雷公藤多苷通過線粒體自噬-NLRP3通路干預(yù)潰瘍性結(jié)腸炎的機(jī)制分析

吳佩 吳佳倩 羅依婷 鐘繼紅 劉英超

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，主要累及直腸和結(jié)腸的黏膜及黏膜下層，表現(xiàn)為反復(fù)腹痛、腹瀉、黏液膿血便等［1］。黏膜免疫應(yīng)答紊亂、基因易感性、腸道菌群失衡等多種因素導(dǎo)致UC的發(fā)生、發(fā)展［2-3］。據(jù)報(bào)道，UC的發(fā)病與NLRP3炎癥小體有密切關(guān)系［4-5］，且線粒體自噬在NLRP3炎癥小體的產(chǎn)生激活過程中起關(guān)鍵作用［6-7］。雷公藤多苷是一種從雷公藤植株中提取的五環(huán)三帖類化合物，臨床上可用于治療潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩?。?］。其中雷公藤紅素是雷公藤多苷中抑制免疫和抗炎作用的最重要成分［8-10］，本研究旨在探討雷公藤多苷治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雄性BALB/C小鼠24只，體質(zhì)量22～24 g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK（上海）2013-0016。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物保護(hù)與使用委員會(huì)的倫理規(guī)定和“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)與使用指南”。動(dòng)物飼養(yǎng)在溫度為23±2℃，濕度為55%±10%的無(wú)特定病原體的環(huán)境中，光照/黑暗周期為12 h，并使用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室飼料和水。

1.2 細(xì)胞 小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞（RAW264.7）由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，以含10%胎牛血清、10萬(wàn)U/L青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于含5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況換液，1次/12～24 h，細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合后，用0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化液進(jìn)行傳代培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。

1.3 藥物、試劑和抗體 雷公藤多苷購(gòu)自浙江得恩德制藥有限公司，雷公藤紅素（LOT：P26A9F600105）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。葡聚糖硫酸鈉（DSS，MW；36～50 kDa；LOT NO：S0948）購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。PINK1 Antibody、Nur77 Antibody購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司。

1.4 動(dòng)物分組和干預(yù) 適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、UC組、雷公藤多苷藥物組，給予UC組及藥物組小鼠3%DSS溶于水的溶液連續(xù)自由飲用7 d構(gòu)建UC模型，同時(shí)給予對(duì)照組小鼠等量蒸餾水自由飲用。造模7 d后給予藥物組小鼠雷公藤多苷溶液灌胃，同時(shí)給予其他小鼠等量蒸餾水灌胃。每天觀察記錄小鼠體重、毛色、精神狀態(tài)、糞便性狀及顏色等，14 d后處死所有老鼠，取各組病變最嚴(yán)重的結(jié)腸組織進(jìn)行肉眼及組織學(xué)檢查。

1.5 細(xì)胞分組和干預(yù) 將RAW264.7細(xì)胞設(shè)定對(duì)照組、脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）組、雷公藤紅素藥物組，向LPS組及藥物組細(xì)胞中加入含終濃度為100 ng/mL LPS的DMEM培養(yǎng)液100 μL，同時(shí)向藥物組細(xì)胞中加入含終濃度為0.062,5 μmol/L雷公藤紅素的DMEM培養(yǎng)液100 μL。分別培養(yǎng)24 h后，取細(xì)胞培養(yǎng)液，提取細(xì)胞蛋白并定量、變性進(jìn)行分析。

1.6 造模及組織學(xué)觀察 從造模第1天開始，觀察小鼠體重變化、糞便性狀以及是否便血，計(jì)算疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）。造模是否成功取決于大便稀爛程度、是否便血、有無(wú)體質(zhì)量減輕和形態(tài)學(xué)改變。選取肉眼觀病變明顯的結(jié)腸用10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切成4 μm厚，切片蘇木精-伊紅（HE）染色。評(píng)估組織學(xué)評(píng)分。

1.7 NLRP3的mRNA測(cè)定 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)NLRP3mRNA表達(dá)。取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用紫外分光光度法測(cè)定RNA的含量和純度，分離后分析溶解度曲線，然后用SuperScript III First-Strand合成SuperMix進(jìn)行qRT-PCR，用SYBR Green PCR Master Mix進(jìn)行RTPCR Power。采用2-ΔΔCT法測(cè)定表達(dá)水平。

1.8 Western blotting分析 提取細(xì)胞總蛋白后用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉（中國(guó)上海華比生命科學(xué)公司）室溫封閉2 h后，與一抗（PINK1 Antibody、Nur77 Antibody）在4℃孵育過夜。隨后，膜與辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的抗鼠或抗兔免疫球蛋白G（IgG）在室溫下孵育1 h。通過化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)的HRP底物（微孔）顯示該蛋白，并使用Image J軟件（NIH）進(jìn)行定量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用（±s）表示，計(jì)數(shù)資料用%表示；多組間比較方差齊性時(shí)采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法；多組間比較方差不齊時(shí)采用Kruskal-wallis H檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤多苷治療UC小鼠體質(zhì)量、病理變化 采用3%DSS溶液連續(xù)7 d喂養(yǎng)小鼠建立模型，UC組和雷公藤多苷藥物組小鼠從第6天開始出現(xiàn)體重減輕、腹瀉、便血等癥狀，UC組小鼠同時(shí)出現(xiàn)弓背、活動(dòng)減少等表現(xiàn)。與UC組比較，雷公藤多苷藥物組小鼠上述癥狀均減輕。結(jié)腸組織觀察發(fā)現(xiàn)，UC組肉眼可見明顯結(jié)腸萎縮，鏡下上皮隱窩丟失，組織間中性粒細(xì)胞大量浸潤(rùn)，表皮潰瘍等表現(xiàn)。雷公藤多苷藥物組結(jié)腸未見萎縮，黏膜平整光滑無(wú)出血，未見糜爛和潰瘍，鏡下僅少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。藥物組小鼠DAI評(píng)分和組織學(xué)評(píng)分低于UC組（P＜0.05）。見圖1及表1。

