陰莖癌的免疫微環(huán)境及免疫治療的研究進(jìn)展

薛婷 晏如 韓輝

陰莖癌是一種較為罕見的惡性腫瘤，主要病理類型為陰莖鱗狀細(xì)胞癌(penile squamous cell carcinoma, PSCC)。美國約每100 000男性中存在0.5～2.1例患者，在亞洲、非洲和南美洲等地方，其發(fā)病率約占男性所有惡性疾病的1%～2%[1-2]。約有1%～2%的陰莖癌患者會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移，主要表現(xiàn)為淋巴結(jié)固定、腹股溝淋巴結(jié)腫大或盆腔淋巴結(jié)腫大，繼而擴(kuò)散至全身部位。腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者5年生存率為20%～40%，發(fā)生盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者5年生存率低至0%，預(yù)后較差[3]。Pagliaro等[4]報(bào)道局部晚期陰莖癌患者TIP方案(紫杉醇+異環(huán)磷酰胺+順鉑)的客觀反應(yīng)率為50%，是各類指南推薦的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。也有研究者對(duì)其他的治療方案進(jìn)行了探索，如Djajadiningrat等[5]報(bào)道TPF方案(多西他賽+順鉑+5-氟尿嘧啶)的2年無進(jìn)展生存率(progression free survival, PFS)和疾病特異性生存率(disease free survival, DSS)分別為12%和28%。但由于毒性過大，而限制了其在臨床的應(yīng)用。

近年來，免疫檢查點(diǎn)抑制劑的運(yùn)用開辟了腫瘤治療的新歷史。腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment, TME)與免疫治療的效果高度相關(guān)，相關(guān)的生物標(biāo)志物也可用來預(yù)測(cè)免疫治療的療效。越來越多的證據(jù)表明TME中的各種成分(成纖維細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞等)是腫瘤發(fā)生、生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的重要組成部分，腫瘤的微環(huán)境特征對(duì)于評(píng)估預(yù)后情況也有一定的價(jià)值[6]。本文從調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境的角度分析目前新型免疫治療策略的應(yīng)用，有望為優(yōu)化晚期患者的免疫治療方案提供參考依據(jù)。

一、TME

1.腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor-infiltrating lymphocytes, TILs)：TILs包括CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞等，高水平的TILs顯著提高了乳腺癌患者新輔助化療的敏感性和療效，與腫瘤特異性生存率呈正相關(guān)[7]。TILs能夠反映出腫瘤的免疫應(yīng)答和調(diào)控作用的趨勢(shì)，參與癌癥免疫編輯和免疫逃逸過程的作用而被廣泛研究[8]。

2.CD8+T淋巴細(xì)胞：CD8+T淋巴細(xì)胞在識(shí)別抗原后分化為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)，通過向免疫突觸釋放顆粒酶、穿孔素等細(xì)胞毒分子、分泌干擾素和腫瘤壞死因子等細(xì)胞因子，殺死攜帶目標(biāo)抗原的細(xì)胞，進(jìn)一步加速對(duì)細(xì)胞內(nèi)病原體的先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。CD8+T淋巴細(xì)胞作為抗腫瘤免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)因子，在腫瘤細(xì)胞的適應(yīng)性免疫防御中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。Ottenhof等[10]對(duì)荷蘭癌癥研究所就診的213例陰莖癌患者進(jìn)行了回顧性研究。結(jié)果表明，基質(zhì)內(nèi)CD8+T細(xì)胞數(shù)量較少的患者，易于發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；與Harada等[11]在直腸癌中報(bào)道的一致。

3.調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(T regulatory cell, Treg)：Treg受特定抗原刺激后，可產(chǎn)生多種抑制性細(xì)胞因子(IL-10、TGF-β、CTLA-4等)以達(dá)到增強(qiáng)Treg細(xì)胞的免疫抑制能力，同時(shí)這些因子又可以反饋調(diào)節(jié)誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生。部分Treg細(xì)胞表達(dá)顆粒酶B和穿孔素以攻擊靶細(xì)胞。多種機(jī)制聯(lián)合導(dǎo)致活化T細(xì)胞失活抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫功能，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。Treg細(xì)胞表達(dá)特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，可作為識(shí)別Treg細(xì)胞的標(biāo)志[12]。Vassallo等[13]通過免疫組化陰莖癌石蠟包埋組織的p16蛋白、CD3、CD4、CD8、CD20、CD68、CD138、顆粒酶B和Foxp3+進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示Foxp3+淋巴細(xì)胞水平能夠獨(dú)立預(yù)測(cè)預(yù)后情況。Cocks等[14]隨訪了53例局部晚期的陰莖癌患者，發(fā)現(xiàn)晚期陰莖癌患者中的CD8+T/Foxp3+Treg比值有明顯減少的趨勢(shì)，陰莖癌伴高水平腫瘤浸潤(rùn)的Foxp3+Treg細(xì)胞無病生存幾率更低；表明Foxp3可能是一個(gè)免疫治療療效差的生物標(biāo)記物。

