于預(yù)測(cè)喉癌手術(shù)患者的預(yù)后尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究進(jìn)一步進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，腫瘤類型、分化程度、T分期、TNM分期及l(fā)et-7a水平均是喉癌手術(shù)患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素（P＜0.05）。ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清let-7a水平預(yù)測(cè)喉癌手術(shù)患者預(yù)后的曲線下面積為0.923，截?cái)嘀禐?.66，靈敏度為85.70%，特異度為84.40%，表明let-7a對(duì)喉癌手術(shù)患者預(yù)后具有重要的預(yù)測(cè)價(jià)值。綜上所述，let-7a是喉癌手術(shù)患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，對(duì)預(yù)測(cè)喉癌手術(shù)患者預(yù)后具有重要意義。但本研究也存在不足，首先，本研究屬于單中心回顧性研究，僅對(duì)患者入院時(shí)的血清let-7a水平進(jìn)行了檢測(cè)，未動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)其水平變化；其次，本研究樣本量較小，仍需大規(guī)模多中心研究加以驗(yàn)證。