網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接分析槲皮素治療肝癌的分子機(jī)制△

秦中強(qiáng)，談燚，張?zhí)m，譚玉林#

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院1介入科，2肝膽外科，安徽 蚌埠 233000

肝癌發(fā)病率居全球第六位，病死率居第四位，每年新發(fā)肝癌約84.1萬例，病死約78.2萬例[1]，給社會(huì)和家庭帶來了巨大負(fù)擔(dān)。手術(shù)切除仍是早期肝癌患者的首選治療方案，但由于各種原因，肝癌切除術(shù)后患者的5年復(fù)發(fā)率高達(dá)70%[2]。目前，尚沒有明確的輔助療法可供患者預(yù)防或減少術(shù)后轉(zhuǎn)移和新發(fā)腫瘤風(fēng)險(xiǎn)，肝癌切除術(shù)后患者的預(yù)后仍不理想。此外，肝癌患者在接受手術(shù)切除后，應(yīng)激反應(yīng)和相關(guān)免疫抑制機(jī)制被激活，可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[3]。因此，尋找新的藥物延緩肝癌的發(fā)生發(fā)展、減少術(shù)后轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)是臨床研究的重點(diǎn)。

多酚類黃酮被廣泛認(rèn)為是天然的、無毒的化學(xué)預(yù)防劑，這些多酚類物質(zhì)多具有顯著的抗氧化、抗炎和抗腫瘤特性。槲皮素作為這些多酚類黃酮的主要代表，存在于水果、飲料和蔬菜中[4-5]，表現(xiàn)出卓越的抗氧化和抗腫瘤潛力[6]，從而吸引了相關(guān)研究者的注意。研究顯示，槲皮素在抑制肝癌細(xì)胞的氧化應(yīng)激、轉(zhuǎn)移和促進(jìn)凋亡等過程中發(fā)揮了一定的作用[7-8]。因此，肝癌治療過程中，槲皮素通過哪些具體的通路抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展值得進(jìn)一步研究。目前，在藥物和疾病間具體通路機(jī)制的研究中，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一種新型的研究方法發(fā)揮了重要的作用。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接技術(shù)，探討槲皮素治療肝癌的核心基因和具體的分子機(jī)制，以期為基礎(chǔ)研究、臨床藥物研發(fā)提供新思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 槲皮素靶點(diǎn)的獲取

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP）（http://tcmspw.com/）和 PharmMapper數(shù)據(jù)庫（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/），以“quercetin”為關(guān)鍵詞檢索槲皮素的作用靶點(diǎn)，靶點(diǎn)種類設(shè)定為human protein，其他默認(rèn)[9-10]。檢索日期截至2021年6月1日。

1.2 肝癌相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

通過CTD數(shù)據(jù)庫（http://ctdbase.org）和Gene-Cards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/），以“l(fā)iver cancer”為關(guān)鍵詞檢索相關(guān)基因[11-12]。將檢索到的肝癌相關(guān)靶點(diǎn)合并，剔除重復(fù)項(xiàng)，獲得肝癌相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 槲皮素與肝癌交集靶點(diǎn)蛋白質(zhì)互作（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將通過篩選的相關(guān)靶點(diǎn)上傳至在線韋恩圖（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），得到槲皮素與肝癌的交集基因，并將其導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/cgi/input.pl）[13]，構(gòu)建蛋白質(zhì)之間的PPI網(wǎng)絡(luò)。交集基因?qū)隤ather數(shù)據(jù)庫得到交集靶點(diǎn)功能分類，將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件（http://www.cytoscape.org/）進(jìn)行調(diào)整，并利用CytoHubba插件得到關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 GO、KEGG分析和槲皮素-主要通路-肝癌網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為進(jìn)一步了解交集基因的功能及其在信號通路中作用，使用R語言包對交集基因進(jìn)行基因本位（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析，同時(shí)構(gòu)建槲皮素-主要通路-肝癌核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.5 槲皮素與肝癌分子對接

