菌藥協(xié)同防治馬鈴薯瘡痂病后蛭石基質(zhì)微生物菌群的變化

吳曉穎，楊方巖，李壽如，賈景麗，于秀梅，劉大群，趙偉全

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治技術(shù)創(chuàng)新中心/國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071001；2. 本溪市馬鈴薯研究所，遼寧 本溪 117000）

由植物病原鏈霉菌（Streptomycesspp.）引起的馬鈴薯瘡痂?。≒otato common scab）是危害較為嚴(yán)重的馬鈴薯土傳和種傳病害。該病在我國各馬鈴薯產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，對種薯和商品薯的質(zhì)量影響較大，是馬鈴薯生產(chǎn)中急需解決的主要問題[1-2]。在脫毒微型薯繁育過程中，利用蛭石作為基質(zhì)生產(chǎn)時瘡痂病較易發(fā)生，嚴(yán)重時發(fā)病率高達(dá)80%以上，給微型薯生產(chǎn)造成較大威脅[3]。目前，馬鈴薯瘡痂病發(fā)生的原因尚不清楚，作為土傳病害，馬鈴薯瘡痂病病原菌可在土壤中長期存活，多年連作可導(dǎo)致病害的發(fā)生和加重。由于土傳病害的發(fā)生與植物根際土壤中微生物的組成結(jié)構(gòu)關(guān)系密切[4]，因此從微生物菌群特征入手，解析影響馬鈴薯瘡痂病發(fā)生發(fā)展的生物因素，可為探究該病的形成原因和有效防控提供指導(dǎo)。

目前，借助高通量測序技術(shù)已經(jīng)建立了比較成熟的土壤微生物多樣性分析方法，在很多研究中已廣泛應(yīng)用[5-6]。在馬鈴薯植株根際土壤微生物方面已開展了一些研究。龔靜等[7]研究了連作對馬鈴薯根際土壤真菌群落的影響，發(fā)現(xiàn)連作可使根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，造成有害真菌富集。張國青等[8]發(fā)現(xiàn)，環(huán)保肥料增效劑可以顯著改善馬鈴薯根際土壤的真菌種群結(jié)構(gòu)。熊憫梓等[9]發(fā)現(xiàn)，過量施用化肥和常年連作會改變馬鈴薯根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致土傳病害發(fā)生。目前，關(guān)于馬鈴薯瘡痂病相關(guān)環(huán)境微生物菌群方面也有研究。SHI 等[10]通過熒光定量PCR 和擴(kuò)增子測序技術(shù)分析了田間馬鈴薯瘡痂病發(fā)病程度高、低植株的土壤微生物群落差異，發(fā)現(xiàn)了與病害嚴(yán)重度相關(guān)的微生物菌群。胡洪濤等[11]研究了土壤消毒劑和生防菌聯(lián)合對微型薯瘡痂病蛭石微生態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)防治后細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)下降且一些有益菌增加。

