Dysbindin轉(zhuǎn)基因小鼠心肌肥厚模型中基因變化

蔣珍妮 朱國能 王迎超 趙文勝

心肌肥厚是高血壓、心肌病、心肌梗死等眾多心血管疾病共同經(jīng)歷的病理過程，是心力衰竭的獨立危險因素和不良預后的信號［1］。其對多種心血管刺激因素所做出的適應性代償反應；長期應激會導致心肌病理性肥大伴隨有心臟形態(tài)和功能上的惡化，最終導致心肌缺血、惡性心律失常、心力衰竭甚至猝死。因此心肌肥厚模型在揭示心力衰竭發(fā)生、發(fā)展規(guī)律，研究心力衰竭的預防和治療中發(fā)揮重要作用。心肌肥厚的發(fā)生機制尚未完全明確。證據(jù)顯示，Dysbindin的表達異常和心肌肥厚的發(fā)生密切相關［2-3］，建立Dysbindin轉(zhuǎn)基因小鼠心肌肥厚模型，對研究心肌肥厚及早期干預、防治心血管事件起到有益的作用［4］。本實驗復制兩種心肌肥厚模型：異丙腎上腺素（isoproternol，ISO）和胸主動脈縮窄（thoracic aorta constriction，TAC），比較Dysbindin轉(zhuǎn)基因小鼠心肌肥厚標志基因的表達。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級C57BL/6小鼠，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司［SCXK（滬）2007-0005］；小鼠繁殖和飼養(yǎng)在浙江中醫(yī)藥大學實驗動物［SYXK（浙）2018-0012］和浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院［SYXK（浙）2015-0010］。生產(chǎn)許可證，飼養(yǎng)許可證，遵循中國動物飼養(yǎng)條例。實驗小鼠的飼養(yǎng)過程和實驗操作均符合實驗動物倫理學要求（審批號：2016-042）以及中華人民共和國《實驗動物管理條例》。