將已知的肝癌關(guān)鍵靶點(diǎn)與槲皮素進(jìn)行分子對接，得到對接親和力以反映其穩(wěn)定性。通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank，PDB）下載肝癌的核心蛋白分子結(jié)構(gòu)，PubChem數(shù)據(jù)庫下載槲皮素的結(jié)構(gòu)，將蛋白和槲皮素結(jié)構(gòu)導(dǎo)入PyMol 2.4.0和Auto Dock Tools軟件處理后，進(jìn)行分子對接，采用PyMol 2.4.0軟件進(jìn)行可視化分析[14-15]。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素潛在靶點(diǎn)信息

通過TCMSP、PharmMapper數(shù)據(jù)庫最終得到槲皮素的潛在靶點(diǎn)共380個(gè)，將靶點(diǎn)名稱上傳至UniProt數(shù)據(jù)庫并校正靶點(diǎn)名稱，剔除得分較低的靶點(diǎn)，最終得到361個(gè)靶點(diǎn)。

2.2 肝癌相關(guān)靶點(diǎn)信息

通過CTD、GeneCards數(shù)據(jù)庫共篩選出50 459個(gè)基因，其中CTD數(shù)據(jù)庫33 725個(gè)，GeneCards數(shù)據(jù)庫16 734個(gè)，通過篩查剔除CTD和GeneCards中關(guān)聯(lián)得分較小的基因，分別篩選出631、524個(gè)關(guān)聯(lián)得分較高的基因，將其合并剔除重復(fù)基因，得到995個(gè)高分靶點(diǎn)。

2.3 槲皮素-肝癌的交集靶點(diǎn)信息

將槲皮素潛在靶點(diǎn)信息與肝癌高分靶點(diǎn)取交集，得到槲皮素中與肝癌相關(guān)的127個(gè)作用靶點(diǎn)基因，包括TP53、caspase 8、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、轉(zhuǎn)甲狀腺素（transthyretin，TTR）、促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等。通過Panther數(shù)據(jù)庫將槲皮素治療肝癌的127個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)分為7類，主要功能包括催化活性（38.5%）、結(jié)合（36.2%）、分子功能調(diào)節(jié)（17.8%）等。

2.4 槲皮素治療肝癌相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，得到PPI網(wǎng)絡(luò)，將其導(dǎo)入Cytoscape進(jìn)行可視化分析，網(wǎng)絡(luò)中共127個(gè)節(jié)點(diǎn)，2512條邊，利用CytoHubba插件得到排名前10的肝癌治療相關(guān)核心靶點(diǎn)分別為TP53、蛋白激酶 1（threonine kinase 1，AKT1）、myc、caspase 3、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、AP-1轉(zhuǎn)錄因子亞單位（AP-1 transcription factor subunit，JUN）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、MAPK8、EGFR和MAPK1。（圖1）

圖1 槲皮素治療肝癌相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO功能分析結(jié)果

槲皮素治療肝癌的GO功能結(jié)果顯示，生物過程主要集中在腺體發(fā)育、凋亡信號通路調(diào)控和脂多糖應(yīng)答等；細(xì)胞組成主要集中在膜筏、膜微區(qū)和膜區(qū)等；分子功能主要集中在DNA-轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ-特異性DNA轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等。（圖2）

圖2 GO功能分析結(jié)果

2.6 KEGG通路富集分析結(jié)果

KEGG通路富集篩選結(jié)果共173個(gè)富集項(xiàng)，其中前30個(gè)最具有顯著性的通路見圖3，其中脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號通路、乙型肝炎、腫瘤中的蛋白多糖和MAPK信號通路等均可能為重要的通路。

圖3 KEGG通路富集分析結(jié)果

2.7 分子對接分析

將槲皮素與肝癌關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，平均對接親和力為-6.58 kcal/mol，對接親和力絕對值越大結(jié)合越穩(wěn)定，表明槲皮素與肝癌核心靶點(diǎn)有較強(qiáng)的結(jié)合力。（表1）