鑒于馬鈴薯瘡痂病的發(fā)生與環(huán)境微生物組成結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，為盡量減少復(fù)雜背景的干擾，選擇微型薯蛭石基質(zhì)作為分析對象開展研究。在前期工作中已對蛭石基質(zhì)中的可培養(yǎng)微生物進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯瘡痂病防治后蛭石基質(zhì)中可培養(yǎng)菌群的種類和數(shù)量都發(fā)生了變化，其中放線菌和真菌數(shù)量減少，細(xì)菌數(shù)量增多[12]。但由于可培養(yǎng)菌群在總微生物中的占比很少，不足以揭示微生物群落及結(jié)構(gòu)的變化與瘡痂病的相關(guān)性。為了探尋微生物群落結(jié)構(gòu)變化與馬鈴薯瘡痂病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，利用高通量測序技術(shù)，對比分析菌藥協(xié)同防治馬鈴薯瘡痂病試驗(yàn)中不同防效處理及清水對照蛭石基質(zhì)的總微生物菌群，探究防治處理與發(fā)病對照蛭石基質(zhì)微生物優(yōu)勢菌群的差異，挖掘可能與病害防控相關(guān)的微生物菌群。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為二次重復(fù)使用的微型薯蛭石基質(zhì)，在微型薯收獲時選擇防治試驗(yàn)[13]中防效不同的4 個防治處理[生防菌ZWQ-1 水劑（LNBX1）、咯菌腈+ZWQ-1 水劑（LNBX3）、褔美雙+ZWQ-1 水劑（LNBX5）和四霉素（LNBX8）]和發(fā)病較為嚴(yán)重的清水處理（對照，LNBX0）分別取蛭石基質(zhì)，每次取不同處理蛭石基質(zhì)各500 mg，3 次重復(fù)，裝入自封袋中，迅速保存于-80 ℃冰箱。各處理防效數(shù)據(jù)見表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 微生物基因組的提取及檢測 樣品的MiSeq

高通量測序及微生物多樣性分析交由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。利用FastDNA?Spin Kit for Soil（MP Biomedicals）土壤基因組提取試劑盒提取全基因組DNA，進(jìn)行16SrDNA 和ITS 擴(kuò)增子測序。細(xì)菌選用長度約為280 bp 的16S rRNA 基因V4區(qū)測序，引物為520F（5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′）和802R（5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′）；真菌選用長度為250～500 bp 的ITS 區(qū)測序，引物為ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′ ），ITS2（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）。利用Illumina MiSeq 平臺對微生物基因組DNA 片段進(jìn)行雙端（Paired-end）測序。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析 利用FLASH[14]、QIIME[15]等軟件獲取有效數(shù)據(jù)，對獲得的高質(zhì)量序列按97%的序列相似度進(jìn)行歸并和OTU（Operational taxonomic units，操作分類單元）劃分，并選取每個OTU 中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列，根據(jù)OTU在每個處理中所包含的序列數(shù)，從Chao1指數(shù)（物種豐富度）、ACE 指數(shù)（物種豐富度）、Shannon 指數(shù)（微生物多樣性）進(jìn)行Alpha 多樣性分析，使用R 軟件計算各處理共有和獨(dú)有的OTU 數(shù)量，并對門和屬水平的群落組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，選取豐度前50位的屬進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理蛭石基質(zhì)的OTU分析

本研究15個測序樣品共得到468 953條細(xì)菌有效序列，其中高質(zhì)量序列為448 902 條，占有效序列的95.72%，基于97%的序列相似性進(jìn)行聚類分析，獲得了8 254 個OTU；共得到166 333 條真菌有效序列，其中高質(zhì)量序列為147 414 條，占有效序列88.63%，基于97%的序列相似性進(jìn)行聚類分析，獲得了1 377 個OTU。構(gòu)建體現(xiàn)處理間共有和獨(dú)有的OTU 數(shù)目的Venn 圖（圖1），分析微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性。

由細(xì)菌Venn 圖（圖1A）可見，所有樣品共有的OTU 為603 個，LNBX0 處理（對照）獨(dú)有OTU 數(shù)目最多，其次是LNBX8 處理；防效較好的LNBX3 處理獨(dú)有OTU 數(shù)目相對較少，與LNBX0 處理共有OTU 1 495 個，共有OTU 數(shù)目在LNBX3 處理中占比達(dá)86.02%，而LNBX5、LNBX1 和LNBX8 處理與對照共有OTU 數(shù)目在各自處理中分別占74.43%、69.80%和74.13%，說明防治后，防效較好的LNBX3 處理細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化較小。真菌Venn 圖（圖1B）表明，所有樣品共有的OTU 為32 個，與LNBX0 處理相比，LNBX3 處理獨(dú)有的OTU 數(shù)目相對最多（327 個），占總OTU 數(shù)目的76.70%，防治效果最差的LNBX8 處理獨(dú)有OTU 數(shù)目最少（134 個），占樣品總OTU 數(shù)目的56.30%，說明防治后，LNBX3 處理蛭石基質(zhì)的真菌群落結(jié)構(gòu)變化較大，而LNBX8處理變化最小。