4.腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages, TAMs)：TAMs多為外周血單核巨噬細(xì)胞分化而來，是TME中浸潤(rùn)的主要炎癥細(xì)胞之一。TAMs分為干擾素γ和脂多糖刺激產(chǎn)生的M1型巨噬細(xì)胞(CD68)和IL-4和IL-13等誘導(dǎo)產(chǎn)生M2型巨噬細(xì)胞(CD163)。M1型TAMs主要起到殺傷細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)展和促進(jìn)適應(yīng)性免疫反應(yīng)的作用。而M2型TAMs通過在基底膜破裂和沉積、血管生成、白細(xì)胞募集和免疫抑制的作用，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[15]。TAMs可以重塑腫瘤免疫抑制環(huán)境，分泌的免疫抑制性細(xì)胞因子或蛋白酶會(huì)誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡-配體1(programmed death receptor-ligand 1, PD-L1)PD-L1在癌細(xì)胞中過表達(dá)并激活相關(guān)的信號(hào)通路，加速腫瘤進(jìn)展。在陰莖癌中，高CD68+TAMs浸潤(rùn)的患者，腫瘤特異性生存情況有明顯的改善、總生存期長(zhǎng)和局部復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)降低[16]。另一項(xiàng)陰莖癌的研究表明，陰莖癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與CD163+TAMs的浸潤(rùn)程度相關(guān)[10]。TAMs在TME中發(fā)揮了重要的作用，但兩種TAMs的作用機(jī)制不同。因此，區(qū)分何種TAMs在TME中發(fā)揮了主導(dǎo)作用，是影響患者預(yù)后的關(guān)鍵。M1型還是M2型TAMs是免疫治療的關(guān)鍵之處。

5.免疫分型：Zhang等[17]收集了來自8例肝細(xì)胞癌患者的42份樣本。通過CD45和Foxp3的表達(dá)情況，將實(shí)體腫瘤在組織學(xué)上分為3種腫瘤免疫表型：①免疫活性亞型：CD45高表達(dá)Foxp3低表達(dá)，該亞型中免疫細(xì)胞較多，存在一定的抗腫瘤免疫能力，預(yù)后較好。然而，其浸潤(rùn)性T細(xì)胞的抗腫瘤功能相對(duì)較低，需要被進(jìn)一步激活，所以T細(xì)胞反應(yīng)激活劑(如IL-12和CpG 寡核苷酸)和ICIs的聯(lián)合使用能夠使此類患者獲益；②免疫抑制亞型：CD45高表達(dá)Foxp3高表達(dá)，這一類型的TME內(nèi)存在大量的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，但免疫環(huán)境可能受到抑制，此時(shí)應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)抑制劑可以恢復(fù)抗腫瘤效應(yīng)；③免疫缺陷亞型：CD45低表達(dá)，腫瘤實(shí)質(zhì)或間質(zhì)內(nèi)幾乎完全缺乏T細(xì)胞。程序性細(xì)胞死亡1(programmed death receptor-1, PD-1)/PD-L1抑制劑無法在此表型中發(fā)揮作用，如何誘導(dǎo)產(chǎn)生更多腫瘤特異性T細(xì)胞是改善該表型抗腫瘤作用的關(guān)鍵步驟[18]。

Troiano等[19]對(duì)口腔舌鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma of the oral tongue, OTSCC)的免疫表型進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)免疫沙漠型腫瘤患者的疾病特異性生存期(HR=2.673)、總生存率(HR=2.591)和無病生存期(HR=2.313)均較差。該研究表明免疫沙漠型是OTSCC患者預(yù)后不良的一個(gè)評(píng)估因素。以上結(jié)果表明，腫瘤免疫表型可以作為指導(dǎo)選擇合適治療方法的工具，也可以作為評(píng)估患者預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)。但目前在陰莖癌中還缺少對(duì)免疫分型的研究。