1.2 主要實驗試劑和儀器 pUC57-Amp載體（GENEWIZ）、小量質(zhì)粒提取試劑盒和中量治理提取試劑盒（Qiagen）、PCR試劑盒（Invitrogen）、RNAiso Plus試劑盒（Takara）、SYBR Green Master Mix（Bioteke）、EDTA（Sigma公司）、戊巴比妥鈉、異丙腎上腺素（上海禾豐制藥）等。超凈工作臺（蘇州凈化設備廠）、OlympusIX-71熒光顯微鏡、OlympusSZ61體視顯微鏡、Nanodrop2000（Thermo）、CFX 熒光定量PCR儀（BioRad）、ALC-V8S小動物呼吸機（上海奧爾科生物科技有限公司）等。實驗方法：（1）建立Dysbindin轉(zhuǎn)基因小鼠 查詢NCBI和ENSEMBL的人Dysbindin（CCDS4534）和cTNT啟動子序列，構建cTNT-Dysbindin-IRES-EGFP-polyA質(zhì)粒，經(jīng)PCR擴增測序（上海生物工程公司），證實后受精卵原核顯微注射，產(chǎn)下仔鼠39只。鑒定陽性9只（4只雄性，5只雌性）為首建鼠（邦耀生物合成）。首建鼠分別與野生型小鼠交配6～7代以上，純化小鼠品系的遺傳背景。（2）小鼠ISO模型：10～12周雄性小鼠，將體重為24～26 g的小鼠納入實驗，按轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠1∶1配對，各16只。分為對照組與ISO組，ISO組皮下注射鹽酸異丙腎上腺素1 mg/kg，2次/d，間隔8 h，連續(xù)2周。對照組皮下注射相同體積的0.9%氯化納溶液。末次給藥后24 h取材。（3）小鼠TAC模型：10～12周雄性小鼠，將體重為24～26 g的小鼠納入實驗，預估TAC模型死亡率20%～30%，轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠各23只。使用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg），腹腔注射麻醉小鼠；固定小鼠上門齒于手術板，輕外拉小鼠舌，將氣管插管經(jīng)聲門輕柔插入氣管內(nèi)，連接呼吸機，呼吸機的頻率與小鼠的胸廓起伏一致提示氣管插管已成功。墊高小鼠胸廓，消毒胸部皮膚，剪開左胸部皮膚，分離組織，沿第2～3肋間打開胸腔，撥開左肺，分離胸主動脈，將6-0手術縫線穿過血管，在血管上方平行放置一段去尖的26G針頭，將血管及針頭一起結(jié)扎，抽出針頭即達到相應程度的縮窄（約70%縮窄）。結(jié)扎后，滴入數(shù)滴青霉素液，關閉胸腔，用注射器從縫合處插入胸腔并抽出0.5 mL氣體，逐層縫合。假手術組（sham組）在游離胸主動脈后只穿線，不結(jié)扎，其他操作步驟與TAC組一致。術后6周取材。（3）計算心臟重量指數(shù) 小鼠稱重后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，剪開皮膚、橫隔，剪除胸骨和肋骨，暴露肺和心臟，夾住左心耳下方的血管蒂，修剪心臟組織于4℃PBS液中清洗，無菌紗布吸干液體，稱量記錄心臟重量，液氮冷凍，保存在-80℃冰箱。心臟重量指數(shù)（HW/BW）=心臟重量（mg）/體重（g）。（4）心肌肥厚標志基因檢測：凍存心肌心臟研磨后，按照RNAiso Plus試劑盒操作指南提取總RNA，Nanodrop測定純度和濃度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRT-PCR檢測心肌肥厚的標志基因：心房利鈉肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）和-肌球蛋白重鏈（-myosin heavy chain，-MHC）。引物序列［5］：ANP F：5'ACAGCCAAGGAGGAAAAGGC3'R：5'CCACAGTGGCAATGTGACCA3'；BNP：F：5'TCCAGAGCAATTCAAGATGCA3'R：5'CTTTTGTGAGGCCTTGGTCC3'；-MHC：F：5'GATGTTTTTGTGCCCGATGA3'R：5'ACCGTCTTGCCATTCTCCG3'。GAPDH：F：5'GAAGGGCATCTTGGGCTACA3'R：5'GTGAGGGAGATGCTCAGTGTT3’。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示。組間比較用單因素方差分析，方差不齊時用Tamhane檢驗，方差齊性時用LSD檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定 轉(zhuǎn)基因小鼠出生3周剪鼠尾巴，PCR擴增，產(chǎn)物送上海生物工程公司測序，與GenBank的序列進行blast比對。隨機抽取陽性轉(zhuǎn)基因小鼠取腦、心、肺、肝、脾、腎臟和骨骼肌，熒光顯微鏡下觀察，dysbindin轉(zhuǎn)基因小鼠僅特異地表達在心肌組織。

2.2 心肌肥厚模型存活率 ISO模型32只小鼠2周后全部存活。TAC模型46只小鼠入組，術后6周野生型存活11只，轉(zhuǎn)基因組12只（存活率分別73%和80%）。

2.3 HW/BW比較 ISO模型中，對照組轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠分別為（4.27±0.06）mg/g和（4.27±0.04）mg/g，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。ISO組轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠為（5.09±0.05）mg/g和（5.43±0.09）mg/g，明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；轉(zhuǎn)基因小鼠較野生型小鼠降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。TAC模型中，sham組轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠分別為（4.24±0.04）mg/g和（4.29±0.06）mg/g，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。TAC組轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠為（5.11±0.14）mg/g和（7.09±0.07）mg/g，明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；轉(zhuǎn)基因小鼠較野生型小鼠降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.4 兩種模型心肌肥厚標志基因比較 對照組和sham組中轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠的心肌肥厚標志物基因表達均差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。ISO組和TAC組轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠比相應的對照組均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而轉(zhuǎn)基因小鼠心肌肥厚標志物升高程度低于野生型小鼠，除BNP外，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 心肌肥厚標志基因