圖1 不同處理蛭石基質(zhì)細(xì)菌（A）和真菌（B）OTU數(shù)量Venn圖Fig.1 Venn diagrams of bacterial（A）and fungal（B）OTU number in vermiculite matrix of different treatments

2.2 不同處理蛭石基質(zhì)中微生物多樣性和豐富度Alpha分析

Alpha 多樣性指數(shù)分析結(jié)果顯示，與對照相比，各防治處理蛭石基質(zhì)細(xì)菌豐富度和多樣性均略有降低，其中防效較好的LNBX3處理豐富度和多樣性變化最??；真菌豐富度表現(xiàn)為LNBX3＞LNBX1＞LNBX0＞LNBX8＞LNBX5，多樣性表現(xiàn)為LNBX3＞LNBX5＞LNBX0＞LNBX8＞LNBX1，說明防效較好的LNBX3 處理真菌多樣性和豐富度均明顯增加（表2）。

表2 不同處理蛭石基質(zhì)細(xì)菌和真菌Alpha多樣性指數(shù)Tab.2 Alpha diversity index of bacteria and fungi in vermiculite matrix of different treatments

2.3 不同處理蛭石基質(zhì)微生物物種組成結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 微生物類群數(shù)量變化 防效較好的LNBX3和LNBX5 處理蛭石基質(zhì)細(xì)菌在門、綱、目、科、屬分類水平上類群數(shù)量與對照相比呈減少趨勢，防效較差的LNBX1 和LNBX8 處理蛭石基質(zhì)細(xì)菌類群數(shù)與對照相比在各分類水平上均呈不同程度減少趨勢。不同防治處理蛭石基質(zhì)真菌類群數(shù)量在屬水平上較對照有不同程度的增加，其中LNBX3 處理真菌在綱、目、科、屬分類水平上類群數(shù)量均較對照明顯增加（表3）。

表3 不同處理蛭石基質(zhì)各分類水平細(xì)菌和真菌類群數(shù)量Tab.3 The number of microorganisms at different levels of bacteria and fungi in vermiculite matrix of different treatments

2.3.2 基于門分類水平的菌群組成 在門分類水平上，細(xì)菌群落主要的優(yōu)勢菌門有變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）等。與對照（LNBX0）相比，LNBX3、LNBX5 和LNBX8 處理蛭石基質(zhì)中變形菌門的相對豐度增加（LNBX0 39.9%，LNBX3 52.6%，LNBX5 69.9%，LNBX8 79.0%），所有防治處理蛭石基質(zhì)中放線菌門相對豐度減少（LNBX0 12.6%，LNBX1 7.3%，LNBX3 10.3%，LNBX5 4.8%，LNBX8 10.9%）（圖2A）。

真菌的主要優(yōu)勢菌門有子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）等。防效較好的LNBX3 處理蛭石基質(zhì)中擔(dān)子菌門、球囊菌門、壺菌門（Chytridiomycota）和羅茲菌門（Rozellomycota）與LNBX0 處理相比增加較多。不同防效處理蛭石基質(zhì)中，子囊菌門所占比例最大，與對照（LNBX0）相比，LNBX3 處理蛭石基質(zhì)中子囊菌門相對豐度減少較多（LNBX0 63.4%，LNBX3 32.9%）（圖2B）。

圖2 不同處理蛭石基質(zhì)中門水平細(xì)菌（A）和真菌（B）菌群相對豐度Fig.2 Relative abundance of bacterial（A）and fungi（B）community at phylum level in vermiculite matrix of different treatments