二、預(yù)測(cè)免疫治療效果的生物標(biāo)志物

1.腫瘤突變負(fù)荷(tumor mutational burden, TMB)：TMB是指腫瘤細(xì)胞編碼區(qū)每Mb DNA的非同義體細(xì)胞突變的數(shù)量。高頻率體細(xì)胞突變的發(fā)生可能導(dǎo)致新抗原的產(chǎn)生，誘導(dǎo)腫瘤表達(dá)大量異常蛋白，這些異常蛋白被免疫系統(tǒng)識(shí)別為新抗原，從而引起抗腫瘤免疫反應(yīng)。因而，TMB高提示產(chǎn)生的新抗原多，應(yīng)用免疫檢查點(diǎn)抑制劑釋放的T細(xì)胞更有可能識(shí)別新抗原，從而達(dá)到攻擊和殺死腫瘤的作用。美國食品和藥物管理局已經(jīng)批準(zhǔn)了pembrolizumab用于TMB≥10 Muts/Mb的不可切除或轉(zhuǎn)移性成年和小兒實(shí)體瘤患者[20]。

CheckMate-032試驗(yàn)[21]納入了401名一線治療失敗的晚期肺癌患者，分兩組比較接受Nivolumab單藥治療和Nivolumab與Ipilimumab聯(lián)合治療效果的差異。對(duì)組織進(jìn)行靶向基因組測(cè)序計(jì)算TMB，分為高、中、低3組評(píng)估治療情況。結(jié)果顯示，TMB高的人群有效率是中、低組的3倍；TMB高組患者的總生存期比低組延長(zhǎng)了19個(gè)月。Chahoud等[22]對(duì)2例初始治療失敗的陰莖癌患者采用派姆單抗治療。分別檢測(cè)2例患者的TMB情況，病理完全緩解患者的TMB為14 Muts/Mb，另一位部分緩解患者的TMB值為3 Muts/Mb。以上結(jié)果表明，TMB可能是預(yù)測(cè)患者免疫治療療效的一個(gè)因素。但TMB與免疫治療應(yīng)答的關(guān)系仍有待進(jìn)一步探討。

2.微衛(wèi)星不穩(wěn)定性：微衛(wèi)星序列在復(fù)制過程中極易發(fā)生復(fù)制錯(cuò)誤，導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)堿基的錯(cuò)配、插入、缺失，發(fā)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability, MSI)，使得大量突變?cè)诩?xì)胞內(nèi)累積，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。DNA錯(cuò)配修復(fù)是一種重要的DNA錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制，能識(shí)別及修復(fù)在DNA復(fù)制或重組過程中產(chǎn)生的DNA錯(cuò)配，小范圍的堿基缺失或插入，對(duì)維持基因組穩(wěn)定性、遺傳后代的精確性有著重要的作用。腫瘤組織出現(xiàn)MSI現(xiàn)象是DNA錯(cuò)配修復(fù)缺陷的重要標(biāo)志[23]。

頭頸部鱗癌、肛門鱗癌中MSI-H的發(fā)生率約為0.78%。但是在宮頸鱗癌MSI-H的發(fā)生率約為11%[24]。Stoehr等[24]通過免疫組化等方式檢測(cè)了105例陰莖癌患者錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)的情況。結(jié)果表明，錯(cuò)配修復(fù)蛋白全部表達(dá)，沒有MSI的證據(jù)。以上結(jié)果表明，MSI和dMMR在不同癌種間的差距較大，并不是陰莖癌的常規(guī)特征，能否作為陰莖癌PD-1/PD-L1療效預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物有待驗(yàn)證。