圖1 各組光鏡下病理改變

表1 不同組體重下降率、DAI和組織學(xué)評(píng)分比較（±s）

表1 不同組體重下降率、DAI和組織學(xué)評(píng)分比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與UC組比較，#P＜0.05

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2.2 雷公藤紅素對(duì)細(xì)胞NLRP3 mRNA表達(dá)的影響 在RAW264.7細(xì)胞中加入100 ng/L的LPS構(gòu)建炎癥模型，并使用0.062,5 μmol/L的雷公藤紅素干預(yù)。采取PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞炎癥因子NLRP3的mRNA表達(dá)量，結(jié)果表明：LPS造模后NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組（P＜0.05），而雷公藤多苷藥物組干預(yù)后表達(dá)量有明顯恢復(fù)，但仍高于對(duì)照組（P＜0.05）。見表2。

表2 不同組細(xì)胞NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.3 雷公藤紅素對(duì)細(xì)胞線粒體自噬蛋白表達(dá)的影響 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)最后階段收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，采取Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1、Nur77表達(dá)量，結(jié)果表明：LPS造模后PINK1、Nur77蛋白表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），而藥物干預(yù)組蛋白表達(dá)量較LPS組下降（P＜0.05）。見圖2。

圖2 不同組之間WB法檢測(cè)細(xì)胞線粒體自噬蛋白表達(dá)量比較

3 討論

近年來(lái)，亞洲地區(qū)UC的發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)［11］，目前UC的治療仍以美沙拉嗪及免疫抑制劑為主［12］，但存在一定的不良反應(yīng)以及停藥后的復(fù)發(fā)問題。雷公藤多苷作為中草藥提取藥物，臨床療效明確。雷公藤多苷能抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)受損黏膜愈合，并對(duì)黏膜纖維化具有一定的抑制作用，但其作用機(jī)制仍不十分明確。

雷公藤多苷化學(xué)成分包含各種二萜、三萜、生物堿以及其它成分如有機(jī)酸、木質(zhì)素、多糖等。其中三萜類化合物具有廣泛的生物活性，其代表性化合物有雷公藤紅素、雷公藤內(nèi)酯甲、雷公藤內(nèi)酯乙等［13］。有研究表明，雷公藤紅素參與多種炎癥信號(hào)通路的調(diào)控，如阻斷NF-κB激活酶的活性，抑制NF-κB的活化及其核轉(zhuǎn)位，調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路等，是雷公藤多苷中主要抗炎成分［14］。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雷公藤多苷能明顯改善UC小鼠癥狀以及結(jié)腸的病理，進(jìn)一步驗(yàn)證雷公藤多苷對(duì)UC小鼠的療效。大量研究［15-16］表明，UC患者腸黏膜中存在多種促炎因子，而這些炎癥因子與NLRP3炎癥小體的活化密切相關(guān)，NLRP3炎癥小體過度激活及IL-1β、IL-18過度釋放在UC慢性病程的遷延中起重要作用，而由線粒體產(chǎn)生的ROS與UC發(fā)病過程中NLRP3炎癥小體的激活有密切關(guān)系［17］。作者在前期實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，雷公藤多苷可以通過抑制ROSNLRP3信號(hào)通路進(jìn)而發(fā)揮抑制UC小鼠炎癥的發(fā)生。

雷公藤紅素作為雷公藤多苷重要的化合物，具有較強(qiáng)的免疫抑制和抗炎作用，其可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性ROS的信號(hào)通路，調(diào)節(jié)幾種關(guān)鍵分子分泌而抑制細(xì)胞分化，同時(shí)還通過抑制促炎性細(xì)胞因子和趨化因子分泌而產(chǎn)生細(xì)胞保護(hù)作用［18］。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，LPS造成的炎癥模型中NLRP3蛋白相對(duì)表達(dá)量增加，而雷公藤紅素干預(yù)后其明顯下調(diào)，表明雷公藤紅素對(duì)炎癥反應(yīng)有明顯的抑制作用。同時(shí)LPS造模后細(xì)胞PINK1、Nur77蛋白表達(dá)增加，而雷公藤紅素干預(yù)后蛋白表達(dá)減少。PINK1、Nur77蛋白是線粒體自噬過程中的兩種關(guān)鍵蛋白，在外界刺激下，在增殖、凋亡、炎癥和自噬等一系列細(xì)胞進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用［19］，Nur77可以從細(xì)胞核里轉(zhuǎn)換至細(xì)胞核外細(xì)胞漿并定位于線粒體從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象。Nur77從核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體上與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（TRAF2）相互作用，在炎癥狀態(tài)下，泛素化的Nur77可以增強(qiáng)線粒體自噬的敏感性，形成自噬小體在溶酶體中完成線粒體自噬過程。有研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素抑制炎癥的過程與Nur77依賴的線粒體自噬密切相關(guān)，線粒體過度清除導(dǎo)致細(xì)胞缺氧可能產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用［19］。通過本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷，雷公藤紅素在一定程度上抑制炎癥導(dǎo)致的線粒體自噬，減少線粒體的清除以提供足夠的能量來(lái)產(chǎn)生細(xì)胞保護(hù)作用，進(jìn)而抑制炎癥。