2.3.3 基于屬分類水平的菌群組成 對豐度排名前50位的優(yōu)勢菌屬進(jìn)行聚類分析并繪制豐度熱圖。分析結(jié)果（圖3A）表明，LNBX3 和LNBX0 處理蛭石基質(zhì)中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較相似，聚為一支。結(jié)合熱圖和相應(yīng)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，防治后LNBX3處理蛭石基質(zhì)與對照相比豐度增加的有假單胞菌屬（Pseudomonas，LNBX0 1.9%，LNBX3 13.5%）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium，LNBX0 0.3%，LNBX3 2.1%）、伯克氏菌屬（Burkholderia，LNBX0 0.0%，LNBX3 2.0%）、羅思河小桿菌屬（Rhodanobacter，LNBX0 0.0%，LNBX3 2.4%），豐度減少的有土地桿菌屬（Pedobacter，LNBX0 8.5%，LNBX3 1.0%）、枝動菌屬（Mycoplana，LNBX0 2.3%，LNBX3 1.2%）和鏈霉菌屬（Streptomyces，LNBX0 0.3%，LNBX3 0.2%）。

真菌屬水平豐度排名前50 位優(yōu)勢菌屬的豐度熱圖（圖3B）顯示，LNBX3 和LNBX0 處理蛭石基質(zhì)中真菌群落結(jié)構(gòu)較接近；結(jié)合熱圖和相應(yīng)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，與對照相比，LNBX3 處理蛭石基質(zhì)相對豐度明顯減少的有明梭孢屬（Monographella，LNBX0 31.9%，LNBX3 1.0%）、枝頂孢屬（Acremonium，LNBX0 12.4%，LNBX3 6.4%）和曲霉屬（Aspergillus，LNBX0 5.0%，LNBX3 0.6%）；相對豐度增加的有古根菌屬（Archaeorhizomycetales，LNBX0 1.2%，LNBX3 8.5%）、囊擔(dān)菌屬（Cystobasidium）、毛殼菌屬（Chaetomium）、短梗霉屬（Aureobasidium）、葡萄孢屬（Botrytis）、裸傘屬（Gymnopilus）等。

圖3 不同處理蛭石基質(zhì)中細(xì)菌（A）和真菌（B）的優(yōu)勢菌群豐度熱圖Fig.3 Heatmap of relative abundance of the dominant bacteria（A）and fungi（B）community in vermiculite matrix of different treatments

3 結(jié)論與討論

土傳病害的發(fā)生發(fā)展與土壤中的微生物類群密切相關(guān)，且微生物菌群組成結(jié)構(gòu)在不同植物病害發(fā)生時也不盡相同[16-17]。植物與微生物之間長期復(fù)雜的進(jìn)化關(guān)系既形成了可導(dǎo)致植物病害的有害微生物，也出現(xiàn)了有益的生防微生物[18]。已有很多研究證明了有益菌群在植物病害生防過程中的具體作用[19-20]。劉力偉等[21]和金杰人等[22]發(fā)現(xiàn)，熒光假單胞菌SS101 對9 株蘋果病原菌的菌絲生長及孢子萌發(fā)都有一定的抑制作用。YUAN 等[23]利用假單胞菌致病變種誘導(dǎo)土壤，當(dāng)再次種植擬南芥時，發(fā)現(xiàn)植株體內(nèi)茉莉酸水平明顯提高，誘導(dǎo)了植株的防御反應(yīng)，使發(fā)病率顯著降低。此外還有研究發(fā)現(xiàn)，伯克氏菌屬中的洋蔥伯克氏菌對立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、白假絲酵母（Candida albicans）等病原菌均表現(xiàn)較強(qiáng)的抗菌活性[24]。變形菌門中伯克氏菌屬、慢生根瘤菌屬等在土壤C、N 和S 循環(huán)中起著關(guān)鍵作用，可作為有益菌促進(jìn)植物生長[25-26]。擔(dān)子菌門和球囊菌門的一些種屬可以與植物形成外生菌根和叢枝菌根，促進(jìn)植物根部吸收養(yǎng)分，提高植物對病蟲害的抵抗力[27]。毛殼菌屬、曲霉屬中也都發(fā)現(xiàn)了對植物有益的菌株[28]。這些研究結(jié)果說明，參與抵御植物病害的有益菌株的種類組成具有明顯的多樣性，而且不同菌群具有的生防機(jī)制也各不相同。這些生防有益菌株的發(fā)現(xiàn)對植物病害尤其是尚無有效防治方法的土傳病害的防治具有重要意義。