3.PD-1/PD-L1表達(dá)：近年來的研究表明，T淋巴細(xì)胞的活化情況與免疫檢查點(diǎn)有著密切的關(guān)系。T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在某種條件下被抑制，腫瘤發(fā)生免疫逃逸并迅速生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移。免疫檢查點(diǎn)包括：①PD-1和PD-L1；②細(xì)胞毒素T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)[25]。T細(xì)胞的表面的PD-1蛋白與腫瘤細(xì)胞的PD-L1/PD-L2蛋白結(jié)合后，提供抑制性信號(hào)，誘導(dǎo)了T細(xì)胞凋亡、抑制T細(xì)胞的活化和增殖，使腫瘤細(xì)胞逃脫免疫系統(tǒng)的攻擊。約在40%～60%的陰莖癌患者中能夠檢測(cè)到PD-L1的表達(dá)[26]。Udager等[27]對(duì)37例陰莖癌患者進(jìn)行了免疫組織化學(xué)分析研究，結(jié)果顯示，37例原發(fā)腫瘤中23例(62.2%)PD-L1表達(dá)呈陽性，原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤中PD-L1的表達(dá)呈正相關(guān)。原發(fā)腫瘤的PD-L1表達(dá)與區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P=0.024)，與癌癥特異性生存率降低(P=0.011)亦顯著相關(guān)。大多數(shù)原發(fā)性陰莖癌腫瘤表達(dá)PD-L1，其高表達(dá)與高風(fēng)險(xiǎn)的臨床病理特征和較差的臨床結(jié)局有關(guān)。這些數(shù)據(jù)為進(jìn)一步研究抗PD-1和抗PD-L1免疫療法在晚期陰莖鱗癌患者中的作用提供了理論依據(jù)。

4.CTLA-4 表達(dá)：CTLA-4的作用與PD-1/PD-L1類似，CTLA-4與B7分子結(jié)合后誘導(dǎo)T細(xì)胞失活，免疫反應(yīng)受到抑制，可以幫助實(shí)體腫瘤逃避宿主的抗腫瘤免疫。Karpathiou等[28]檢測(cè)了152例頭頸鱗狀細(xì)胞癌患者的CTLA-4水平，結(jié)果顯示，腫瘤組織高表達(dá)CTLA-4的患者無進(jìn)展生存期(progression free survival, PFS)及總生存期分別為19個(gè)月和32個(gè)月，而低表達(dá)CTLA-4的患者為42個(gè)月和48個(gè)月。表明腫瘤CTLA-4的表達(dá)情況是評(píng)估腫瘤患者預(yù)后的一個(gè)因素。

三、人類乳頭狀瘤病毒與免疫微環(huán)境關(guān)系

多項(xiàng)研究顯示，陰莖癌的發(fā)病和預(yù)后可能相關(guān)的因素之一為人類乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染，由于受病毒分子檢測(cè)方式、種群的影響，文獻(xiàn)報(bào)道的陰莖癌患者HPV的感染率差異較大。25%～50%的陰莖癌患者存在HPV病毒感染，其中又以攜帶高危型HPV 16型和18型占絕大多數(shù)[29]。

HPV調(diào)控陰莖癌的TME也是增強(qiáng)免疫治療值得關(guān)注的領(lǐng)域。在一項(xiàng)對(duì)陰莖癌患者組織免疫組化標(biāo)志物的研究中，HPV陽性患者的CD8+T細(xì)胞水平明顯高于HPV陰性患者，表示HPV對(duì)陰莖癌的TME有顯著影響[16]。此外，Lyford等[30]報(bào)道，70%的HPV相關(guān)頭頸部鱗癌在腫瘤細(xì)胞和CD68+TAMs上均表現(xiàn)為免疫抑制分子PD-L1陽性表達(dá)，提示在這些患者中使用免疫檢查點(diǎn)抑制劑可能獲益。Lohneis等[31]進(jìn)行的一項(xiàng)薈萃分析顯示，HPV陽性的陰莖癌患者的腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞的平均數(shù)量高于HPV陰性的陰莖癌患者，基質(zhì)T淋巴細(xì)胞明顯少于HPV陰性患者。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)HPV陽性的陰莖癌患者中有更多的腫瘤浸潤(rùn)Treg，這可能代表了一種免疫逃避機(jī)制，并解釋了T細(xì)胞無法清除腫瘤的原因。

由于陰莖癌患者較少，免疫相關(guān)研究目前報(bào)道較少。有限的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)表明，HPV陽性陰莖癌患者的TME不同于HPV陰性患者，推測(cè)免疫抑制劑可能在兩個(gè)群體中存在治療療效的差異。

四、免疫治療相關(guān)的個(gè)案報(bào)道

Hahn等[32]報(bào)道了3例應(yīng)用pembrolizumab抑制劑治療轉(zhuǎn)移性陰莖癌，皆為經(jīng)歷一線化療及手術(shù)治療失敗的患者，疾病進(jìn)展后對(duì)患者施行免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療。A患者接受了6個(gè)周期的pembrolizumab治療后，腫瘤體積縮小了34%；B患者在兩個(gè)周期的pembrolizumab治療后，CT掃描顯示，他的左側(cè)腹股溝淋巴結(jié)增大50%。C患者在接受3個(gè)周期的pembrolizumab治療后，可測(cè)量病灶增加了172%，并出現(xiàn)了多個(gè)新部位的疾病。

