基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析股骨頭壞死愈膠囊治療股骨頭壞死的潛在靶點及作用機制

張雪，徐彬，劉又文，李無陰，張虹，岳辰

(1.河南省洛陽正骨醫(yī)院/河南省骨科醫(yī)院，河南 洛陽 471002；2.浙江省立同德醫(yī)院，浙江 杭州 310012)

股骨頭壞死(osteonecrosis of femoral head，ONFH)屬中醫(yī)學(xué)“骨蝕”范疇[1]。中醫(yī)學(xué)理論認為，腎虛、血瘀是ONFH的基本證候，而補腎活血法則是中醫(yī)治療ONFH最主要的治則之一[2]?；谘a腎活血法組方的股骨頭壞死愈膠囊是傳承兩百余年的平樂郭氏正骨治療“骨蝕”的經(jīng)典方劑。前期的臨床研究顯示，股骨頭壞死愈膠囊能有效改善ONFH患者的髖關(guān)節(jié)功能，延緩病情進展[3]。相關(guān)的動物實驗也表明，該藥能夠提高激素性O(shè)NFH兔血清骨鈣素與降鈣素水平[4]。

股骨頭壞死愈膠囊的組成藥物較多，明確其治療ONFH的靶點及作用機制較為困難。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，根據(jù)成分、疾病、靶點之間相互作用的系統(tǒng)研究方法，通過高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析、虛擬計算及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫檢索，對生物系統(tǒng)進行網(wǎng)絡(luò)分析，具有整體性、系統(tǒng)性等特點，已廣泛應(yīng)用于藥物活性成分篩選、藥物作用機制及疾病發(fā)病機制研究等方面[5]。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析了股骨頭壞死愈膠囊治療ONFH的潛在靶點及作用機制，現(xiàn)總結(jié)報告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物有效成分及靶點篩選分別在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)和中醫(yī)藥百科全書(encyclopedia of traditional Chinese medicine，ETCM)數(shù)據(jù)庫中檢索股骨頭壞死愈膠囊主要組成藥物“鹿茸”“續(xù)斷”“杜仲”“丹參”“雞血藤”“黃芪”的活性成分(設(shè)定口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18)和靶點。剔除重復(fù)活性成分和靶點后,在UniProt數(shù)據(jù)庫中將靶點蛋白名稱轉(zhuǎn)換為規(guī)范的基因名稱，并剔除無靶點活性成分。將從TCMSP與ETCM數(shù)據(jù)庫篩選獲得的活性成分和靶點信息取并集，得到股骨頭壞死愈膠囊的有效成分和靶點信息。

1.2 關(guān)鍵靶點篩選在GeneCards數(shù)據(jù)庫中以“osteonecrosis of femoral head”為關(guān)鍵詞進行檢索，獲得ONFH相關(guān)基因。同時從GEO數(shù)據(jù)庫下載包含ONFH基因數(shù)據(jù)的GSE74089數(shù)據(jù)集，通過R軟件Limma包進行差異基因分析(篩選標準為FDR<0.05、logFC>1)得到ONFH差異表達基因。將上述ONFH相關(guān)基因、ONFH差異表達基因及1.1中獲得的藥物靶點基因輸入Venny2.1.0在線作圖網(wǎng)站繪制韋恩圖，將獲得的交集基因作為股骨頭壞死愈膠囊治療ONFH的關(guān)鍵靶點。

1.3 藥物-成分-靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將1.1篩選出的有效成分和1.2篩選出的關(guān)鍵靶點基因名稱輸入到STRING數(shù)據(jù)庫(Version11.0)中進行檢索，設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”，構(gòu)建藥物-成分-靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，將蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件進行分析，剔除孤立有效成分和孤立靶點。

1.4 關(guān)鍵靶點基因功能及信號通路富集分析使用R軟件的ClusterProfiler包對1.2篩選出的關(guān)鍵靶點基因進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，挖掘關(guān)鍵靶點的生物學(xué)功能和通路信息。

1.5 核心靶點篩選將1.2篩選出的關(guān)鍵靶點基因名稱輸入到STRING數(shù)據(jù)庫(Version11.0)構(gòu)建關(guān)鍵靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并將關(guān)鍵靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件分析網(wǎng)絡(luò)圖中的關(guān)鍵節(jié)點及度值，篩選其中具有最高度值的靶點作為核心靶點。