馬鈴薯瘡痂病是極難防控的土傳病害，目前尚無理想的防治藥劑，生物防治是一條可能途徑。前期已有研究者開展了馬鈴薯瘡痂病土壤微生物方面的相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)采用多種田間管理措施可降低馬鈴薯瘡痂病的嚴(yán)重度，其主要是對土壤微生物群落組成結(jié)構(gòu)產(chǎn)生間接影響所致[29]。本研究中，防效較高的處理蛭石基質(zhì)微生物群落結(jié)構(gòu)與對照相比也發(fā)生了較大變化。熊憫梓等[9]研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯瘡痂病發(fā)病土壤中的細(xì)菌多樣性和豐富度較未發(fā)病土壤均降低。本研究發(fā)現(xiàn)，在蛭石基質(zhì)中，各防治處理細(xì)菌豐富度和多樣性均有所降低，而真菌的豐富度和多樣性增加；防效較高的處理蛭石基質(zhì)中細(xì)菌的放線菌門豐度降低，假單胞菌屬、慢生根瘤菌屬、伯克氏菌屬等有益菌群的豐度明顯增加，該結(jié)果與胡洪濤等[11]利用棉隆+青霉菌防治馬鈴薯瘡痂病后蛭石基質(zhì)細(xì)菌多樣性指數(shù)下降、有益假單胞桿菌數(shù)量顯著增加的結(jié)果相似。

探尋病害防控中變化明顯的優(yōu)勢微生物菌群是深入研究馬鈴薯瘡痂病防控機(jī)制的重要線索。SHI 等[10]對馬鈴薯瘡痂病田中發(fā)病程度不同的植株根際土壤進(jìn)行微生物群落分析時發(fā)現(xiàn)，土壤中的寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas）、貪噬菌（Variovorax）和農(nóng)桿菌（Agrobacterium）等菌群數(shù)量與瘡痂病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，地芽孢桿菌（Geobacillus）、短桿菌（Curtobacterium）和某類地嗜皮菌（unclassifiedGeodermatophilaceae）的數(shù)量與瘡痂病的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。本研究采用菌藥協(xié)同的方法防治馬鈴薯瘡痂病后，將防效較好的處理與對照比較后發(fā)現(xiàn)，蛭石基質(zhì)中寡養(yǎng)單胞菌、貪噬菌和農(nóng)桿菌的豐度也明顯下降，這與上述研究結(jié)果相吻合，但其并未出現(xiàn)在豐度排名前50的優(yōu)勢菌群中；同時發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬、慢生根瘤菌屬、伯克氏菌屬、毛殼菌屬等豐度與對照相比明顯增加，也許這些生防有益菌屬的變化與馬鈴薯瘡痂病的減輕有一定相關(guān)性。

本研究發(fā)現(xiàn)，菌藥協(xié)同防治馬鈴薯瘡痂病后可顯著影響蛭石基質(zhì)中微生物菌群的組成結(jié)構(gòu)，使瘡痂病原鏈霉菌屬豐度降低，而假單胞菌屬、慢生根瘤菌屬、伯克氏菌屬、毛殼菌屬等生防有益菌豐度呈現(xiàn)不同程度增加。該結(jié)果為從微生物角度解析馬鈴薯瘡痂病發(fā)生和病害防控機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。