Baweja等[33]對(duì)1例晚期的陰莖癌患者使用Ipilimumab聯(lián)合Nivolumab。免疫治療前腫瘤大小約為12.7 cm×13.8 cm×18.3 cm，接受2個(gè)療程免疫治療后，CT結(jié)果顯示僅剩1.2 cm的壞死腫塊，同時(shí)該患者癌癥的相關(guān)不良癥狀逐漸消失。表明對(duì)于PD-1/PD-L1效果不佳的患者，聯(lián)合免疫治療也可能成為新的治療方向。以上結(jié)果表明，PD-1/PD-L1抑制劑在陰莖癌的治療中具有一定的理論基礎(chǔ)及應(yīng)用前景。精準(zhǔn)識(shí)別對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑獲益的人群或生物標(biāo)記物是臨床研究的熱點(diǎn)。

五、目前正在進(jìn)行中的免疫相關(guān)陰莖癌注冊(cè)臨床試驗(yàn)

拉丁美洲腫瘤學(xué)合作組織與默沙東聯(lián)合發(fā)起了一項(xiàng)Ⅱ期臨床試驗(yàn)(NCT04224740)，主要研究晚期陰莖癌患者中以順鉑為基礎(chǔ)的化療聯(lián)合pembrolizumab作為一線全身方案的療效。Dana-Farber癌癥研究所與施貴寶制藥聯(lián)合發(fā)起了一項(xiàng)Nivolumab+Ipilimumab用于晚期罕見泌尿生殖器腫瘤的研究(NCT03333616)。美國國立癌癥研究所與國立衛(wèi)生研究院臨床中心攜手開展了M7824(NCT03427411)治療HPV相關(guān)的惡性腫瘤的臨床研究(M7824是一種新型的雙功能融合蛋白，該蛋白由靶向PD-L1蛋白的IgG1單克隆抗體和TGF-β受體Ⅱ型融合而成)。以上研究目前仍在招募患者中，相信最終研究的結(jié)果能夠改善陰莖癌治療現(xiàn)狀[34]。

國內(nèi)也在陸續(xù)開展免疫治療相關(guān)的臨床試驗(yàn)。北京市朝陽區(qū)桓興腫瘤醫(yī)院開展了陰莖癌化療聯(lián)合免疫治療(PD-L1/PD-1)療效及安全性的單臂前瞻性研究。該研究納入了局部晚期或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移陰莖癌無手術(shù)適應(yīng)癥的患者，采用白蛋白紫杉醇+順鉑+博來霉素全身化療方案聯(lián)合PD-1單抗(替雷利珠單抗注射液)治療，評(píng)估入組患者的客觀緩解率、PFS、總生存期及不良反應(yīng)發(fā)生率。

中山大學(xué)腫瘤防治中心也正在開展一項(xiàng)針對(duì)局部晚期陰莖癌患者新輔助治療的Ⅱ期臨床研究(NCT04475016)，主要方案為TIP化療聯(lián)合特瑞普利單抗和尼妥珠單抗，用于T4/N3陰莖癌患者的新輔助治療的單臂開放標(biāo)簽的研究，目前正處于患者入組階段。主要研究終點(diǎn)為病理完全緩解率，該臨床試驗(yàn)的結(jié)果也值得期待。

六、展望

陰莖癌的免疫微環(huán)境研究可以深入了解陰莖癌轉(zhuǎn)移和發(fā)展的免疫學(xué)規(guī)律，為免疫治療策略制定指明方向。對(duì)于局部晚期的陰莖癌，指南中仍主要推薦手術(shù)及化療作為陰莖癌的治療手段。初步的探索和少量病例治療觀察顯示，免疫檢查點(diǎn)抑制劑在晚期陰莖癌的治療中具有一定的應(yīng)用前景。免疫治療和靶向治療單獨(dú)或聯(lián)合用于轉(zhuǎn)移性陰莖癌的多項(xiàng)注冊(cè)臨床研究正在進(jìn)行中。通過外顯子組測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及病理學(xué)檢測(cè)等多種方式，為不同特征的患者群體制定個(gè)性化的精準(zhǔn)醫(yī)療，是日后研究的主要方向。