2 結(jié) 果

2.1 藥物有效成分及靶點篩選結(jié)果在TCMSP中篩選到活性成分121個、靶點243個，在ETCM數(shù)據(jù)庫中篩選到活性成分95個、靶點405個。將2個數(shù)據(jù)庫中篩選到的活性成分和靶點分別取并集后獲得股骨頭壞死愈膠囊的有效成分203個(鹿茸有效成分2個、續(xù)斷有效成分6個、杜仲有效成分153個、丹參有效成分86個、雞血藤有效成分92個、黃芪有效成分134個)，靶點592個。

2.2 關(guān)鍵靶點篩選結(jié)果在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索到ONFH相關(guān)基因2033個，在GEO數(shù)據(jù)庫GSE74089數(shù)據(jù)集獲得ONFH差異表達基因8178個(上調(diào)基因5061個、下調(diào)基因3117個)(圖1)。將ONFH相關(guān)基因、ONFH差異表達基因及藥物靶點基因取交集后，獲得股骨頭壞死愈膠囊治療ONFH的關(guān)鍵靶點57個(圖2)。

2.3 藥物-成分-靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果構(gòu)建的藥物-成分-靶點蛋白互作網(wǎng)路包含200個節(jié)點和500條邊，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)顯示137個藥物有效成分與57個關(guān)鍵靶點有對應(yīng)關(guān)系(圖3)。

2.4 關(guān)鍵靶點基因功能及信號通路富集分析結(jié)果GO功能富集分析生物學(xué)過程、細胞組分及分子功能目錄下前10位的富集分析結(jié)果見圖4，主要涉及激素反應(yīng)(類固醇激素、糖皮質(zhì)激素、肽激素及激素的分泌和運輸)，氧供反應(yīng)(氧氣水平、缺氧和氧氣水平降低)，免疫系統(tǒng)過程調(diào)節(jié)(炎癥反應(yīng)、白細胞遷移、T細胞活化及白細胞-細胞粘附調(diào)節(jié))，骨細胞調(diào)節(jié)(分化、骨化、穩(wěn)態(tài)、遷移)，骨小梁形成，骨重塑調(diào)節(jié)，骨化調(diào)節(jié)，軟骨發(fā)育，骨合成過程等。KEGG信號通路富集分析排名前10位的富集結(jié)果見圖5，主要包括缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)信號通路、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路、鞘脂信號通路、p53信號通路、鈣信號通路、精氨酸和脯氨酸代謝信號通路。

2.5 核心靶點篩選結(jié)果以篩選出的57個關(guān)鍵靶點構(gòu)建的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖顯示，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)為具有最高度值的關(guān)鍵靶點，即核心靶點(圖6)。

3 討 論

中醫(yī)學(xué)理論認為腎藏精，主骨生髓，為先天之本。骨骼的生長發(fā)育、盛衰強弱均與腎精充盈與否有關(guān)，腎精充盈則骨有所養(yǎng)、骨骼強健，腎精虧虛則骨失所養(yǎng)、髓不實而骨不堅，因此腎精充盈是保證骨骼健康的重要條件。肝腎同源，肝藏血，腎水虧虛不能滋養(yǎng)肝木，又會形成血虛、血瘀，血液不能發(fā)揮其濡養(yǎng)作用，從而誘發(fā)骨蝕。因此，盡管歷代醫(yī)家對于骨蝕的辨證論治并不完全統(tǒng)一，但均認為腎虛、血瘀是其基本證候，補腎活血法為其主要治則之一。股骨頭壞死愈膠囊中，鹿茸溫腎壯陽，丹參活血化瘀，二者共為君藥；續(xù)斷、杜仲合用補肝腎、強筋骨、行血脈、助鹿茸補腎壯骨兼活血，黃芪益氣行血，雞血藤行血補血，四藥共為臣藥。諸藥合用，共奏溫補腎陽、活血祛瘀止痛之效。