3 討論

轉(zhuǎn)基因技術是現(xiàn)代生命科學研究的重要方法之一，在動物轉(zhuǎn)化研究中發(fā)揮重要作用。受精卵原核顯微注射法具有可直接轉(zhuǎn)移不含有原核載體DNA片段的外源基因、長度不受限制、實驗周期相對短和整合率高等特點，是目前最常用最有效的一種基因轉(zhuǎn)移方法。通過制作結(jié)扎雄鼠、受精卵供體雌鼠、假孕母鼠、顯微注射和胚胎移植，作者成功建立首建鼠，與野生型小鼠交配6～7代以上，純化小鼠品系的遺傳背景，共育轉(zhuǎn)基因小鼠的陽性率達80%。

心肌肥厚與細胞信號通路的激活密切相關。已知信號通路有MAPK（mitrogen-activated protein kinases，絲裂原活化蛋白激酶）信號通路、AMPK（AMP-activated protein kinase，腺苷酸激活蛋白激酶）信號通路、Wnt信號通路、JAK-STAT（Janus Kinase-Signal transducer and Activator of Transcription，Janus酪氨酸激酶-信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子）信號通路等，其互相作用調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程及細胞周期，調(diào)節(jié)各自下游的靶基因轉(zhuǎn)錄，刺激表達相關基因，導致心肌肥厚。因此心肌肥厚的機制非常復雜，復雜性取決于研究模型、病理刺激以及不同物種對刺激的反應性差異。在不同因素誘導下，心肌肥厚的分子表型可能不同［6］。

ANP是由心房肌細胞合成并釋放的肽類激素；BNP由心室肌細胞合成，心室負荷和室壁張力改變是刺激BNP分泌的主要條件。肌球蛋白是心肌粗細肌絲的主要成分，由兩條重鏈（α-MHC和-MHC）和兩對輕鏈構成。當心肌肥厚時，-MHC mRNA 表達明顯增強，α-MHC向-MHC轉(zhuǎn)化，因此-MHC是心肌肥厚的一個重要的標志性基因［7］。有研究發(fā)現(xiàn)不同心肌肥厚模型的基因表達譜存在差異［8］。TAC模型小鼠心肌肥厚有早期的代償性向心性肥厚和晚期的失代償性離心性肥大及心力衰竭兩個階段，在早期代償性心肌肥厚的進程中，磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（The extracellular signal-regulated kinases 1/2，ERK1/2）被激活［9］。ISO屬于β受體激動劑，激活交感神經(jīng)系統(tǒng)，有研究發(fā)現(xiàn)ISO模型中磷酸化氨基末端蛋白激酶（Phospho-c-Jun-NH2-terminal-Kinase，P-JNK）等增加［10］。ERK1/2和JNK是MAPK信號通路中的兩種分支，提示TAC模型和ISO模型可能通過MAPK家族信號通路中不同分支通路，導致心肌肥厚。

作者建立的Dysbindin轉(zhuǎn)基因小鼠，含有cTNT啟動子，具有心臟特異性表達，可用于心臟模型的研究。Dysbindin是富含心肌閉鎖連接蛋白-1相關蛋白（Myocardium-enriched zonula occludens-1-associated protein，Myozap）的分子伴侶，參與Rho相關的血清反應因子（Rho-dependent serum response factor，SRF）和ERK1/2介導的心肌肥厚，在心肌細胞信號轉(zhuǎn)導中起重要作用［11］。ERK1/2功能和細胞增殖分化有關，ERK1/2活化是將信號從細胞膜表面受體轉(zhuǎn)導至核的關鍵。其上游信號是Ras/Raf蛋白，該MAPK分支信號通路Ras/Raf-MEK-ERK中關鍵因子有Ras、Raf、MEK1/2、ERK1/2蛋白，任何一種蛋白功能異常會導致細胞生長分化異常。本研究結(jié)果提示，Dysbindin轉(zhuǎn)基因小鼠對于ISO和TAC誘導心肌肥厚均有減輕作用，除BNP表達外，差異均有統(tǒng)計學意義。Dysbindin轉(zhuǎn)基因小鼠在ISO和TAC誘導心肌肥厚模型中作用機制尚不明，可能與MAPK信號通路有關，具體待進一步研究證實。