表1 槲皮素與肝癌治療相關(guān)靶點(diǎn)的對接結(jié)果

3 討論

肝癌以臟腑氣血虧虛為本，氣、血、濕、熱、瘀、毒互結(jié)為標(biāo)，蘊(yùn)結(jié)于肝，漸成癥積，肝失疏泄為基本病機(jī)。Hisaka等[16]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素具有抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用。已有研究表明，槲皮素可通過阻斷caspase/Cyto-c通路和阻斷AKT/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2信號通路的表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡[17]。

本研究結(jié)果顯示，槲皮素可能通過127個(gè)靶點(diǎn)治療肝癌，通過Panther數(shù)據(jù)庫分析后發(fā)現(xiàn)交集靶點(diǎn)主功能主要集中于催化活性、結(jié)合和分子功能調(diào)節(jié)。經(jīng)過PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)為TP53、AKT1、myc、caspase 3和VEGFA等，其中TP53可根據(jù)生理環(huán)境和細(xì)胞類型誘導(dǎo)細(xì)胞生長停滯或凋亡。Mao等[18]研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷通過調(diào)節(jié)p53基因引導(dǎo)細(xì)胞凋亡、自噬和DNA損傷，對體外和體內(nèi)的肝癌表現(xiàn)出強(qiáng)大的作用。AKT1是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶中的一種，主要參與細(xì)胞代謝、增殖和凋亡等過程。異常的AKT1在糖尿病、心血管疾病和各種腫瘤中有激活作用[19]。myc可抑制前列腺素E2受體的表達(dá)，進(jìn)一步阻斷EP4R/c-myc通路的表達(dá)，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移[20]。caspase 3主要在凋亡早期及凋亡晚期中發(fā)揮作用，國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，靶向藥物聯(lián)合caspase 3可進(jìn)一步抑制肝癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡[21]。VEGFA具有促進(jìn)增殖、遷移并抑制細(xì)胞凋亡的作用，抑制VEGFA的表達(dá)進(jìn)一步減少肝癌細(xì)胞的侵襲、增殖和遷移[22]。本研究通過分子對接發(fā)現(xiàn)，槲皮素與上述肝癌治療關(guān)鍵靶點(diǎn)具有良好的結(jié)合力。

KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，槲皮素治療肝癌主要通路集中于脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、PI3K/AKT信號通路、乙型肝炎、腫瘤中的蛋白多糖和MAPK信號通路等。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-1271-5p通過靶向蛋白抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲過程，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，體外減輕乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染，并在體內(nèi)抑制腫瘤生長[22]。Rahmani等[23]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌患者中PI3K/AKT通路的激活與肝癌細(xì)胞的生長有關(guān)。汪丹丹等[24]發(fā)現(xiàn)，通過藥物激活肝癌細(xì)胞中的PI3K/AKT通路，可抑制肝癌細(xì)胞的凋亡、遷移和增殖等過程。MAPK信號通路的主要作用為調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化和凋亡[25]。肝癌發(fā)生發(fā)展過程中，MAPK通路主要參與細(xì)胞增殖、遷移與凋亡。通過miRNA-127轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞可阻斷MAPK通路的表達(dá)，明顯抑制肝癌細(xì)胞的體內(nèi)體外增殖、遷移并促進(jìn)其凋亡。槲皮素參與治療腫瘤的重要通路包括蛋白多糖、MAPK信號通路和PI3K/AKT信號通路。GO分析中，生物過程主要集中在腺體發(fā)育、凋亡信號通路的調(diào)控、對脂多糖應(yīng)答等，與上述通路介導(dǎo)的生物學(xué)過程相符合。

綜上所述，槲皮素治療肝癌的核心靶點(diǎn)為TP53、AKT1、myc、caspase 3、VEGFA等。GO 分析生物過程主要集中于腺體發(fā)育、凋亡信號通路的調(diào)控等；KEGG分析主要治療通路集中于脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、PI3K/AKT信號通路、乙型肝炎、腫瘤中的蛋白多糖和MAPK信號通路。分子對接提示，槲皮素與肝癌治療核心靶點(diǎn)均有較好的結(jié)合能。以期為臨床上治療肝癌以及基礎(chǔ)研究提供了新的治療藥物和研究方向。