圖1 GEO數(shù)據(jù)庫篩選出的股骨頭壞死差異表達基因火山圖和表達量熱圖

圖2 股骨頭壞死愈膠囊治療股骨頭壞死關(guān)鍵靶點篩選韋恩圖

關(guān)鍵靶點基因GO功能富集分析及KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，股骨頭壞死愈膠囊治療ONFH的分子生物學(xué)機制主要涉及HIF-1、NF-κB、p53等信號通路，參與激素反應(yīng)、氧供反應(yīng)，免疫系統(tǒng)過程調(diào)節(jié)、骨細胞調(diào)節(jié)、骨小梁形成、骨重塑調(diào)節(jié)、骨化調(diào)節(jié)、軟骨發(fā)育、骨合成等生物學(xué)過程。已有研究表明，補腎活血藥物可通過HIF-1信號通路、NF-κB信號通路，p53信號通路治療多種疾病，包括ONFH、骨關(guān)節(jié)炎及脊柱退變[6]。HIF-1α是恢復(fù)細胞內(nèi)氧濃度的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在調(diào)節(jié)干細胞血管生成中起關(guān)鍵作用[7]，也被證實參與了早期ONFH的發(fā)生發(fā)展[8]。HIF-1α信號通路被證實參與骨細胞和成骨細胞的形態(tài)和功能調(diào)節(jié)[9]。Wu等[10]發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯可以促進家兔股骨頭組織中HIF-1α及血管內(nèi)皮生長因子的表達，抑制細胞凋亡，從而延緩ONFH。NF-κB是炎癥反應(yīng)的主要介質(zhì)，通過參與細胞因子釋放，與許多骨科疾病的發(fā)生有密切聯(lián)系[11]。Qu等[12]在ONFH患者的變性軟骨和經(jīng)卵泡抑素樣蛋白1處理的軟骨細胞中檢測到NF-κB信號通路激活。Pei等[13]發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體4/NF-κB的過度激活可能交互式地抑制Wnt/β-catenin信號通路并誘發(fā)ONFH，并提出NF-κB可以作為ONFH的治療靶點。Zhang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激可以提高骨髓間充質(zhì)干細胞表達p53，而抑制p53表達可以顯著增強線粒體自噬，抵抗骨髓間充質(zhì)干細胞的凋亡和衰老，并有效提高骨髓間充質(zhì)干細胞對早期激素誘導(dǎo)的ONFH的修復(fù)作用。結(jié)合本研究的結(jié)果，我們認為股骨頭壞死愈膠囊的有效成分通過57個關(guān)鍵靶點，參與氧供反應(yīng)、激素反應(yīng)、細胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)、骨代謝等生物學(xué)過程，進而對ONFH發(fā)揮治療作用。

圖3 構(gòu)建的藥物-成分-靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 股骨頭壞死愈膠囊治療股骨頭壞死關(guān)鍵靶點基因GO功能富集分析結(jié)果氣泡圖

圖5 股骨頭壞死愈膠囊治療股骨頭壞死關(guān)鍵靶點基因KEGG信號通路富集分析結(jié)果氣泡圖

圖6 股骨頭壞死愈膠囊治療股骨頭壞死關(guān)鍵靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

篩選出的57個關(guān)鍵靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)顯示，TNF是具有最高度值的核心靶點。作為重要的炎癥因子，TNF與成骨細胞分化、成熟密切相關(guān)[15-16]，參與ONFH的發(fā)生發(fā)展[17-18]。Li等[19]的研究表明，在ONFH患者的軟骨退變過程中，TNF通過NF-κB信號通路上調(diào)了解聚蛋白樣金屬蛋白酶-7的表達，而后者可使軟骨退變加重。Peng等[20]的研究表明，移植堿性成纖維細胞生長因子-2基因轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細胞和異種抗原-松質(zhì)骨，可以抑制TNF表達，促進ONFH的修復(fù)。Qu等[12]發(fā)現(xiàn)，卵泡抑素樣蛋白1在ONFH患者關(guān)節(jié)滑膜及軟骨組織中表達增加，并且可以增加ONFH模型中TNF的表達。

本研究的結(jié)果顯示，股骨頭壞死愈膠囊治療ONFH的潛在靶點為TNF，其作用機制可能為通過HIF-1、NF-κB、p53等信號通路，參與激素反應(yīng)、氧供反應(yīng)、免疫系統(tǒng)過程調(diào)節(jié)及骨形成調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程。